p53基因点突变与急性粒细胞白血病的关系
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中华中西医杂志 2003年7月 第4卷 第14期
【摘要】 目的 探讨p53基因点突变与急性粒细胞白血病的关系。方法 用银染PCR-SSCP方法检测23例急性粒细胞白血病p53基因第5、6、7、8外显子的点突变。结果 有2例发生p53基因突变，此2例临床观察对化疗不敏感。结论 p53基因点突变之检测对指导临床治疗及判断预后有一定价值。
关键词 急性粒细胞白血病 p53基因 多聚酶链反应
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)14-2094-02
Mutation of the p53in human acute granulocytic leukemia
Ruan Libing，Fan Hong，Wang Shaoting
Department of Hematology，Zhengzhou Railway Central Hospital，Zhengzhou450052.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To explore the relation between mutation of the p53and human acute granulocytic leukemia.Methods We examined for mutation of p53gene from23patients with acute granulocytic leukemia by silˉver staining PCR-SSCP.Results Mutation of p53in exon5，6，7，8was found in2of23patients with acute leukemia.Clinical observation of two patients with mutation of p53gene showed a poor responses to chemical therapy.Conclusion We conclude that mutation of p53should be the prognostic factor for survival and predicion of leukemia patients.
, 百拇医药
Key words acute granulocytic leukemia p53gene polymerase chain reaction
急性粒细胞白血病是起源于造血系统干细胞的克隆性恶性疾病。p53基因是公认的抑癌基因，它通过多种途径抑制细胞从G 0 /G 1 期到S期的转化和诱导细胞凋亡，从而调节细胞增殖，抑制肿瘤发生。笔者应用银染PCR-SSCP技术对23例急性粒细胞白血病p53基因点突变情况进行了检测。
1 材料与方法
1.1 病例选择 23例急性粒细胞白血病患者为1998～2000年在郑州铁路局中心医院和河南医科大学第一附属医院血液科住院患者，本组病例均按《血液病诊断及疗效标准》 [1] 进行诊断。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 DNA提取 采集骨髓样本后，取400μl抗凝全血加1ml dd H 2 O，8000rpm离心3min，反复数次直到沉淀变白，加50μl DNA提取液，2μl蛋白酶K，混匀，55℃水浴1h，100℃沸水浴15min，加150μl TE、100μl平衡苯酚、100μl氯仿，剧烈摇荡，10000rpm离心10min，取上清，加200μl氯仿，剧烈摇荡，10000rpm离心10min，取上清，加入30μl3MNaAc，加入500μl-20℃预冷的无水乙醇，-20℃放置10min，13000rpm离心10min，弃上清，加50μl TE溶解沉淀，取上清扩散。
1.2.2 PCR扩增 用上海复星实业有限公司之p53基因PCR-SSCP扩增试剂盒，对p53抑癌基因的第5、6、7、8外显子特异性片段进行扩增，每个反应管中取反应液15.5μl，Taq酶1μl，另加标本处理后上清液3.5μl，5000rpm离心2s后，置DNA热循环仪上，按如下程序扩增:首次变性94℃5min，然后94℃45s，56℃45s，72℃1min，重复35个循环，最 ˇ 基金项目:本文课题受郑州铁路局科委基金资助 后72℃延伸5min，扩增完毕后，取出反应管，进行产物突变分析。
, 百拇医药
1.2.3 产物分析 取PCR反应产物5μl加15μl变性上样缓冲液，95℃变性5min，立即置冰水浴中5～10min，制备10%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺为37.5∶1)，在点样孔依次加入处理好的产物10μl，在4℃条件下，100V电泳约2h至二甲苯氰指示剂靠近凝胶底部。
1.2.4 银染 银染盘中加入约200ml固定液，将凝胶小心剥离至盘中，在摇床上来回轻轻摇荡30～60min，ddH 2 O洗凝胶3次。加200ml预先置于室温平衡的染色液，在摇床上摇荡染色30min，再加ddH 2 O漂洗不超过10s，再取200ml4℃预冷的显色液，轻轻摇荡直至清晰核酸条带，再将凝胶置于固定液中，固定几分钟后放入清水漂洗。
2 结果
在23例急性粒细胞白血病中，有2例发生p53基因点突变，分别在外显子7和外显子8，此2例患者化疗后未缓解。
, 百拇医药
3 讨论
PCR-SSCP技术是近年来发展的又一DNA分析技术 [2] ，具有操作简便、快速、灵敏度高，可检出单个碱基变异的优点。抑癌基因p53是目前研究恶性肿瘤的热点，大量证据表明:p53基因失活在许多实体瘤中起着重要作用。但p53基因是否参与白血病的演化尚无定论，有关这方面的研究众说纷纭。我们的研究提示，p53基因改变可能参与了部分白血病的演化。本组病例检测之突变率在9%，此与以往报道相似 [3] 。23例急性粒细胞白血病中有2例发生p53基因点突变，我们的结果发现急性粒细胞白血病中p53基因突变发生在外显子7～8。这种改变可能是肿瘤发生的结果，由于癌细胞无限增殖，在DNA复制、细胞有丝分裂过程中引起染色体易位、重排，从而引起p53基因改变，使其对癌细胞的抑制作用减弱或消失，在突变的2例病人，出现对化疗不敏感现象，说明p53基因发生突变者对临床中化疗药物治疗效果差。
参考文献
, 百拇医药
1 张之南.血液病诊断及疗效标准.第二版.北京:科学出版社， 1998，33-39.
2 Orita M，Suzuki Y，Sekiya T，et al.Rapid and sensitive detection of point mutation and DNA polymorphism using the polymerase chain reaction.Genetics，1989，5:874.
3 Jachs L.Control of programmed cell death in normal and leukemia cells;new implication for therapy.Blood，1993，82:15.
作者单位:450052河南郑州铁路局中心医院
(编辑李 阳), 百拇医药(阮励冰 范 红 王少亭)
关键词 急性粒细胞白血病 p53基因 多聚酶链反应
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)14-2094-02
Mutation of the p53in human acute granulocytic leukemia
Ruan Libing，Fan Hong，Wang Shaoting
Department of Hematology，Zhengzhou Railway Central Hospital，Zhengzhou450052.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To explore the relation between mutation of the p53and human acute granulocytic leukemia.Methods We examined for mutation of p53gene from23patients with acute granulocytic leukemia by silˉver staining PCR-SSCP.Results Mutation of p53in exon5，6，7，8was found in2of23patients with acute leukemia.Clinical observation of two patients with mutation of p53gene showed a poor responses to chemical therapy.Conclusion We conclude that mutation of p53should be the prognostic factor for survival and predicion of leukemia patients.
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Key words acute granulocytic leukemia p53gene polymerase chain reaction
急性粒细胞白血病是起源于造血系统干细胞的克隆性恶性疾病。p53基因是公认的抑癌基因，它通过多种途径抑制细胞从G 0 /G 1 期到S期的转化和诱导细胞凋亡，从而调节细胞增殖，抑制肿瘤发生。笔者应用银染PCR-SSCP技术对23例急性粒细胞白血病p53基因点突变情况进行了检测。
1 材料与方法
1.1 病例选择 23例急性粒细胞白血病患者为1998～2000年在郑州铁路局中心医院和河南医科大学第一附属医院血液科住院患者，本组病例均按《血液病诊断及疗效标准》 [1] 进行诊断。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 DNA提取 采集骨髓样本后，取400μl抗凝全血加1ml dd H 2 O，8000rpm离心3min，反复数次直到沉淀变白，加50μl DNA提取液，2μl蛋白酶K，混匀，55℃水浴1h，100℃沸水浴15min，加150μl TE、100μl平衡苯酚、100μl氯仿，剧烈摇荡，10000rpm离心10min，取上清，加200μl氯仿，剧烈摇荡，10000rpm离心10min，取上清，加入30μl3MNaAc，加入500μl-20℃预冷的无水乙醇，-20℃放置10min，13000rpm离心10min，弃上清，加50μl TE溶解沉淀，取上清扩散。
1.2.2 PCR扩增 用上海复星实业有限公司之p53基因PCR-SSCP扩增试剂盒，对p53抑癌基因的第5、6、7、8外显子特异性片段进行扩增，每个反应管中取反应液15.5μl，Taq酶1μl，另加标本处理后上清液3.5μl，5000rpm离心2s后，置DNA热循环仪上，按如下程序扩增:首次变性94℃5min，然后94℃45s，56℃45s，72℃1min，重复35个循环，最 ˇ 基金项目:本文课题受郑州铁路局科委基金资助 后72℃延伸5min，扩增完毕后，取出反应管，进行产物突变分析。
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1.2.3 产物分析 取PCR反应产物5μl加15μl变性上样缓冲液，95℃变性5min，立即置冰水浴中5～10min，制备10%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺为37.5∶1)，在点样孔依次加入处理好的产物10μl，在4℃条件下，100V电泳约2h至二甲苯氰指示剂靠近凝胶底部。
1.2.4 银染 银染盘中加入约200ml固定液，将凝胶小心剥离至盘中，在摇床上来回轻轻摇荡30～60min，ddH 2 O洗凝胶3次。加200ml预先置于室温平衡的染色液，在摇床上摇荡染色30min，再加ddH 2 O漂洗不超过10s，再取200ml4℃预冷的显色液，轻轻摇荡直至清晰核酸条带，再将凝胶置于固定液中，固定几分钟后放入清水漂洗。
2 结果
在23例急性粒细胞白血病中，有2例发生p53基因点突变，分别在外显子7和外显子8，此2例患者化疗后未缓解。
, 百拇医药
3 讨论
PCR-SSCP技术是近年来发展的又一DNA分析技术 [2] ，具有操作简便、快速、灵敏度高，可检出单个碱基变异的优点。抑癌基因p53是目前研究恶性肿瘤的热点，大量证据表明:p53基因失活在许多实体瘤中起着重要作用。但p53基因是否参与白血病的演化尚无定论，有关这方面的研究众说纷纭。我们的研究提示，p53基因改变可能参与了部分白血病的演化。本组病例检测之突变率在9%，此与以往报道相似 [3] 。23例急性粒细胞白血病中有2例发生p53基因点突变，我们的结果发现急性粒细胞白血病中p53基因突变发生在外显子7～8。这种改变可能是肿瘤发生的结果，由于癌细胞无限增殖，在DNA复制、细胞有丝分裂过程中引起染色体易位、重排，从而引起p53基因改变，使其对癌细胞的抑制作用减弱或消失，在突变的2例病人，出现对化疗不敏感现象，说明p53基因发生突变者对临床中化疗药物治疗效果差。
参考文献
, 百拇医药
1 张之南.血液病诊断及疗效标准.第二版.北京:科学出版社， 1998，33-39.
2 Orita M，Suzuki Y，Sekiya T，et al.Rapid and sensitive detection of point mutation and DNA polymorphism using the polymerase chain reaction.Genetics，1989，5:874.
3 Jachs L.Control of programmed cell death in normal and leukemia cells;new implication for therapy.Blood，1993，82:15.
作者单位:450052河南郑州铁路局中心医院
(编辑李 阳), 百拇医药(阮励冰 范 红 王少亭)