用FCM检测食管癌细胞P-糖蛋白表达的临床意义
【摘要】 目的 了解食管癌细胞多药耐药性表达水平的临床意义。方法 用流式细胞术检测了70例食管癌手术标本中癌细胞和食管切缘正常粘膜细胞P-糖蛋白(P-gp)表达水平，并进行临床病理分析。结果 70例食管癌P-gp表达阳性细胞<25%有27例(38.6%);在25%～40%有11例(15.7%);在41%～60%有14例(20%);>60%有18例(25.7%)。肿瘤部位:中部食管癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001);下部食管癌P-gp%与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.05)。肿瘤大体类型:髓质型癌P-gp%与正常粘膜比较差异有高显著性(P<0.01)，溃疡型癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001)。肿瘤大小:肿瘤小于6cm与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.01)，大于6cm与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.05)。肿瘤分化程度:中分化癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001)，低分化癌P-gp%与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.05)。淋巴结有转移癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001)。淋巴结无转移癌P-gp%与正常粘膜比较差异有高显著性(P<0.01)。临床分期:Ⅰ～Ⅱ期癌和Ⅲ～Ⅳ期癌P-gp%与正常粘膜比较差异都有非常显著性(P<0.001)。性别:男性和女性患者癌P-gp%与正常粘膜比较差异都有非常显著性(P<0.001)。年龄:46～59岁组和≥60岁组患者癌P-gp%与正常粘膜比较差异都有非常显著性(P<0.001)。血型:A、B、AB型血患者癌P-gp%与正常粘膜比较差异都有非常显著性(P<0.001)，O型血患者癌P-gp%与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.05)。结论 用流式细胞仪检测食管癌细胞P-gp表达具有更快速，简便，准确定量的特点。可为临床提供选择化疗方案的参考指标。
, http://www.100md.com
关键词 P-糖蛋白(P-gp) 流式细胞术 食管癌
【文献标识码】 A 【文章编号】1609-6614(2003)19-1750-04
The clinical significance of detecting P-gp in the
cell of esophageal carcinoma by flow cytometry
Xu Shenhua，LingYutian，Zhu Chihong，et al.
ZheJiang Cancer Hospital，Hangzhou310022.
【Abstract】 Objective To understand the clinical significance of the expression level of MDR in the cell of esophageal carcinoma.Methods To examine the expression level of P-glycoprotein(P-gp)in the operating samˉples from70cases with esophageal carcinoma as well as normal esophagus operating section cell of mucous membrane by flow cytometry，and to combine clinical-pathology with statistically analyzed.Results The expressing positive cell of P-gp in a total of70patients with esophageal carcinoma，among these，<25%were27cases(38.6%);25～40%were11cases(15.7%);41～60%were14cases(20%);>60%were18cases(25.7%).Site of tumor growth:The most significant difference(P<0.001)was present to compare the P-gp%of the patients with middle portion in the esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane，and the significant difference(P<0.05)was present tocompare the P-gp%of the patients with lower portion in the esophageal carcinomawith normal esophagus mucous membrane;Type of tumor mass:The more significant difference(P<0.01)was present to comˉpare the P-gp%of the patients with medullar type esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane，and the mostsignificant difference(P<0.001)was present to compare the P-gp%of the patients with ulcer type esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane;Size of tumor:The more significant difference(P<0.01)was present to compare the P-gp%in the<6cm of tumor with normal esophagus mucous membrane，and the significant difference(P<0.05)was present to compare the P-gp%in the>6cm of tumor with normal esophaˉgus mucous membrane;Degree of tumor differentiation:The most significant difference(P<0.001)was present to compare the P-gp%in the middle differentiation esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane，and the significant difference(P<0.05)was present to compare the poor differentiation esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane;Lymph node metastases status:The most significant difference(P<0.001)was present to compare the P-gp%of the esophageal carcinoma with lymph node metastases with normal esophagus muˉcous membrane，and the more significant difference(P<0.01)was present to compare the P-gp%of theesophageal carcinoma without lymph node metastases with normal esophagus mucous membrane;Clinical stage:The more significant difference(P<0.01)were present to compare the P-gp%of theⅢ-Ⅳand I-II clinical stage esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane;The sexes of patients:The most significant difference(p<0.001)were present to compare the P-gp%in the male and female patient of esophageal carcinoma with norˉmal esophagus mucous membrane;The age of patients:The most significant difference(P<0.001)were present to compare the P-gp%in the46-59ages and>60ages patient of esophageal carcinoma with normal esophagus muˉcous membrane;Blood type:The most significant difference(P<0.001)were present to compare the P-gp%in the A，B，AB type blood patient of esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane，and the significant difference(P<0.05)was present to compare the P-gp%in the O type blood patient of esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane;Conclusion To detect the P-gp expression level in esophageal carcinoma by using FCM，it may well be more quick，convenient，and to possess the accurate detecting character.It can be as a reference marker to provide a choice proposal of chemotherapy in the cancer patient.
, 百拇医药
Key words P-glycoprotein(P-gp) flow cytometre(FCM) esophageal carcinoma
已知，多药耐药性(MDR)基因的扩增及其产物P-糖蛋白(P-gp)的过表达是化疗失败的直接原因之一，但其在食管癌中的研究报道很少。迄今未见用流式细胞仪(FCM)检测食管癌细胞P-gp的报道。为了解食管癌细胞P-gp表达水平的临床意义，笔者检测了70例未化疗食管癌病人手术前标本癌细胞和食管切缘正常粘膜P-gp表达水平的变化，并进行临床病理分析。为食管癌的综合治疗及化疗药物选择提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 研究对象 1998年12月～2000年9月浙江省肿瘤医院胸外科住院的食管癌病人手术标本受检测癌细胞P-gp表达水平的共70例，均经复查病理诊断和病历资料。男57例，女13例，年龄39～72岁，平均年龄54.7±7.7岁。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 本研究使用的抗体为藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人P-gp单克隆抗体P-gp-PE和同型对照为IgG2a-PE(均为Immunotech公司产品)。
1.3 方法 取食管癌组织和食管切缘正常粘膜，用机械方法分离后，200目尼龙网过滤成单细胞。取20μl抗体加入到12mm×75mm的塑料小管中，每例做2管，A管P-gp-PE;B管IgG2a-PE为阴性对照。在每管中加入1×10 6 的细胞悬液，充分混匀后在室温暗处静置30min，加3ml PBS(含0.1%叠氮钠)震荡，混匀，离心(200r)5min，倾去上清，每管加0.5ml1%的付甲醛固定液，当天上机检测分析。流式细胞仪(FACSCalibur美国B.D公司)采集窗内2000个以上细胞。用Cellguest软件和直方图分析阳性标记细胞百分率。
1.4 统计方法 统计学处理采用t检验。
2 结果70例食管癌P-gp表达阳性细胞<25%有27例(38.6%);在25%～40%(轻度表达)有11例(15.7%);在41%～60%(中度表达)有14例(20%);>60%(重度表达)有18例(25.7%)。
, 百拇医药
2.1 肿瘤发生部位 70例食管癌病人均有发生部位记载。食管癌细胞P-gp表达水平与肿瘤发生部位的关系见表1。
2.2 肿瘤大体类型 68例食管癌病人有肿瘤大体类型记录(其中3例外生型因例数太少未列统计)。33例溃疡型食管癌细胞P-gp(42.84±4.83)%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001，t=4.377)。32例髓质型食管癌细 胞P-gp(36.11±5.14)%与正常粘膜比较差异有高显著性(P<0.01，t=2.892)。
表1 食管癌细胞P-gp%与肿瘤发生部位的关系
注:临床记录凡中上部位癌统计在上部;中下部位癌统计在下部。与正常粘膜细胞比较★P<0.001，t=5.066;与正常粘膜细胞比较△P<0.05，t=2.472
2.3 肿瘤大小 食管癌细胞P-gp%与肿瘤大小的关系见表2。
, http://www.100md.com
表2 食管癌细胞P-pg%与肿瘤大小的关系
注:与正常粘膜细胞比较 ★1 P<0.01，t=3.029，与正常粘膜细胞比较 ★2 P<0.001，t=4.601;与正常粘膜细胞比较 △ P<0.05，t=2.424
2.4 肿瘤分化程度 70例食管癌病人都有病理报告，均为分化程度不同的鳞状细胞癌。食管癌细胞P-gp%与肿瘤分化程度的关系见表3。
2.5 食管癌细胞P-gp%与患者淋巴结转移的关系 38 例有淋巴结转移的食管癌细胞P-gp(41.25±4.10)%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001，t=4.387)。32例无淋巴结转移的食管癌细胞P-gp(39.70±6.09)%与正常粘膜比较差异有高显著性(P<0.01，t=3.308)。
表3 食管癌细胞P-gp%与肿瘤分化程度的关系 (略)
, http://www.100md.com
注:与正常粘膜细胞比较 ★ P<0.001，t=4.591与正常粘膜细胞比较 △ P<0.05，t=2.147
2.6 食管癌细胞P-gp%与患者临床分期的关系 30例Ⅰ～Ⅱ期食管癌细胞P-gp(40.86±6.38)%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001，t=3.444)。40例Ⅲ～Ⅳ期的食管癌细胞P-gp(40.30±4.00)%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001，t=4.228)。
2.7 食管癌细胞P-gp%与患者性别的关系 57例男性食管癌细胞P-gp(37.50±3.76)%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001，t=3.658)。13例女性食管癌细胞P-gp(53.85±8.98)%与正常粘膜比较差异同样有非常显著性(P<0.001，t=4.754)。
2.8 患者年龄 食管癌细胞P-gp%与患者年龄的关系见表4。
, 百拇医药
表4 食管癌细胞P-gp%与患者年龄的关系
注:与正常粘膜细胞比较★P<0.001，t(46～59岁)=3.756，t(≥60岁)=4.191
2.9 食管癌细胞P-gp%与患者血型的关系 见表5。
表5 食管癌细胞P-gp%与患者血型的关系
注:与正常粘膜细胞比较 ★ P<0.01，t(A型)=3.039，t(B型)=4.347，t(AB型)=2.726，与正常粘膜细胞比较 △ P<0.05，t=2.469
3 讨论
多药耐药性(MDR)的发生机制十分复杂，其中MDR基因编码的P-糖蛋白(P-gp)高表达是多药耐药产生的主要机制。P-gp的分子量为170KD，属于转运蛋白ATP结合家族。P-gp跨膜结构具有能量依赖性“药泵”功能，能将 疏水亲脂性药物，如VCR、生物碱类、ADM等泵出细胞外，造成细胞内药物浓度下降，使药物的细胞毒作用降低或完全丧失，并致细胞产生耐药性。因此P-gp是细胞产生耐药的分子基础，凡具有MDR的肿瘤细胞，其P-gp表达水平与耐药程度成正比 [1] 。
, 百拇医药
近10多年来对多药耐药机制的研究表明:MDR1基因的扩增及其产物P-糖蛋白的过表达通常是临床化疗失败的直接原因之一。药物耐受是影响肿瘤化疗的最大障碍，其结果是肿瘤患者对药物治疗不再敏感，并导致转移和复发，得不到控制。因此，检测肿瘤的多药耐药性对指导临床抗癌药物的选择应用具有重要的意义。但目前文献对食管癌耐药性的研究报道很少。仅见陈克能用RT-PCR方法检测46例 [2] 未化疗和30例 [3] 食管癌化疗前后MDR1基因表达情况的报道。而用流式细胞仪检测癌细胞的P-gp%具有快速、简便，准确的特点。但在国内外文献中用FCM检测肿瘤组织P-gp的报道却很少 [4～7，11～15] ，迄今尚未见用流式细胞仪检测食管癌细胞P-gp表达的报道。
我们用流式细胞仪检测70例食管癌细胞和远端正常粘膜P-gp的表达，并结合临床病理进行统计学分析。结果显示:在70例食管癌中其P-gp表达阳性细胞<25%有27例(38.6%)，在25%～40%(轻度表达)有11例(15.7%)，在41%～60%(中度表达)有14例(20%)，>60%(重度表达)有18例(25.7%)。在未进行化疗的食管癌中有P-gp中度和重度表达患者占45%，笔者认为这可能是多年来食管癌化疗疗效裹足不前的原因之一。在食管癌的综合治疗中仍应强调手术和放疗的地位，但同时应加强化疗适宜病人的筛选，根据我们检测近40%的食管癌病人适宜进行化疗，还有15%以上的病人可以选择其他疗法加更合理的化疗方案，应该避免使用生物碱类、VCR等易产生高度耐药的药物。对于占45%有P-gp中度和重度表达的食管癌患者，应该积极开展逆转肿瘤MDR的研究，以利加大化疗在食管癌治疗中的比重，提高综合治疗效果。
, 百拇医药
Gottesman认为 [8] ，MDR1基因的过表达除涉及到耐药外，也是癌细胞生物学行为进一步恶化的指标。肿瘤以其本身固定的频率产生基因变异，肿瘤越大，增殖次数越多，其抗药性越大 [9] 。Gurel [10] 等用免疫组化方法检测55例胃癌P-gp表达，发现高表达与患者预后不良有关。我们的结果也证实P-gp过表达与癌细胞生物学的恶性行为成正相关，而且与年龄和血型也相关。肿瘤部位:中部食管癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001);下部食管癌P-gp%与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.05)。提示食管癌发生部位与耐药性的产生有关，尤其是中部食管癌其耐药性发生率尤高。肿瘤大体类型:髓质型癌P-gp%与正常粘膜比较差异有高显著性(P<0.01)，溃疡型癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001)，提示食管癌大体类型与耐药性有关，溃疡型癌更易产生耐药性。肿瘤大小:肿瘤小于3cm组和3.1～5.9cm组P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.01)，大于6cm组P-gp%与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.05)。肿瘤分化程度:中分化癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001)，低分化癌P-gp%与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.05)，而16例高分化癌与正常粘膜比较差异无显著性。提示肿瘤耐药性与肿瘤分化程度相关。淋巴结有转移癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001)。淋巴结无转移癌P-gp%与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.01)，提示淋巴结有转移食管癌更易产生耐药性。临床分期:Ⅰ～Ⅱ期癌P-gp%和Ⅲ～Ⅳ期癌P-gp%与正常粘膜比较差异都有非常显著性(P<0.001)，说明临床分期与P-gp表达关系不大。性别:男性和女性患者癌P-gp%与正常粘膜比较差异都有非常显著性(P<0.001)，提示肿瘤耐药性与性别无关。年龄:46～59岁组P-gp%和≥60岁组患者癌P-gp%与正常粘膜比较差异都有非常显著性(P<0.001)，≤45岁组患者癌P-gp%与正常粘膜比较无差异，表明年龄越大越容易产生耐药性。血型:A、B、AB型血患者癌P-gp%与正常粘膜与比较差异都有非常显著性(P<0.001)，O型血患者癌P-gp%与正常粘膜与比较差异有显著性(P<0.05)。
, 百拇医药
4 结论
用流式细胞仪检测食管癌细胞P-gp表达具有快速，简便，准确定量的特点。可为临床提供选择化疗方案的参考依据。
参考文献
1 许沈华.多药耐药性检测的临床意义.中国肿瘤，1999，8(9):421-422.
2 陈克能，邢海平，程邦昌等.食管癌多药耐药基因的表达与病理学的关系.中华医学杂志，1998，78(6):462-463.
3 陈克能，张力建，邢海平，等.化疗对食管癌组织中MDR1基因表达的影响及其意义.中国癌症杂志，1999，9(2):91-92.
4 Tanigawa N，et al Detection of P-glycoprotein and its clinical signifiˉcance.Nippo-Rinsho，1997，55(5):1064-1068.
, http://www.100md.com
5 郑国强，等.人胃腺癌阿霉素耐药细胞系BGC-823/DOX耐药机理的研究.中华外科杂志，1997，35(6):325-328.
6 Yu DS，Sun GH，MA，CP et al.Verapamil modulation of multidrug reˉsistance in renal cell carcinoma J.Formos Med Assoc，2000，99(4):311 -316.
7 阚兵，罗峰，雷松，等.用流式细胞术检测人肿瘤组织细胞多药耐药基因表达产物P170.华西医科大学学报，1998，29(3):269-271.
8 GottesmanMM.How cancer cell evade chemotherpy.Cancer Res，1993，53:747-723.
9 赵体平.肿瘤的化学治疗.汤钊猷主编.现代肿瘤学，上海:上海医科大学出版社，1993，370.
, 百拇医药
10 Gurel S，Yerci O，Filiz G，et al.High expression of multidrug resisˉtance-1(MDR-1)and its relationship with multiple prognostic facˉtors in gastric carcinomas in patients in Turkey J.Int.Med.Res，1999，27(2):79-84.
11 Yang X，Jia L，Wei L，et al.Correlation of expression levels of mulˉtidrug resistance gene1(mdr1)mRNA，multidrug resistance-associˉated protein(MRP)，and P-glycoprotein(P-gp)with chemotheraˉpy efficacy in malignant lymphomas.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2002，82(17):1177-1179.
, 百拇医药
12 Tian WH，Feng HL，Gao JS，et al.Expression and clinical signifiˉcance ofmdr-1gene in lymphoma.Ai Zheng，2002，21(8):910-913.
13 Jakubikova J，Duraj J，Hunakova L，et al.PK11195，an isoquinoline carboxamide ligand of the mitochondrial benzodiazepine receptor，inˉcreased drug uptake and facilitated drug-induced apoptosis in human multidrug-resistant leukemia cells in vitro，Neoplasma2002，49(4):231-236.
14 Fujimaki S，Funato T，Harigae H，et al.Quantitative analysis of a MDR1transcript for prediction of drug resistance in acute leukemia.Clin Chem，2002，48(6Pt1):811-817.
15 Li J，Xu L，He K，et al.Reversal of nomegestrol acetate on multidrug resistance in drug-resistant human breast cancer cell line MCF7/ADR.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2002，24(2):129-132.
(编辑清 泉)
基金项目:本课题受浙江省医药卫生科研基金资助
作者单位:310022浙江省肿瘤医院, 百拇医药(许沈华 凌雨田 朱赤红 周星明 刘祥麟)
, http://www.100md.com
关键词 P-糖蛋白(P-gp) 流式细胞术 食管癌
【文献标识码】 A 【文章编号】1609-6614(2003)19-1750-04
The clinical significance of detecting P-gp in the
cell of esophageal carcinoma by flow cytometry
Xu Shenhua，LingYutian，Zhu Chihong，et al.
ZheJiang Cancer Hospital，Hangzhou310022.
【Abstract】 Objective To understand the clinical significance of the expression level of MDR in the cell of esophageal carcinoma.Methods To examine the expression level of P-glycoprotein(P-gp)in the operating samˉples from70cases with esophageal carcinoma as well as normal esophagus operating section cell of mucous membrane by flow cytometry，and to combine clinical-pathology with statistically analyzed.Results The expressing positive cell of P-gp in a total of70patients with esophageal carcinoma，among these，<25%were27cases(38.6%);25～40%were11cases(15.7%);41～60%were14cases(20%);>60%were18cases(25.7%).Site of tumor growth:The most significant difference(P<0.001)was present to compare the P-gp%of the patients with middle portion in the esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane，and the significant difference(P<0.05)was present tocompare the P-gp%of the patients with lower portion in the esophageal carcinomawith normal esophagus mucous membrane;Type of tumor mass:The more significant difference(P<0.01)was present to comˉpare the P-gp%of the patients with medullar type esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane，and the mostsignificant difference(P<0.001)was present to compare the P-gp%of the patients with ulcer type esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane;Size of tumor:The more significant difference(P<0.01)was present to compare the P-gp%in the<6cm of tumor with normal esophagus mucous membrane，and the significant difference(P<0.05)was present to compare the P-gp%in the>6cm of tumor with normal esophaˉgus mucous membrane;Degree of tumor differentiation:The most significant difference(P<0.001)was present to compare the P-gp%in the middle differentiation esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane，and the significant difference(P<0.05)was present to compare the poor differentiation esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane;Lymph node metastases status:The most significant difference(P<0.001)was present to compare the P-gp%of the esophageal carcinoma with lymph node metastases with normal esophagus muˉcous membrane，and the more significant difference(P<0.01)was present to compare the P-gp%of theesophageal carcinoma without lymph node metastases with normal esophagus mucous membrane;Clinical stage:The more significant difference(P<0.01)were present to compare the P-gp%of theⅢ-Ⅳand I-II clinical stage esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane;The sexes of patients:The most significant difference(p<0.001)were present to compare the P-gp%in the male and female patient of esophageal carcinoma with norˉmal esophagus mucous membrane;The age of patients:The most significant difference(P<0.001)were present to compare the P-gp%in the46-59ages and>60ages patient of esophageal carcinoma with normal esophagus muˉcous membrane;Blood type:The most significant difference(P<0.001)were present to compare the P-gp%in the A，B，AB type blood patient of esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane，and the significant difference(P<0.05)was present to compare the P-gp%in the O type blood patient of esophageal carcinoma with normal esophagus mucous membrane;Conclusion To detect the P-gp expression level in esophageal carcinoma by using FCM，it may well be more quick，convenient，and to possess the accurate detecting character.It can be as a reference marker to provide a choice proposal of chemotherapy in the cancer patient.
, 百拇医药
Key words P-glycoprotein(P-gp) flow cytometre(FCM) esophageal carcinoma
已知，多药耐药性(MDR)基因的扩增及其产物P-糖蛋白(P-gp)的过表达是化疗失败的直接原因之一，但其在食管癌中的研究报道很少。迄今未见用流式细胞仪(FCM)检测食管癌细胞P-gp的报道。为了解食管癌细胞P-gp表达水平的临床意义，笔者检测了70例未化疗食管癌病人手术前标本癌细胞和食管切缘正常粘膜P-gp表达水平的变化，并进行临床病理分析。为食管癌的综合治疗及化疗药物选择提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 研究对象 1998年12月～2000年9月浙江省肿瘤医院胸外科住院的食管癌病人手术标本受检测癌细胞P-gp表达水平的共70例，均经复查病理诊断和病历资料。男57例，女13例，年龄39～72岁，平均年龄54.7±7.7岁。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 本研究使用的抗体为藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人P-gp单克隆抗体P-gp-PE和同型对照为IgG2a-PE(均为Immunotech公司产品)。
1.3 方法 取食管癌组织和食管切缘正常粘膜，用机械方法分离后，200目尼龙网过滤成单细胞。取20μl抗体加入到12mm×75mm的塑料小管中，每例做2管，A管P-gp-PE;B管IgG2a-PE为阴性对照。在每管中加入1×10 6 的细胞悬液，充分混匀后在室温暗处静置30min，加3ml PBS(含0.1%叠氮钠)震荡，混匀，离心(200r)5min，倾去上清，每管加0.5ml1%的付甲醛固定液，当天上机检测分析。流式细胞仪(FACSCalibur美国B.D公司)采集窗内2000个以上细胞。用Cellguest软件和直方图分析阳性标记细胞百分率。
1.4 统计方法 统计学处理采用t检验。
2 结果70例食管癌P-gp表达阳性细胞<25%有27例(38.6%);在25%～40%(轻度表达)有11例(15.7%);在41%～60%(中度表达)有14例(20%);>60%(重度表达)有18例(25.7%)。
, 百拇医药
2.1 肿瘤发生部位 70例食管癌病人均有发生部位记载。食管癌细胞P-gp表达水平与肿瘤发生部位的关系见表1。
2.2 肿瘤大体类型 68例食管癌病人有肿瘤大体类型记录(其中3例外生型因例数太少未列统计)。33例溃疡型食管癌细胞P-gp(42.84±4.83)%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001，t=4.377)。32例髓质型食管癌细 胞P-gp(36.11±5.14)%与正常粘膜比较差异有高显著性(P<0.01，t=2.892)。
表1 食管癌细胞P-gp%与肿瘤发生部位的关系
注:临床记录凡中上部位癌统计在上部;中下部位癌统计在下部。与正常粘膜细胞比较★P<0.001，t=5.066;与正常粘膜细胞比较△P<0.05，t=2.472
2.3 肿瘤大小 食管癌细胞P-gp%与肿瘤大小的关系见表2。
, http://www.100md.com
表2 食管癌细胞P-pg%与肿瘤大小的关系
注:与正常粘膜细胞比较 ★1 P<0.01，t=3.029，与正常粘膜细胞比较 ★2 P<0.001，t=4.601;与正常粘膜细胞比较 △ P<0.05，t=2.424
2.4 肿瘤分化程度 70例食管癌病人都有病理报告，均为分化程度不同的鳞状细胞癌。食管癌细胞P-gp%与肿瘤分化程度的关系见表3。
2.5 食管癌细胞P-gp%与患者淋巴结转移的关系 38 例有淋巴结转移的食管癌细胞P-gp(41.25±4.10)%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001，t=4.387)。32例无淋巴结转移的食管癌细胞P-gp(39.70±6.09)%与正常粘膜比较差异有高显著性(P<0.01，t=3.308)。
表3 食管癌细胞P-gp%与肿瘤分化程度的关系 (略)
, http://www.100md.com
注:与正常粘膜细胞比较 ★ P<0.001，t=4.591与正常粘膜细胞比较 △ P<0.05，t=2.147
2.6 食管癌细胞P-gp%与患者临床分期的关系 30例Ⅰ～Ⅱ期食管癌细胞P-gp(40.86±6.38)%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001，t=3.444)。40例Ⅲ～Ⅳ期的食管癌细胞P-gp(40.30±4.00)%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001，t=4.228)。
2.7 食管癌细胞P-gp%与患者性别的关系 57例男性食管癌细胞P-gp(37.50±3.76)%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001，t=3.658)。13例女性食管癌细胞P-gp(53.85±8.98)%与正常粘膜比较差异同样有非常显著性(P<0.001，t=4.754)。
2.8 患者年龄 食管癌细胞P-gp%与患者年龄的关系见表4。
, 百拇医药
表4 食管癌细胞P-gp%与患者年龄的关系
注:与正常粘膜细胞比较★P<0.001，t(46～59岁)=3.756，t(≥60岁)=4.191
2.9 食管癌细胞P-gp%与患者血型的关系 见表5。
表5 食管癌细胞P-gp%与患者血型的关系
注:与正常粘膜细胞比较 ★ P<0.01，t(A型)=3.039，t(B型)=4.347，t(AB型)=2.726，与正常粘膜细胞比较 △ P<0.05，t=2.469
3 讨论
多药耐药性(MDR)的发生机制十分复杂，其中MDR基因编码的P-糖蛋白(P-gp)高表达是多药耐药产生的主要机制。P-gp的分子量为170KD，属于转运蛋白ATP结合家族。P-gp跨膜结构具有能量依赖性“药泵”功能，能将 疏水亲脂性药物，如VCR、生物碱类、ADM等泵出细胞外，造成细胞内药物浓度下降，使药物的细胞毒作用降低或完全丧失，并致细胞产生耐药性。因此P-gp是细胞产生耐药的分子基础，凡具有MDR的肿瘤细胞，其P-gp表达水平与耐药程度成正比 [1] 。
, 百拇医药
近10多年来对多药耐药机制的研究表明:MDR1基因的扩增及其产物P-糖蛋白的过表达通常是临床化疗失败的直接原因之一。药物耐受是影响肿瘤化疗的最大障碍，其结果是肿瘤患者对药物治疗不再敏感，并导致转移和复发，得不到控制。因此，检测肿瘤的多药耐药性对指导临床抗癌药物的选择应用具有重要的意义。但目前文献对食管癌耐药性的研究报道很少。仅见陈克能用RT-PCR方法检测46例 [2] 未化疗和30例 [3] 食管癌化疗前后MDR1基因表达情况的报道。而用流式细胞仪检测癌细胞的P-gp%具有快速、简便，准确的特点。但在国内外文献中用FCM检测肿瘤组织P-gp的报道却很少 [4～7，11～15] ，迄今尚未见用流式细胞仪检测食管癌细胞P-gp表达的报道。
我们用流式细胞仪检测70例食管癌细胞和远端正常粘膜P-gp的表达，并结合临床病理进行统计学分析。结果显示:在70例食管癌中其P-gp表达阳性细胞<25%有27例(38.6%)，在25%～40%(轻度表达)有11例(15.7%)，在41%～60%(中度表达)有14例(20%)，>60%(重度表达)有18例(25.7%)。在未进行化疗的食管癌中有P-gp中度和重度表达患者占45%，笔者认为这可能是多年来食管癌化疗疗效裹足不前的原因之一。在食管癌的综合治疗中仍应强调手术和放疗的地位，但同时应加强化疗适宜病人的筛选，根据我们检测近40%的食管癌病人适宜进行化疗，还有15%以上的病人可以选择其他疗法加更合理的化疗方案，应该避免使用生物碱类、VCR等易产生高度耐药的药物。对于占45%有P-gp中度和重度表达的食管癌患者，应该积极开展逆转肿瘤MDR的研究，以利加大化疗在食管癌治疗中的比重，提高综合治疗效果。
, 百拇医药
Gottesman认为 [8] ，MDR1基因的过表达除涉及到耐药外，也是癌细胞生物学行为进一步恶化的指标。肿瘤以其本身固定的频率产生基因变异，肿瘤越大，增殖次数越多，其抗药性越大 [9] 。Gurel [10] 等用免疫组化方法检测55例胃癌P-gp表达，发现高表达与患者预后不良有关。我们的结果也证实P-gp过表达与癌细胞生物学的恶性行为成正相关，而且与年龄和血型也相关。肿瘤部位:中部食管癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001);下部食管癌P-gp%与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.05)。提示食管癌发生部位与耐药性的产生有关，尤其是中部食管癌其耐药性发生率尤高。肿瘤大体类型:髓质型癌P-gp%与正常粘膜比较差异有高显著性(P<0.01)，溃疡型癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001)，提示食管癌大体类型与耐药性有关，溃疡型癌更易产生耐药性。肿瘤大小:肿瘤小于3cm组和3.1～5.9cm组P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.01)，大于6cm组P-gp%与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.05)。肿瘤分化程度:中分化癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001)，低分化癌P-gp%与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.05)，而16例高分化癌与正常粘膜比较差异无显著性。提示肿瘤耐药性与肿瘤分化程度相关。淋巴结有转移癌P-gp%与正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.001)。淋巴结无转移癌P-gp%与正常粘膜比较差异有显著性(P<0.01)，提示淋巴结有转移食管癌更易产生耐药性。临床分期:Ⅰ～Ⅱ期癌P-gp%和Ⅲ～Ⅳ期癌P-gp%与正常粘膜比较差异都有非常显著性(P<0.001)，说明临床分期与P-gp表达关系不大。性别:男性和女性患者癌P-gp%与正常粘膜比较差异都有非常显著性(P<0.001)，提示肿瘤耐药性与性别无关。年龄:46～59岁组P-gp%和≥60岁组患者癌P-gp%与正常粘膜比较差异都有非常显著性(P<0.001)，≤45岁组患者癌P-gp%与正常粘膜比较无差异，表明年龄越大越容易产生耐药性。血型:A、B、AB型血患者癌P-gp%与正常粘膜与比较差异都有非常显著性(P<0.001)，O型血患者癌P-gp%与正常粘膜与比较差异有显著性(P<0.05)。
, 百拇医药
4 结论
用流式细胞仪检测食管癌细胞P-gp表达具有快速，简便，准确定量的特点。可为临床提供选择化疗方案的参考依据。
参考文献
1 许沈华.多药耐药性检测的临床意义.中国肿瘤，1999，8(9):421-422.
2 陈克能，邢海平，程邦昌等.食管癌多药耐药基因的表达与病理学的关系.中华医学杂志，1998，78(6):462-463.
3 陈克能，张力建，邢海平，等.化疗对食管癌组织中MDR1基因表达的影响及其意义.中国癌症杂志，1999，9(2):91-92.
4 Tanigawa N，et al Detection of P-glycoprotein and its clinical signifiˉcance.Nippo-Rinsho，1997，55(5):1064-1068.
, http://www.100md.com
5 郑国强，等.人胃腺癌阿霉素耐药细胞系BGC-823/DOX耐药机理的研究.中华外科杂志，1997，35(6):325-328.
6 Yu DS，Sun GH，MA，CP et al.Verapamil modulation of multidrug reˉsistance in renal cell carcinoma J.Formos Med Assoc，2000，99(4):311 -316.
7 阚兵，罗峰，雷松，等.用流式细胞术检测人肿瘤组织细胞多药耐药基因表达产物P170.华西医科大学学报，1998，29(3):269-271.
8 GottesmanMM.How cancer cell evade chemotherpy.Cancer Res，1993，53:747-723.
9 赵体平.肿瘤的化学治疗.汤钊猷主编.现代肿瘤学，上海:上海医科大学出版社，1993，370.
, 百拇医药
10 Gurel S，Yerci O，Filiz G，et al.High expression of multidrug resisˉtance-1(MDR-1)and its relationship with multiple prognostic facˉtors in gastric carcinomas in patients in Turkey J.Int.Med.Res，1999，27(2):79-84.
11 Yang X，Jia L，Wei L，et al.Correlation of expression levels of mulˉtidrug resistance gene1(mdr1)mRNA，multidrug resistance-associˉated protein(MRP)，and P-glycoprotein(P-gp)with chemotheraˉpy efficacy in malignant lymphomas.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2002，82(17):1177-1179.
, 百拇医药
12 Tian WH，Feng HL，Gao JS，et al.Expression and clinical signifiˉcance ofmdr-1gene in lymphoma.Ai Zheng，2002，21(8):910-913.
13 Jakubikova J，Duraj J，Hunakova L，et al.PK11195，an isoquinoline carboxamide ligand of the mitochondrial benzodiazepine receptor，inˉcreased drug uptake and facilitated drug-induced apoptosis in human multidrug-resistant leukemia cells in vitro，Neoplasma2002，49(4):231-236.
14 Fujimaki S，Funato T，Harigae H，et al.Quantitative analysis of a MDR1transcript for prediction of drug resistance in acute leukemia.Clin Chem，2002，48(6Pt1):811-817.
15 Li J，Xu L，He K，et al.Reversal of nomegestrol acetate on multidrug resistance in drug-resistant human breast cancer cell line MCF7/ADR.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2002，24(2):129-132.
(编辑清 泉)
基金项目:本课题受浙江省医药卫生科研基金资助
作者单位:310022浙江省肿瘤医院, 百拇医药(许沈华 凌雨田 朱赤红 周星明 刘祥麟)