影响结核杆菌PCR结果准确性的因素
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)01-0041-02
自从1989年聚合酶链反应(PCR)应用于结核杆菌检测以来，该技术已广泛应用于结核病的诊断并显示出很多优点;但在临床应用时也遇到了不少问题，如假阳性、假阴性、污染等。如何去除影响结果准确性之因素，是国内外学者普遍关注的问题，现将影响PCR结果准确性的因素做一总结。
1 液化痰液的方法及DNA模板的制备方法
应用PCR法检测痰液中结核分支杆菌时，痰液充分液化除去抑制PCR反应的物质是检测成功与否的关键因素之一，因此选择合适的结核杆菌DNA模板提取纯化方法是非常重要的。
液化痰液的方法是NaOH/枸橼酸钠/N-乙酰-L-半胱氨酸法 [1] 、NaOH/N-乙酰-半胱氨酸法 [2] 、NaOH/ NaH 2 PO 4 法 [3] 和NaOH法 [4] 。其中NaOH法比较经济，且液化效果明显优于NaOH/NaH 2 PO 4 法。
, http://www.100md.com
在进行模板DNA的制备时，使用直接法时DNA不易释放，阳性率低，易造成漏诊;经典的酚-氯仿抽提法中，碱-SDS裂解比酶裂解效果好些，如两种方法联合应用效果更好，此种方法虽能去除大部分PCR抑制物，但在用该方法进行检测存在着操作复杂、费时、污染和模板丢失的可能，因此经典法在临床应用受到限制;离心煮沸法克服了以上两种方法的缺点，且比较简单，这种方法也可用于其它液体标本的检测，有较大发展前景 [5] ;微波裂解法虽比冻融法好些，但两者均不易使结核杆菌胞壁完全破坏，同时也未去除Taq酶抑制因子，故影响了整个实验的灵敏度和特异性;异硫氰酸胍法在提取结核杆菌DNA时，同样不能使结核杆菌充分裂解，实验结果要差些;碱裂解直接煮沸法是临床上较常用的方法，简便价廉，灵敏度高，有人认为用NP40取代SDS或Tritox-X-100-Tween20效果更佳;玻璃粉-硅吸收法、超声法、氯仿直接提取法，提取纯化结核杆菌DNA更适合于结核杆菌基因扩增;微孔板杂交法，尤其是玻璃粉-硅吸附法在国外也是推崇的方法;另外有报道用蔗糖进行梯度离心或氯化铯提取结核杆菌DNA显示较好效果 [6] 。
, 百拇医药
2 提高PCR技术的灵敏度和特异性的因素
肺部有很多疾病能引起结核杆菌PCR假阳性，其中以肺癌为最高 [7] 。
对于在临床上有些靶基因量少和/或杂菌较多的标本，一次PCR常没有产物形成而出现假阴性。此时可采用对标本行二次PCR，从而提高检测的特异性、灵敏度和可信性 [8] 。
根据耐热DNA聚合酶复制特点设计的在95℃30s DNA解链、57℃90s退火和延伸合二为一的改良的二步温控PCR技术，可检测标本中100fg的人型结核杆菌DNA，并放大至肉眼可见的程度，其灵敏度和特异性超过目前所有的检测手段 [9] 。
3 PCR检测结核杆菌DNA的实验条件
PCR检测结核杆菌DNA的实验条件有许多报道，各报道所采用的实验条件差异较大。由于实验条件的不一致，使得这些实验结果无法进行客观、准确、合理、有效的比较和评价，因此对PCR检测结核杆菌DNA的实验条件进行必要的优化，使实验条件规范化、标准化是十分必要的。其中实验条件变化最大的有复性温度、循环次数、标本用量和循环各等温点保持时间选择等，并且这些条件随扩增产物不同有一定差异。
, http://www.100md.com
复性温度与PCR特异性和扩增效果有密切关系:温度高低会影响扩增产物特异性。复性温度高则扩增效率有可能下降，复性温度低则有可能非特异性产物增加，这样会影响检测灵敏度和检测结果真实性，经实验发现复性温度以60℃时扩增产物区带信号最强，同时又无非特异性产物扩增。
变性温度取决于PCR实验中基因DNA解链温度。而解链温度又与G+C与A+T比例有关，达不到变性温度就不能产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。体系中虽然Taq酶能耐高温，但在高温下的半衰期仍有限，在95℃半衰期只有40min，所以高温时间加长对整个实验过程及扩增效 率提高有害无益。只有DNA变性完全就可以迅速降温到复性温度，尽量避免Taq酶失活，根据实验以20s最为理想。
经过正交试验优化的PCR方法检测240bp结核杆菌DNA的MPB64蛋白基因区的实验条件是:处理的标本5μl，扩增条件为首先预变性94℃5min，再按变性94℃20s，复性60℃40s，延伸72℃40s。如此循环35次，末次72℃延伸5min。此实验条件不仅节省了时间，特异性好，而且提高了检测灵敏度，有利于临床推广使用 [10] 。
, 百拇医药
由于PCR的实验条件是多方面综合因素，不同组合对Taq DNA聚合酶等其它因素都有一定影响，从而影响到扩增效率高低。因此在实验过程中尽量避免这些影响PCR结果准确性的因素，力求使实验结果标准化。
参考文献
1 Noordhoek GT，Kaan JA，Mulder S，et al.Routine application of the polymerase chain reaction for detection ofMycobacterium tuberculosis in clinical samples.J Clin Pathol，1995，48(9):810-814.
2 Victor T，Du-Toit R，Van-Helden PD.Purification of sputum samples through sucrose improves detection of mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction.J Clin Microbiol，1992，30(6):1514-1517.
, 百拇医药
3 张吉旺，彭晓，朱俊芳.肺结核患者外周血白细胞中结核分支杆菌DNA的检测.中华医学检验杂志，1996，19(3):173-175.
4 赵锦荣，闫小军.PCR法从痰液中快速检测结核分支杆菌.第四军医大学学报，1999，20(4):307-308.
5 蒋秀琴.改良的标本处理方法对PCR检测结核杆菌的影响.镇江医学院学报，2000，10(3):590.
6 杨正林，杜琼，林桂芳，等.模板DNA制备方法对结核分支杆菌基因扩增微孔板杂交法的影响.West China Medical Journal，2000，15(1):96-97.
7 李本忠.排除PCR检测结核杆菌假阳性的实验探讨.陕西医学检验，2000，15(3):36.
8 陈鑫平，符生苗.二次PCR在临床上的应用.中国优生与遗传杂志，2000，8(6):40.
9 文芳，王镇涛，万均成，等.改良聚合酶链反应快速诊断结核性脑膜炎.基础医学与临床，1999，19(5):464-466.
10 夏先考，汪建国.结核杆菌PCR实验条件的优化.实用预防医学，2000，7(2):146-147.
(收稿日期:2003-08-27)
作者单位:1 300162天津武警医学院微生物学教研室
2天津武警医院儿科
(编辑李 阳), http://www.100md.com(刘丽英)
自从1989年聚合酶链反应(PCR)应用于结核杆菌检测以来，该技术已广泛应用于结核病的诊断并显示出很多优点;但在临床应用时也遇到了不少问题，如假阳性、假阴性、污染等。如何去除影响结果准确性之因素，是国内外学者普遍关注的问题，现将影响PCR结果准确性的因素做一总结。
1 液化痰液的方法及DNA模板的制备方法
应用PCR法检测痰液中结核分支杆菌时，痰液充分液化除去抑制PCR反应的物质是检测成功与否的关键因素之一，因此选择合适的结核杆菌DNA模板提取纯化方法是非常重要的。
液化痰液的方法是NaOH/枸橼酸钠/N-乙酰-L-半胱氨酸法 [1] 、NaOH/N-乙酰-半胱氨酸法 [2] 、NaOH/ NaH 2 PO 4 法 [3] 和NaOH法 [4] 。其中NaOH法比较经济，且液化效果明显优于NaOH/NaH 2 PO 4 法。
, http://www.100md.com
在进行模板DNA的制备时，使用直接法时DNA不易释放，阳性率低，易造成漏诊;经典的酚-氯仿抽提法中，碱-SDS裂解比酶裂解效果好些，如两种方法联合应用效果更好，此种方法虽能去除大部分PCR抑制物，但在用该方法进行检测存在着操作复杂、费时、污染和模板丢失的可能，因此经典法在临床应用受到限制;离心煮沸法克服了以上两种方法的缺点，且比较简单，这种方法也可用于其它液体标本的检测，有较大发展前景 [5] ;微波裂解法虽比冻融法好些，但两者均不易使结核杆菌胞壁完全破坏，同时也未去除Taq酶抑制因子，故影响了整个实验的灵敏度和特异性;异硫氰酸胍法在提取结核杆菌DNA时，同样不能使结核杆菌充分裂解，实验结果要差些;碱裂解直接煮沸法是临床上较常用的方法，简便价廉，灵敏度高，有人认为用NP40取代SDS或Tritox-X-100-Tween20效果更佳;玻璃粉-硅吸收法、超声法、氯仿直接提取法，提取纯化结核杆菌DNA更适合于结核杆菌基因扩增;微孔板杂交法，尤其是玻璃粉-硅吸附法在国外也是推崇的方法;另外有报道用蔗糖进行梯度离心或氯化铯提取结核杆菌DNA显示较好效果 [6] 。
, 百拇医药
2 提高PCR技术的灵敏度和特异性的因素
肺部有很多疾病能引起结核杆菌PCR假阳性，其中以肺癌为最高 [7] 。
对于在临床上有些靶基因量少和/或杂菌较多的标本，一次PCR常没有产物形成而出现假阴性。此时可采用对标本行二次PCR，从而提高检测的特异性、灵敏度和可信性 [8] 。
根据耐热DNA聚合酶复制特点设计的在95℃30s DNA解链、57℃90s退火和延伸合二为一的改良的二步温控PCR技术，可检测标本中100fg的人型结核杆菌DNA，并放大至肉眼可见的程度，其灵敏度和特异性超过目前所有的检测手段 [9] 。
3 PCR检测结核杆菌DNA的实验条件
PCR检测结核杆菌DNA的实验条件有许多报道，各报道所采用的实验条件差异较大。由于实验条件的不一致，使得这些实验结果无法进行客观、准确、合理、有效的比较和评价，因此对PCR检测结核杆菌DNA的实验条件进行必要的优化，使实验条件规范化、标准化是十分必要的。其中实验条件变化最大的有复性温度、循环次数、标本用量和循环各等温点保持时间选择等，并且这些条件随扩增产物不同有一定差异。
, http://www.100md.com
复性温度与PCR特异性和扩增效果有密切关系:温度高低会影响扩增产物特异性。复性温度高则扩增效率有可能下降，复性温度低则有可能非特异性产物增加，这样会影响检测灵敏度和检测结果真实性，经实验发现复性温度以60℃时扩增产物区带信号最强，同时又无非特异性产物扩增。
变性温度取决于PCR实验中基因DNA解链温度。而解链温度又与G+C与A+T比例有关，达不到变性温度就不能产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。体系中虽然Taq酶能耐高温，但在高温下的半衰期仍有限，在95℃半衰期只有40min，所以高温时间加长对整个实验过程及扩增效 率提高有害无益。只有DNA变性完全就可以迅速降温到复性温度，尽量避免Taq酶失活，根据实验以20s最为理想。
经过正交试验优化的PCR方法检测240bp结核杆菌DNA的MPB64蛋白基因区的实验条件是:处理的标本5μl，扩增条件为首先预变性94℃5min，再按变性94℃20s，复性60℃40s，延伸72℃40s。如此循环35次，末次72℃延伸5min。此实验条件不仅节省了时间，特异性好，而且提高了检测灵敏度，有利于临床推广使用 [10] 。
, 百拇医药
由于PCR的实验条件是多方面综合因素，不同组合对Taq DNA聚合酶等其它因素都有一定影响，从而影响到扩增效率高低。因此在实验过程中尽量避免这些影响PCR结果准确性的因素，力求使实验结果标准化。
参考文献
1 Noordhoek GT，Kaan JA，Mulder S，et al.Routine application of the polymerase chain reaction for detection ofMycobacterium tuberculosis in clinical samples.J Clin Pathol，1995，48(9):810-814.
2 Victor T，Du-Toit R，Van-Helden PD.Purification of sputum samples through sucrose improves detection of mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction.J Clin Microbiol，1992，30(6):1514-1517.
, 百拇医药
3 张吉旺，彭晓，朱俊芳.肺结核患者外周血白细胞中结核分支杆菌DNA的检测.中华医学检验杂志，1996，19(3):173-175.
4 赵锦荣，闫小军.PCR法从痰液中快速检测结核分支杆菌.第四军医大学学报，1999，20(4):307-308.
5 蒋秀琴.改良的标本处理方法对PCR检测结核杆菌的影响.镇江医学院学报，2000，10(3):590.
6 杨正林，杜琼，林桂芳，等.模板DNA制备方法对结核分支杆菌基因扩增微孔板杂交法的影响.West China Medical Journal，2000，15(1):96-97.
7 李本忠.排除PCR检测结核杆菌假阳性的实验探讨.陕西医学检验，2000，15(3):36.
8 陈鑫平，符生苗.二次PCR在临床上的应用.中国优生与遗传杂志，2000，8(6):40.
9 文芳，王镇涛，万均成，等.改良聚合酶链反应快速诊断结核性脑膜炎.基础医学与临床，1999，19(5):464-466.
10 夏先考，汪建国.结核杆菌PCR实验条件的优化.实用预防医学，2000，7(2):146-147.
(收稿日期:2003-08-27)
作者单位:1 300162天津武警医学院微生物学教研室
2天津武警医院儿科
(编辑李 阳), http://www.100md.com(刘丽英)