CD34 + 造血干细胞诱导T细胞免疫耐受
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中华医学实践杂志 2003年11月 第2卷 第11期
【摘要】 目的 观察CD34 + 造血干细胞诱导针对供者特异性T细胞免疫耐受作用。方法 从健康异基因造血干细胞移植供者采集外周血单个核细胞，用联结抗CD34 + 单抗磁珠纯化CD34 + 细胞。从健康供者分离反应淋巴细胞(RLs)，1×10 6 RLS分别与(0、0.25、0.5、1)×10 6 CD34 + 细胞混合培养。刺激细胞来自于CD34 + 细胞同一供者或第三者。混合淋巴细胞反应( 3 H-TdR掺入法)检测T细胞增殖活性。结果 T细胞增殖实验显示:CD34 + 细胞:RLs比例为0.5或更高混合培养的淋巴细胞，对来自于CD34 + 细胞供者的刺激细胞激活作用明显抑制，而对于来自第三者的刺激细胞的激活作用无明显抑制。结论 CD34 + 造血干细胞具有诱导针对供者特异性T细胞免疫耐受的作用。
关键词 CD34 + 造血干细胞 诱导 免疫耐受
, 百拇医药
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)11-0964-02
T cell tolerance induction by CD34 + hematopoietic stem cells
Chen Guoan，Yuan Liya，Pan Shengmei，et al.
Department of Hematology，the Frist Affiliated Hospital of Jiangxi Medical University，Nanchang330006.
【Abstract】 Objective To observe the donor-specific T-cell tolerance induction by CD34 + hematopoietic stem cells.Methods Peripheral blood progenitor cells were collected from healthy related allogeneic donor.CD34 + cells were purified by magnetic cell sorting using magnetic beads liked to anti-CD34 + mAb.Responder lymphocytes(RLs)were collected from healthy donor.RLs(1×10 6 )were cultured with(0，0.25，0.5，1)×10 9 CD34 + cellsreˉspectively.Irradiated stiumlator cells were collected from the CD34 + cell donor or a third party.Tcell proli feration was assayed by mixed lymphocyte reaction(MLR)with 3 H-TdR incorporation.Results MLR results showed that the proliferation of T cells was significantly inhibited to a CD34 + -to-responder cell ratio of0.5or higher by the stimuˉlator cells from the CD34 + donor，but was not suppressed by the stimulator cells from the third party.Conclusion CD34 + hematopoietic stem cells are endowed with potentially inducing donor-specific T-cell tolerance.
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Key words CD34 + hematopoietic stem cells induction tolerance
近年来，人们在异基因造血干细胞移植的实验中观察到，如果先对受者给予供者造血干细胞移植，则可产生受者对供者的免疫耐受。此时，受者接受供者的其他组织器官移植，其排斥反应大大减低。因此，Rachamin等 [1] 提出造血干细胞可能具有诱导免疫耐受的能力。最近的动物实验也证实造血干细胞移植诱导的干细胞嵌合体可使HLA配型不合甚至异种动物产生移植免疫耐受而使器官移植成功。我们从人类造血干细胞供者外周血单个核细胞，经进一步纯化为CD34 + 造血干细胞，在体外成功地诱导出T细胞免疫耐受。
1 材料和方法
1.1 标本 经G-CSF动员的异基因造血干细胞供者，采用CS-3000plus血细胞分离机分离外周血单个核细胞。淋巴细胞取自健康输血员。
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1.2 主要试剂 CD34 + 细胞免疫磁珠分离试剂盒购自德国Miltenyi Biotec公司;淋巴细胞分离液购自中国科学院血液学研究所。
1.3 实验方法
1.3.1 CD34 + 细胞分离纯化 用含0.6%ACD-A的PBS稀释单个核细胞(MNC)，1000rpm离心15min，弃上清液，反复3次。1×10 8 个MNC加CD34 + 造血干细胞免疫磁珠100μl标记细胞，置于4℃30min后用1ml PBS洗涤细胞2次，将标记细胞移入MS型分离柱中，自然滴干，再加入PBS0.5ml，移去套在分离柱的磁铁，插上活栓，用力挤压PBS洗脱分离柱中的CD34 + 细胞。分别收集磁铁移开前后的细胞，其中磁珠移去前的细胞(主要合淋巴细胞)冻存作为刺激细胞(SC)备用。
1.3.2 淋巴细胞分离 取HLA不相同健康人抗凝外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，贴壁法去除巨噬细胞后作为反应细胞(RC)或作为反应淋巴细胞(RLs)。
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1.3.3 CD34 + 细胞与淋巴细胞混合培养 取不同数量的纯化CD34 + 细胞与1×10 6 /L RLs细胞混合培养。培养体系为含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃，5%CO 2 培养箱中培养96h。
1.3.4 混合体淋巴细胞培养(MLR) 复苏与CD34 + 细胞同一供者来源的淋巴细胞，RPMI1640培养基洗涤3次，用含10%胎牛血清的RPMI1640调整细胞浓度1×10 6 /ml， 60 Co照射30Gy作为刺激细胞(SC 1 )。收集与CD34 + 细胞混合培养后的细胞作为反应细胞(RC)。同时取第三供者经 60 Co照射30Gy的外周血单个核细胞作为刺激细胞(SC 2 )。将上述细胞加96孔培养板，每孔加SC 1 或SC 2 5×10 4 /100μl，再向每孔加RC×10 5 /100μl。将培养板置于37℃，5%CO 2 培养箱中培养120h后收集细胞。收集细胞前每孔加入 3 H-TdR7.4kBq。多功能闪烁计数仪测定β放射线活性，以放射性核素每分钟闪烁计数(CPM)值表达。
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2 结果
2.1 CD34 + 细胞诱导的淋巴细胞对同一CD34 + 供者来源SC反应性 我们分别取(0、0.25、0.5、1)×10 6 /L CD34 + 细胞与1×10 6 /L个淋巴细胞混合培养，96h后收集细胞作为RC，刺激细胞(SC 1 )来自于CD34 + 供者，将RC与SC 1 进行混合淋巴细胞反应。结果显示(见表1):与(0.5～1)×10 6 个CD34 + 混合反应诱导的RC对SC 1 的激活有明显的抑制作用(与0组比较P<0.01)，而0.25×10 6 个细胞诱导的RC对SC 1 的激活无明显抑制作用(与0组比较P>0.05)。
2.2 CD34 + 细胞诱导的淋巴细胞对第三者SC 2 的反应性 将不同CD34 + /RLs比值混合培养的淋巴细胞与来自于第三者供者的SC 2 进行混合淋巴细胞反应。结果显示:加入CD34 +组对来自行第三供SC 2 刺激T细胞增殖反应均无明显抑制作用(各组与未加CD34 + 组比较P>0.05)。详见表2。
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表1 CD34 + 细胞诱导的淋巴细胞对同一CD34 + 供者SC 1 的反应性略
3 讨论
T细胞特异性免疫耐受对维持自身免疫稳定和移植免疫耐受起重要作用。目前，对于器官移植等排斥反应的预防主要靠长期使用大剂量的免疫抑制剂，由此而导致严重的副作用(如感染、肿瘤、中毒性肾损害和代谢性紊乱等)。近年来，也有通过应用抗CD4、抗CD8、抗CD154和抗B7分子单克隆抗体诱导T细胞免疫耐受 [2～5] ，但其均为诱导暂时性免疫耐受，作用无特异性，甚至导致受者其他免疫功能低下。因此，寻找一种无明显副作用的诱导特异性免疫耐 受的方法是人们追求的目标。自从Rachamin等提出造血干细胞具有诱导免疫耐受以来，许多学者已证实CD34 + 造血干细胞可以诱导移植免疫耐受 [6，7] ，甚至能使HLA配型不合或者异种动物的器官移植获得成功。本研究采用纯化的CD34 + 造血干细胞，成功地诱导了对来自于CD34 + 造血干细胞供者刺激细胞的免疫耐受，并且耐受具有特异性，因为其对第三者的刺激细胞仍具有良好的免疫反应。人们把这种诱导T细胞免疫耐受作用称之为否决活性(veto activiˉty)，对能诱导T细胞免疫耐受的细胞称为否决细胞(veto cells)。此外，本研究中CD34 + /RLs低比例混合培养诱导的淋巴细胞对来自于CD34 + 同一供者SC 1 的激活作用无明显抑制作用，表明诱导免疫耐受需要较大剂量的CD34 + 细胞。然而，CD34 + 是一组包括多种亚群的细胞，如CD34 + CD38 + 、CD34 + CD33 + 等，究竟哪一种亚群细胞具有否决活性仍不清楚。若能确定并分离CD34 + 细胞中的否决细胞群体，并在体外扩增具有否决活性的细胞，则可望用于临床免疫耐受的诱导，此项研究工作我们正在进行之中。
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参考文献
1 Rachamim N，Gan J，Segal H，et al.Tolerance induction by“megadose”hematopoietic transplants:donor-type human CD34 + stem cells induce potent specific reduction of host anti-donor cytotoxic T lymphocyte preˉcursors in mixed lymphocyte culture.Transplantation，1998，65:1386-1393.
2 Haynes BF，MorrkertML，Sempowki GD，et al.The role of the thymus in immune
reconstitution in aging，bone marrowtransplantation，and HIV-1infection.Annu Rev Immunol，2000，18:529-560.
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3 Adams AB，Durham MM，Kean L，et al.Costimulation blockade，busulˉfan，and
bone marrow promote titratable macrochimerism，induce transˉplantation tolerance，and correct genetic hemoglobinopathies with miniˉmal myelosuppression.J Immunol，2001，167(2):1103-1111.
4 Kean L，Durham MM，Adams AB，et al.A cure for murine sickle cell disease through stable mixed chimerism and tolerance induction after nonmyeloablative conditioning and major histocompatibility complex-mismatched bone marrow transplant ation.Blood，2002，99:1840-1849.
, 百拇医药
5 王晶，吴晓燕，贾丽萍.抗B7分子抗体诱导T细胞免疫耐受.中华血液学杂志，2002，23:341-344.
6 Reisner Y，Martelli MF.Tolerance induction by’megadose’transplants of CD
34 + stem cells:a new option for leukemia patients without an HLA-matched donor.
Curr Opin Immunol，2000，12:536-541.
7 Abe M，Qi J，Sykes M，et al.Mixed chimerism induces donor-specific T-cell tolerance across a highly disparate xenogeneic barrier.Blood，2002，99:3823-3829.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30260039)
作者单位:1 330006南昌江西医学院第一附属医院血液科
2 330006南昌江西省医科所血液病研究室
(收稿日期:2003-08-10)
(编辑 使臻), http://www.100md.com
关键词 CD34 + 造血干细胞 诱导 免疫耐受
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)11-0964-02
T cell tolerance induction by CD34 + hematopoietic stem cells
Chen Guoan，Yuan Liya，Pan Shengmei，et al.
Department of Hematology，the Frist Affiliated Hospital of Jiangxi Medical University，Nanchang330006.
【Abstract】 Objective To observe the donor-specific T-cell tolerance induction by CD34 + hematopoietic stem cells.Methods Peripheral blood progenitor cells were collected from healthy related allogeneic donor.CD34 + cells were purified by magnetic cell sorting using magnetic beads liked to anti-CD34 + mAb.Responder lymphocytes(RLs)were collected from healthy donor.RLs(1×10 6 )were cultured with(0，0.25，0.5，1)×10 9 CD34 + cellsreˉspectively.Irradiated stiumlator cells were collected from the CD34 + cell donor or a third party.Tcell proli feration was assayed by mixed lymphocyte reaction(MLR)with 3 H-TdR incorporation.Results MLR results showed that the proliferation of T cells was significantly inhibited to a CD34 + -to-responder cell ratio of0.5or higher by the stimuˉlator cells from the CD34 + donor，but was not suppressed by the stimulator cells from the third party.Conclusion CD34 + hematopoietic stem cells are endowed with potentially inducing donor-specific T-cell tolerance.
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Key words CD34 + hematopoietic stem cells induction tolerance
近年来，人们在异基因造血干细胞移植的实验中观察到，如果先对受者给予供者造血干细胞移植，则可产生受者对供者的免疫耐受。此时，受者接受供者的其他组织器官移植，其排斥反应大大减低。因此，Rachamin等 [1] 提出造血干细胞可能具有诱导免疫耐受的能力。最近的动物实验也证实造血干细胞移植诱导的干细胞嵌合体可使HLA配型不合甚至异种动物产生移植免疫耐受而使器官移植成功。我们从人类造血干细胞供者外周血单个核细胞，经进一步纯化为CD34 + 造血干细胞，在体外成功地诱导出T细胞免疫耐受。
1 材料和方法
1.1 标本 经G-CSF动员的异基因造血干细胞供者，采用CS-3000plus血细胞分离机分离外周血单个核细胞。淋巴细胞取自健康输血员。
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1.2 主要试剂 CD34 + 细胞免疫磁珠分离试剂盒购自德国Miltenyi Biotec公司;淋巴细胞分离液购自中国科学院血液学研究所。
1.3 实验方法
1.3.1 CD34 + 细胞分离纯化 用含0.6%ACD-A的PBS稀释单个核细胞(MNC)，1000rpm离心15min，弃上清液，反复3次。1×10 8 个MNC加CD34 + 造血干细胞免疫磁珠100μl标记细胞，置于4℃30min后用1ml PBS洗涤细胞2次，将标记细胞移入MS型分离柱中，自然滴干，再加入PBS0.5ml，移去套在分离柱的磁铁，插上活栓，用力挤压PBS洗脱分离柱中的CD34 + 细胞。分别收集磁铁移开前后的细胞，其中磁珠移去前的细胞(主要合淋巴细胞)冻存作为刺激细胞(SC)备用。
1.3.2 淋巴细胞分离 取HLA不相同健康人抗凝外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，贴壁法去除巨噬细胞后作为反应细胞(RC)或作为反应淋巴细胞(RLs)。
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1.3.3 CD34 + 细胞与淋巴细胞混合培养 取不同数量的纯化CD34 + 细胞与1×10 6 /L RLs细胞混合培养。培养体系为含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃，5%CO 2 培养箱中培养96h。
1.3.4 混合体淋巴细胞培养(MLR) 复苏与CD34 + 细胞同一供者来源的淋巴细胞，RPMI1640培养基洗涤3次，用含10%胎牛血清的RPMI1640调整细胞浓度1×10 6 /ml， 60 Co照射30Gy作为刺激细胞(SC 1 )。收集与CD34 + 细胞混合培养后的细胞作为反应细胞(RC)。同时取第三供者经 60 Co照射30Gy的外周血单个核细胞作为刺激细胞(SC 2 )。将上述细胞加96孔培养板，每孔加SC 1 或SC 2 5×10 4 /100μl，再向每孔加RC×10 5 /100μl。将培养板置于37℃，5%CO 2 培养箱中培养120h后收集细胞。收集细胞前每孔加入 3 H-TdR7.4kBq。多功能闪烁计数仪测定β放射线活性，以放射性核素每分钟闪烁计数(CPM)值表达。
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2 结果
2.1 CD34 + 细胞诱导的淋巴细胞对同一CD34 + 供者来源SC反应性 我们分别取(0、0.25、0.5、1)×10 6 /L CD34 + 细胞与1×10 6 /L个淋巴细胞混合培养，96h后收集细胞作为RC，刺激细胞(SC 1 )来自于CD34 + 供者，将RC与SC 1 进行混合淋巴细胞反应。结果显示(见表1):与(0.5～1)×10 6 个CD34 + 混合反应诱导的RC对SC 1 的激活有明显的抑制作用(与0组比较P<0.01)，而0.25×10 6 个细胞诱导的RC对SC 1 的激活无明显抑制作用(与0组比较P>0.05)。
2.2 CD34 + 细胞诱导的淋巴细胞对第三者SC 2 的反应性 将不同CD34 + /RLs比值混合培养的淋巴细胞与来自于第三者供者的SC 2 进行混合淋巴细胞反应。结果显示:加入CD34 +组对来自行第三供SC 2 刺激T细胞增殖反应均无明显抑制作用(各组与未加CD34 + 组比较P>0.05)。详见表2。
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表1 CD34 + 细胞诱导的淋巴细胞对同一CD34 + 供者SC 1 的反应性略
3 讨论
T细胞特异性免疫耐受对维持自身免疫稳定和移植免疫耐受起重要作用。目前，对于器官移植等排斥反应的预防主要靠长期使用大剂量的免疫抑制剂，由此而导致严重的副作用(如感染、肿瘤、中毒性肾损害和代谢性紊乱等)。近年来，也有通过应用抗CD4、抗CD8、抗CD154和抗B7分子单克隆抗体诱导T细胞免疫耐受 [2～5] ，但其均为诱导暂时性免疫耐受，作用无特异性，甚至导致受者其他免疫功能低下。因此，寻找一种无明显副作用的诱导特异性免疫耐 受的方法是人们追求的目标。自从Rachamin等提出造血干细胞具有诱导免疫耐受以来，许多学者已证实CD34 + 造血干细胞可以诱导移植免疫耐受 [6，7] ，甚至能使HLA配型不合或者异种动物的器官移植获得成功。本研究采用纯化的CD34 + 造血干细胞，成功地诱导了对来自于CD34 + 造血干细胞供者刺激细胞的免疫耐受，并且耐受具有特异性，因为其对第三者的刺激细胞仍具有良好的免疫反应。人们把这种诱导T细胞免疫耐受作用称之为否决活性(veto activiˉty)，对能诱导T细胞免疫耐受的细胞称为否决细胞(veto cells)。此外，本研究中CD34 + /RLs低比例混合培养诱导的淋巴细胞对来自于CD34 + 同一供者SC 1 的激活作用无明显抑制作用，表明诱导免疫耐受需要较大剂量的CD34 + 细胞。然而，CD34 + 是一组包括多种亚群的细胞，如CD34 + CD38 + 、CD34 + CD33 + 等，究竟哪一种亚群细胞具有否决活性仍不清楚。若能确定并分离CD34 + 细胞中的否决细胞群体，并在体外扩增具有否决活性的细胞，则可望用于临床免疫耐受的诱导，此项研究工作我们正在进行之中。
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参考文献
1 Rachamim N，Gan J，Segal H，et al.Tolerance induction by“megadose”hematopoietic transplants:donor-type human CD34 + stem cells induce potent specific reduction of host anti-donor cytotoxic T lymphocyte preˉcursors in mixed lymphocyte culture.Transplantation，1998，65:1386-1393.
2 Haynes BF，MorrkertML，Sempowki GD，et al.The role of the thymus in immune
reconstitution in aging，bone marrowtransplantation，and HIV-1infection.Annu Rev Immunol，2000，18:529-560.
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3 Adams AB，Durham MM，Kean L，et al.Costimulation blockade，busulˉfan，and
bone marrow promote titratable macrochimerism，induce transˉplantation tolerance，and correct genetic hemoglobinopathies with miniˉmal myelosuppression.J Immunol，2001，167(2):1103-1111.
4 Kean L，Durham MM，Adams AB，et al.A cure for murine sickle cell disease through stable mixed chimerism and tolerance induction after nonmyeloablative conditioning and major histocompatibility complex-mismatched bone marrow transplant ation.Blood，2002，99:1840-1849.
, 百拇医药
5 王晶，吴晓燕，贾丽萍.抗B7分子抗体诱导T细胞免疫耐受.中华血液学杂志，2002，23:341-344.
6 Reisner Y，Martelli MF.Tolerance induction by’megadose’transplants of CD
34 + stem cells:a new option for leukemia patients without an HLA-matched donor.
Curr Opin Immunol，2000，12:536-541.
7 Abe M，Qi J，Sykes M，et al.Mixed chimerism induces donor-specific T-cell tolerance across a highly disparate xenogeneic barrier.Blood，2002，99:3823-3829.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30260039)
作者单位:1 330006南昌江西医学院第一附属医院血液科
2 330006南昌江西省医科所血液病研究室
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