480株念珠菌分型及体外药敏试验分析
【摘要】 目的 检测性传播疾病(STD)病人念珠菌菌型及药物敏感性。方法 分别采用念珠菌显色培养基和K-B纸片扩散法进行念珠菌分型及药敏实验。结果 948份标本经念珠菌显色培养基分离鉴定出各菌型念珠菌480例。结论 念珠菌显色培养基可用于快速鉴定念珠菌的菌型;不同型念珠菌的药敏谱存在差异。
关键词 显色培养基 念珠菌 药敏实验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)01-0005-02
Detection of bacterial types and antibiotic susceptivity for
480strains of candida from STD patients
Li Yongxin，Mo Jiankun，Wen Ju，et al.
, 百拇医药
The Guangdong Provincial177Hospital，Guangzhou510310.
【Abstract】 Objective To determine the bacterial types and antibiotic susceptivity of Candida from STD paˉtients.Methods Candida color medium and Kirby-Bauer Paper flakes diffusion method was be used to do typing and drug sensitivity test of Candida，respectively.Results 480strains of Candida was detected from948STD paˉtients，including365strains of Candida albicans，47strains of Candida Tropicalis，30strains of Candida Krusei，14strains of Candida Glabrata，24strainsof mixed infection Candida，were separated and identified from948cases of samples.Conclusion Candida Color medium can be used to identify bacterial types of Candida rapidly;There are difˉferences of antibiotic sensitivity spectrum betweenall kinds types of Candida.
, 百拇医药
Key words color medium candida drug sensitivity test
念珠菌是条件致病性真菌，一般健康者可携带但无临床症状。在某些情况下，如机体抵抗力降低，可导致机体菌群失调引起念珠菌大量繁殖而致病。近年来，随着免疫抑制剂、激素、广谱抗生素的广泛使用，器官移植、骨髓移植等技术应用增多，以及恶性肿瘤发病率的增多，念珠菌的感染率逐年呈上升趋势 [1～3] ，随着抗真菌药物的大量应用，念珠菌耐药株日益增多，且不同菌型的念珠菌对常用抗真菌药物的敏感性存在差异和发生了改变。因此，有必要对临床分离的念珠菌做菌型分型和药物敏感性分析，以期为临床更有效、合理地使用抗真菌药提供依据。我们采用科玛嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基 [4] 培养、分离948例STD病人标本中的念珠菌，鉴定菌型、采用K-B纸片法测定了不同菌型念珠菌对常用抗真菌药物的敏感性。现报道如下。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 病例资料 948例男性念珠菌性龟头炎和女性阴道念珠菌病患者，均来自我院1999年3月～2002年4月STD门诊就诊的病人。其中，男332例，女616例，年龄16～67岁。男性患者均有不同程度的龟头刺痒、出现散在小丘疹或表现潮红现象，部分病例尿道灼痒或尿频、尿急症状;女性病人主诉多为外阴瘙痒、灼痛，白带增多并呈凝块状(豆腐渣样)，局部潮红，尿频、尿急等。所有病例均为首诊病人且均未曾使用过任何抗真菌药物治疗。
1.2 标本留取 男性病人刮取龟头或冠状沟处皮损表面的鳞屑，女性病人用消毒棉签取阴道壁或宫颈分泌物，作为待检标本。
1.3 试剂来源 科玛嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基、HR培养基、胰蛋白胨大豆肉汤购自乐通泰生物科技有限公司;制霉菌素(NYS)、酮康唑(KET)购自Sigma公司，氟康唑(FLU)系海南曼克星制药公司产品。
1.4 念珠菌分离培养 将分泌物的拭子在念珠菌显色平板上画线接种，37℃温箱培养16～24h，观察结果 [4，5] 。
, 百拇医药
1.5 念珠菌分型 [6] 根据念珠菌生长菌落在显色培养基上的颜色进行分型鉴定:绿色为白色念珠菌(Candida albiˉcans，CA);灰蓝色为热带念珠菌(Candida Tropicalis，CT);粉红色为克柔氏念珠菌(Candida Krusei，CK);紫色为光滑念珠菌(Candida Glabrata，CG);白色为其他念珠菌(mixed infection Candida，MIC)。
1.6 药敏纸片制备 制霉菌素、酮康唑、氟康唑用二甲基甲酰胺溶解制备储存液，使用时稀释到工作浓度。将直径为6.35mm的灭菌标准空白滤纸圆片浸泡于抗生素液中，使纸片的含药量分别为:制霉菌素100IU、酮康唑15μg、氟康唑10μg。将纸片冷冻干燥后低温储存备用。
1.7 药敏试验 在念珠菌显色平板上挑取4～5个菌落置于含胰蛋白胨大豆肉汤试管中，对照麦氏标准比浊管调整菌液浓度为1.5×10 8 CFU/ml。用无菌棉拭子沾菌液按三个方向均匀涂布于HR培养平板上，室温静置3～5min。用无菌镊子将含药纸片紧贴于含菌琼脂表面(注意纸片之间的距离应超过24mm，与培养皿边缘距离为15mm)，贴纸片平板在室温放置15min后转入37℃温箱培养16～24h，测量抑菌环直径毫米数，判读结果。
, 百拇医药
1.8 药物敏感性判定标准 制霉菌素:敏感(Susceptibility，S)≥15mm、中度敏感(mid-susceptibility，MS)10～14mm、耐药(Resistance，R)≤9mm;酮康唑、氟康唑:敏感≥20mm、中度敏感12～19mm、耐药≤11mm。
2 结果
2.1 念珠菌培养结果 948份标本经念珠菌显色培养基分离鉴定出念珠菌480株，念珠菌阳性总检出率为50.63%(480/948)。其中，白色念珠菌365株，占念珠菌阳性检出率的76.04%(365/480)，热带念珠菌47株，占念珠菌阳性检 出率的9.79%(47/480)，克柔氏念珠菌30株，占念珠菌阳性检出率的6.25%(30/480)，光滑念珠菌14株，占念珠菌阳性检出率的2.91%(14/480)，混合感染念珠菌(mixed inˉfection Candida)24株，占念珠菌阳性检出率的5.00%(924/480)。
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2.2 常用抗真菌药敏试验 制霉菌素、酮康唑、氟康唑对480株不同菌型念珠菌物敏试验结果见表1。表1 三种抗真菌药物对480株不同菌型念珠菌药敏试验结果 (株)
从表1可以看出不同型念珠菌对常用抗真菌药物制霉菌素、酮康唑、氟康唑的药物敏感性依次为:(1)白色念珠菌:92.60%(338/365)、93.42%(341/365)、95.62%(349/365)。(2)热带念珠菌:93.61%(44/47)、42.55%(20/47)、31.91%(15/47)。(3)克柔氏念珠菌:93.33%(28/30)、83.33%(25/30)、13.33%(4/30)。(4)光滑念珠菌:92.85%(13/14)、57.14%(8/14)、50.00%(7/14)。(5)混合感染念珠菌:41.66%(10/24)、41.66%(10/24)、20.83%(5/24)。
3 讨论
念珠菌的分离培养、鉴定通常采用沙保罗琼脂培养基增菌、纯化，通过细菌形态学观察、生化反应、血清学实验等步骤来综合分析鉴定细菌的种群。该方法经典，可鉴定的细菌种类较多;缺点是操作烦琐，实验时间长。法国梅里埃公司生产的Vitek32-YBC细菌鉴定卡是一种很好的方法，但设备及试剂价格昂贵，操作时间也很长，无法提供快速鉴定结果。科玛嘉显色培养基鉴定念珠菌的菌型，具有操作简便、快速、准确的特点，并且可以鉴定念珠菌感染的混合菌型;其次是培养试剂价格适中，便于临床推广应用。
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我们采用科玛嘉显色培养基分离、鉴定了480株念珠菌，其菌型分布为:白色念珠菌365株，占念珠菌阳性检出率的76.04%(365/480)，热带念珠菌47株，占念珠菌阳性检出率的9.79%(47/480)，克柔氏念珠菌30株，占念珠菌阳性检出率的6.25%(30/480)，光滑念珠菌14株，占念珠菌阳性检出率的2.91%(14/480)，混合感染念珠菌24株，占念珠菌阳性检出率的5.0%(924/480);其中，白色念珠菌是主要的优势菌株，与文献报道 [2～4] 相似。针对白色念珠菌病的治疗，由于氟康唑仅对白色念珠菌敏感，对其他型念珠菌的敏感性较差，因此，临床药物首选氟康唑;在使用氟康唑后，原来不属于优势菌株的念珠菌如:对氟康唑不敏感的热带念珠菌和对氟康唑天然耐药的克柔氏念珠菌等逐渐成为优势菌群，而这些菌群均具致病性，正是由于氟康唑的抗菌特点，使念珠菌的菌型构成比发生了变化，本文研究显示:热带念珠菌、克柔氏念珠菌分别占念珠菌阳性检出率的9.79%和6.25%，也证明各菌群的优势的确正在发生变化。而念珠菌群的变化对疾病的转归和抗生素的选择有重要影响。因此，有必要动态监测念珠菌菌群的变化，及时调整治疗方案，合理选择药物，以提高临床疗效。
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目前，念珠菌的药敏实验方法主要有:琼脂稀释法、液 体稀释法和扩散法。琼脂稀释法和液体稀释法主要测定最低抑菌浓度(MIC)，该方法准确度高，但操作复杂、费时，不宜处理大批量标本。扩散法包括Etest和纸片扩散法，主要通过测定细菌的抑菌环判断药物敏感性:Etest法(可直接测定抑菌浓度)实验干扰因素多，对操作者的实验水平要求较高，同时试剂较昂贵，难以临床广泛推广;纸片法具有操作简单，易观察结果、快速的优势，适合大批量标本检测工作。我们采用纸片扩散法测定480株不同菌型的念珠菌对常用三种抗真菌药物的敏感性，研究结果表明:(1)制霉菌素对培养分离出480株4种菌型的念珠菌均有较强的抗菌效果，白色念珠菌:92.60%(338/365);热带念珠菌:93.61%(44/47);克柔氏念珠菌:93.33%(28/30);光滑念珠菌:92.85%(13/14);对混合感染念珠菌抗菌效果稍差:41.66%(10/24)。(2)三种药物对白色念珠菌均显示良好的抗菌效果，药物的敏感性分别是:制霉菌素92.60%(338/365);酮康唑93.42%(341/365)、氟康唑95.62%(349/365);制霉菌素口服不吸收，只能局部应用，酮康唑的毒副作用明显，而氟康唑生物利用度高，半衰期长，服药方便，且几乎没有毒副作用，因此，临床白色念珠菌感染的治疗首选氟康唑。(3)热带念珠菌、光滑念珠菌和混合感染念珠菌对酮康唑和氟康唑的敏感性较差。(4)大多数克柔氏念珠菌对氟康唑呈现耐药。(5)临床抗真菌药物治疗应根据药敏实验结果合理选择抗生素，以实现药物选择个体化，临床疗效最佳化，最大限度防止耐药菌株出现。
, 百拇医药
参考文献
1 周惠平.临床细菌检验面临的挑战.中华医学检验杂志，1999，22(1):12.
2 王慧，苏丹虹，易建云，等.临床标本中108株念珠菌的分离鉴定结果及药敏分析.广东医学，1999，20(12):967.
3 周贵民，谢灵.ATB FUNGUS在酵母菌药敏测定中的应用及临床意义.中华医学检验杂志，1994，17(2):99.
4 祝建军，梁慧军，宋秀兰，等.科玛嘉念珠菌显色培养基在快速检测念珠菌的应用.上海医学检验杂志，2001，16(5):303.
5 中华人民共和国卫生部医政司编.全国临床检验操作规程，南京:东南大学出版社，1997，449.
6 许宏涛，张秀珍.科玛嘉念珠菌显色培养基的应用.中华检验医学杂志，2000，23(5):298
收稿日期:2003-08-19)
作者单位:510310广东省一七七医院
(编辑黄 杰), http://www.100md.com(黎永新 莫建坤 温 炬 张 智 张 珍)
关键词 显色培养基 念珠菌 药敏实验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)01-0005-02
Detection of bacterial types and antibiotic susceptivity for
480strains of candida from STD patients
Li Yongxin，Mo Jiankun，Wen Ju，et al.
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The Guangdong Provincial177Hospital，Guangzhou510310.
【Abstract】 Objective To determine the bacterial types and antibiotic susceptivity of Candida from STD paˉtients.Methods Candida color medium and Kirby-Bauer Paper flakes diffusion method was be used to do typing and drug sensitivity test of Candida，respectively.Results 480strains of Candida was detected from948STD paˉtients，including365strains of Candida albicans，47strains of Candida Tropicalis，30strains of Candida Krusei，14strains of Candida Glabrata，24strainsof mixed infection Candida，were separated and identified from948cases of samples.Conclusion Candida Color medium can be used to identify bacterial types of Candida rapidly;There are difˉferences of antibiotic sensitivity spectrum betweenall kinds types of Candida.
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Key words color medium candida drug sensitivity test
念珠菌是条件致病性真菌，一般健康者可携带但无临床症状。在某些情况下，如机体抵抗力降低，可导致机体菌群失调引起念珠菌大量繁殖而致病。近年来，随着免疫抑制剂、激素、广谱抗生素的广泛使用，器官移植、骨髓移植等技术应用增多，以及恶性肿瘤发病率的增多，念珠菌的感染率逐年呈上升趋势 [1～3] ，随着抗真菌药物的大量应用，念珠菌耐药株日益增多，且不同菌型的念珠菌对常用抗真菌药物的敏感性存在差异和发生了改变。因此，有必要对临床分离的念珠菌做菌型分型和药物敏感性分析，以期为临床更有效、合理地使用抗真菌药提供依据。我们采用科玛嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基 [4] 培养、分离948例STD病人标本中的念珠菌，鉴定菌型、采用K-B纸片法测定了不同菌型念珠菌对常用抗真菌药物的敏感性。现报道如下。
1 材料和方法
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1.1 病例资料 948例男性念珠菌性龟头炎和女性阴道念珠菌病患者，均来自我院1999年3月～2002年4月STD门诊就诊的病人。其中，男332例，女616例，年龄16～67岁。男性患者均有不同程度的龟头刺痒、出现散在小丘疹或表现潮红现象，部分病例尿道灼痒或尿频、尿急症状;女性病人主诉多为外阴瘙痒、灼痛，白带增多并呈凝块状(豆腐渣样)，局部潮红，尿频、尿急等。所有病例均为首诊病人且均未曾使用过任何抗真菌药物治疗。
1.2 标本留取 男性病人刮取龟头或冠状沟处皮损表面的鳞屑，女性病人用消毒棉签取阴道壁或宫颈分泌物，作为待检标本。
1.3 试剂来源 科玛嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基、HR培养基、胰蛋白胨大豆肉汤购自乐通泰生物科技有限公司;制霉菌素(NYS)、酮康唑(KET)购自Sigma公司，氟康唑(FLU)系海南曼克星制药公司产品。
1.4 念珠菌分离培养 将分泌物的拭子在念珠菌显色平板上画线接种，37℃温箱培养16～24h，观察结果 [4，5] 。
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1.5 念珠菌分型 [6] 根据念珠菌生长菌落在显色培养基上的颜色进行分型鉴定:绿色为白色念珠菌(Candida albiˉcans，CA);灰蓝色为热带念珠菌(Candida Tropicalis，CT);粉红色为克柔氏念珠菌(Candida Krusei，CK);紫色为光滑念珠菌(Candida Glabrata，CG);白色为其他念珠菌(mixed infection Candida，MIC)。
1.6 药敏纸片制备 制霉菌素、酮康唑、氟康唑用二甲基甲酰胺溶解制备储存液，使用时稀释到工作浓度。将直径为6.35mm的灭菌标准空白滤纸圆片浸泡于抗生素液中，使纸片的含药量分别为:制霉菌素100IU、酮康唑15μg、氟康唑10μg。将纸片冷冻干燥后低温储存备用。
1.7 药敏试验 在念珠菌显色平板上挑取4～5个菌落置于含胰蛋白胨大豆肉汤试管中，对照麦氏标准比浊管调整菌液浓度为1.5×10 8 CFU/ml。用无菌棉拭子沾菌液按三个方向均匀涂布于HR培养平板上，室温静置3～5min。用无菌镊子将含药纸片紧贴于含菌琼脂表面(注意纸片之间的距离应超过24mm，与培养皿边缘距离为15mm)，贴纸片平板在室温放置15min后转入37℃温箱培养16～24h，测量抑菌环直径毫米数，判读结果。
, 百拇医药
1.8 药物敏感性判定标准 制霉菌素:敏感(Susceptibility，S)≥15mm、中度敏感(mid-susceptibility，MS)10～14mm、耐药(Resistance，R)≤9mm;酮康唑、氟康唑:敏感≥20mm、中度敏感12～19mm、耐药≤11mm。
2 结果
2.1 念珠菌培养结果 948份标本经念珠菌显色培养基分离鉴定出念珠菌480株，念珠菌阳性总检出率为50.63%(480/948)。其中，白色念珠菌365株，占念珠菌阳性检出率的76.04%(365/480)，热带念珠菌47株，占念珠菌阳性检 出率的9.79%(47/480)，克柔氏念珠菌30株，占念珠菌阳性检出率的6.25%(30/480)，光滑念珠菌14株，占念珠菌阳性检出率的2.91%(14/480)，混合感染念珠菌(mixed inˉfection Candida)24株，占念珠菌阳性检出率的5.00%(924/480)。
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2.2 常用抗真菌药敏试验 制霉菌素、酮康唑、氟康唑对480株不同菌型念珠菌物敏试验结果见表1。表1 三种抗真菌药物对480株不同菌型念珠菌药敏试验结果 (株)
从表1可以看出不同型念珠菌对常用抗真菌药物制霉菌素、酮康唑、氟康唑的药物敏感性依次为:(1)白色念珠菌:92.60%(338/365)、93.42%(341/365)、95.62%(349/365)。(2)热带念珠菌:93.61%(44/47)、42.55%(20/47)、31.91%(15/47)。(3)克柔氏念珠菌:93.33%(28/30)、83.33%(25/30)、13.33%(4/30)。(4)光滑念珠菌:92.85%(13/14)、57.14%(8/14)、50.00%(7/14)。(5)混合感染念珠菌:41.66%(10/24)、41.66%(10/24)、20.83%(5/24)。
3 讨论
念珠菌的分离培养、鉴定通常采用沙保罗琼脂培养基增菌、纯化，通过细菌形态学观察、生化反应、血清学实验等步骤来综合分析鉴定细菌的种群。该方法经典，可鉴定的细菌种类较多;缺点是操作烦琐，实验时间长。法国梅里埃公司生产的Vitek32-YBC细菌鉴定卡是一种很好的方法，但设备及试剂价格昂贵，操作时间也很长，无法提供快速鉴定结果。科玛嘉显色培养基鉴定念珠菌的菌型，具有操作简便、快速、准确的特点，并且可以鉴定念珠菌感染的混合菌型;其次是培养试剂价格适中，便于临床推广应用。
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我们采用科玛嘉显色培养基分离、鉴定了480株念珠菌，其菌型分布为:白色念珠菌365株，占念珠菌阳性检出率的76.04%(365/480)，热带念珠菌47株，占念珠菌阳性检出率的9.79%(47/480)，克柔氏念珠菌30株，占念珠菌阳性检出率的6.25%(30/480)，光滑念珠菌14株，占念珠菌阳性检出率的2.91%(14/480)，混合感染念珠菌24株，占念珠菌阳性检出率的5.0%(924/480);其中，白色念珠菌是主要的优势菌株，与文献报道 [2～4] 相似。针对白色念珠菌病的治疗，由于氟康唑仅对白色念珠菌敏感，对其他型念珠菌的敏感性较差，因此，临床药物首选氟康唑;在使用氟康唑后，原来不属于优势菌株的念珠菌如:对氟康唑不敏感的热带念珠菌和对氟康唑天然耐药的克柔氏念珠菌等逐渐成为优势菌群，而这些菌群均具致病性，正是由于氟康唑的抗菌特点，使念珠菌的菌型构成比发生了变化，本文研究显示:热带念珠菌、克柔氏念珠菌分别占念珠菌阳性检出率的9.79%和6.25%，也证明各菌群的优势的确正在发生变化。而念珠菌群的变化对疾病的转归和抗生素的选择有重要影响。因此，有必要动态监测念珠菌菌群的变化，及时调整治疗方案，合理选择药物，以提高临床疗效。
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目前，念珠菌的药敏实验方法主要有:琼脂稀释法、液 体稀释法和扩散法。琼脂稀释法和液体稀释法主要测定最低抑菌浓度(MIC)，该方法准确度高，但操作复杂、费时，不宜处理大批量标本。扩散法包括Etest和纸片扩散法，主要通过测定细菌的抑菌环判断药物敏感性:Etest法(可直接测定抑菌浓度)实验干扰因素多，对操作者的实验水平要求较高，同时试剂较昂贵，难以临床广泛推广;纸片法具有操作简单，易观察结果、快速的优势，适合大批量标本检测工作。我们采用纸片扩散法测定480株不同菌型的念珠菌对常用三种抗真菌药物的敏感性，研究结果表明:(1)制霉菌素对培养分离出480株4种菌型的念珠菌均有较强的抗菌效果，白色念珠菌:92.60%(338/365);热带念珠菌:93.61%(44/47);克柔氏念珠菌:93.33%(28/30);光滑念珠菌:92.85%(13/14);对混合感染念珠菌抗菌效果稍差:41.66%(10/24)。(2)三种药物对白色念珠菌均显示良好的抗菌效果，药物的敏感性分别是:制霉菌素92.60%(338/365);酮康唑93.42%(341/365)、氟康唑95.62%(349/365);制霉菌素口服不吸收，只能局部应用，酮康唑的毒副作用明显，而氟康唑生物利用度高，半衰期长，服药方便，且几乎没有毒副作用，因此，临床白色念珠菌感染的治疗首选氟康唑。(3)热带念珠菌、光滑念珠菌和混合感染念珠菌对酮康唑和氟康唑的敏感性较差。(4)大多数克柔氏念珠菌对氟康唑呈现耐药。(5)临床抗真菌药物治疗应根据药敏实验结果合理选择抗生素，以实现药物选择个体化，临床疗效最佳化，最大限度防止耐药菌株出现。
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参考文献
1 周惠平.临床细菌检验面临的挑战.中华医学检验杂志，1999，22(1):12.
2 王慧，苏丹虹，易建云，等.临床标本中108株念珠菌的分离鉴定结果及药敏分析.广东医学，1999，20(12):967.
3 周贵民，谢灵.ATB FUNGUS在酵母菌药敏测定中的应用及临床意义.中华医学检验杂志，1994，17(2):99.
4 祝建军，梁慧军，宋秀兰，等.科玛嘉念珠菌显色培养基在快速检测念珠菌的应用.上海医学检验杂志，2001，16(5):303.
5 中华人民共和国卫生部医政司编.全国临床检验操作规程，南京:东南大学出版社，1997，449.
6 许宏涛，张秀珍.科玛嘉念珠菌显色培养基的应用.中华检验医学杂志，2000，23(5):298
收稿日期:2003-08-19)
作者单位:510310广东省一七七医院
(编辑黄 杰), http://www.100md.com(黎永新 莫建坤 温 炬 张 智 张 珍)