当前位置: 首页 > 期刊 > 《中华医学研究杂志》 > 2003年第12期
编号:10401961
端粒酶活性测定对良、恶性胸水鉴别的临床应用价值
http://www.100md.com 《中华医学研究杂志》 2003年第12期
     【摘要】 目的 探讨胸水端粒酶活性测定对良、恶性胸水鉴别的临床应用价值。方法采用端粒酶重复序列扩增法(TRAP)结合聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法(PAGE)及光度酶联免疫法(ELISA)分别检测良、恶性胸水端粒酶活性,分析比较两者阳性表达率,并与同标本ADA、CEA结果进行比较。结果 恶性胸水端粒酶测定(PAGE法)阳性率80%,明显高于良性胸水端粒酶测定(PAGE法)阳性率15%(P<0.01,χ 2 =10.48,ν=1);恶性胸水端粒酶(ELISA法)阳性率87%,也明显高于良性胸水端粒酶(ELISA法)阳性率15%(P<0.01,χ 2 =12.11,ν=1);诊断符合率端粒酶PAGE法(82%)、ELISA法(86%)、CEA(72%)和ADA(72%);Youden指数PAGE法(0.65)、ELISA法(0.72)、CEA(0.52)和ADA(0.5),提示端粒酶活性测定临床价值高于CEA和ADA。结论 端粒酶活性测定对良、恶性胸水鉴别诊断具有重要意义,且优于CEA和ADA的测定,可作为临床诊断恶性胸水的辅助手段。
, http://www.100md.com
    关键词 恶性胸水 端粒酶 鉴别诊断 癌胚抗原 腺苷脱氨酶

    【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)12-1060-03

    The clinical research values of telomerase activity

    for distinguishing benign and malignant pleural fluids

    Ye Xiaoqun,Qi Xiefei,Rao Weihua

    Department of Respiratory Disease,the Second Affiliated Hospital of Jiangxi Medical College,Nanchang330006.
, 百拇医药
    【Abstract】 Objective To study the diagnostic value of telomerase activity in distinguishing between benign and malignant pleural fluids.Methods Telomerase activity was measured by TRAP-PAGE and TRAP-ELISA.The results of telomerase detection were compared between benign and malignantpleural fluids,and compared with the reˉsults of ADA and CEA detection.Results The positive rate of telomerase activity assay in malignant pleural fluids80%and benign pleural fluids15%detected by PAGE has significantly different(P<0.01,χ 2 =10.48,ν=1),and the same result in malignant pleural fluids87%and benign pleural fluids15%detected by ELISA has significant difˉference too(P<0.01,χ2 =12.11,ν=1).The diagnosis accordance rate was86%,82%,72%,72%and Youden’s index(J)was0.72,0.65,0.52,0.5corresponding to ELISA,PAGE,CEA and ADA,respectively.According to the comprehensive analysis,the clinical value of telomerase activity assay was higher than that of CEA and ADA.Concluˉsion The assay of telomerase activity is significantly helpful to make differential diagnosis be
, 百拇医药
    tween benign and maligˉnant pleural fluids.It has higher diagnostic value than the assay of CEA and ADA,and be used as an adjunctive meaˉsure in the diagnosisof malignant pleural fluid.

    Key words malignant pleural fluid telomerase differential diagnosis CEA ADA

    胸水产生的病因很多,良、恶性胸水的鉴别至关重要,现有常规化验指标如癌胚抗原(CEA)、染色体和腺苷脱氨酶(ADA)仍不能满足需要,以致有部分胸水其良恶性难以鉴别,给临床诊断带来困难。端粒酶(Telomerase)是当前国际上肿瘤标志物最热门的研究课题之一 [1] 。1994年,Kim利用PCR技术建立了高敏感的TRAP(telomeric repeat ampliˉfication protocol)端粒酶活性检测技术 [2] ,现已广泛应用于恶性肿瘤的端粒酶活性研究。本研究应用TRAP方法结合聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法(PAGE)及酶联免疫吸附分析法(PCR-ELISA)两种方法检测了50例良、恶性胸水细胞标本中的端粒酶活性,并同时与测定的胸水CEA及ADA水平进行比较,旨在探讨端粒酶活性对良、恶性胸水鉴别的临床意义。
, 百拇医药
    1 资料与方法

    1.1 标本来源 标本均为2001年6月~2001年12月住院胸腔积液患者共50例,经行胸水细胞学和染色体检查,并结合胸膜活检、纤支镜、经皮肺穿刺及淋巴活检等各项病理学检查及随访分别确诊良、恶性。其中恶性胸水组30例,男16例,女14例。肺腺癌17例,肺鳞癌4例,肺小细胞癌1例,肝癌3例,卵巢粘液性癌1例,骨肉瘤1例,乙状结肠癌及胃癌各1例,不明来源腺癌1例。良性胸水组20例,男15例,女5例。其中结核性15例,心源性2例,肝硬化1例,类风湿性1例,淋巴结核致乳糜胸1例。所有标本采样前皆未行化疗及其他药物治疗。

    1.2 实验方法

    1.2.1 端粒酶活性检测

    1.2.1.1 标本处理 取新鲜胸水50ml,2000rpm10min,弃上清液;加入2ml4℃无菌生理去离子水,混匀,彻底破碎红细胞,2000rpm4℃10min离心弃上清液;以PBS液(pH7.4,4℃)洗2次后,以台盼蓝染色,血细胞计数器计数,取2×10 6 沉渣细胞于一新Eppendorf管,-80℃冻存集中检测。
, 百拇医药
    1.2.1.2 端粒酶提取 取细胞团于冰上融解加入200μl预冷的端粒酶裂解液,混匀,冰浴30min,4℃16000×g离心20min,小心移上清至新离心管内,-80℃冻存。

    1.2.1.3 TRAP-PCR反应 采用端粒酶TRAP-PCR ELISA试剂盒检测(ROCHE,CAT,NO.L854666)。阳性对照为有端粒酶表达的人肾细胞(293细胞)提取物(试剂盒自备),阴性对照为阳性对照提取物经65℃10min处理获得。总反应体系为50μl,共25μl反应混合缓冲液(含端粒酶底物、引物、核苷酸、Taq聚合酶、生物素标记的P1-TS引物和P1-TS引物和P2引物),3μl细胞提取液,22μl无菌水。置DNA扩增仪中,25℃引物延长30min,94℃5min端粒酶灭活2个循环,94℃30s、50℃30s、72℃90s,30个循环后终止反应。

    1.2.1.4 PCR产物检测 (1)聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法(PAGE):PCR产物5μl,加2μl上样缓冲液,经10%非变性聚丙烯酸胺凝胶垂直电泳(108V,1h)后,银染并照相,以出现间隔6pb梯形条带为端粒酶活性阳性。(2)光度酶联免疫法(ELISA):基本原理为PCR引物P1-TS含生物素,扩增产物与包被有亲和素的微孔板结合,并与含地高辛标记的探针杂交,过氧化物酶标记抗地高辛抗体与之结合,并以过氧化物酶反应底物(TMB)着色反应(具体步骤按试剂盒说明),以电脑酶标仪测定450nm和690nm的吸光度(A)值。吸收值差异(△A)高于0.2(A450nm~A690nm)为端粒酶活性阳性,否则为阴性。
, 百拇医药
    1.2.2 CEA测定 以化学发光法测定,试剂盒由德国BAYER CHIRON公司购入,具体操作见试剂盒。

    1.2.3 ADA测定 利用腺苷脱氨酶催化腺嘌呤核苷化解,产生次黄嘌呤核苷和氨,然后用波氏显色反应测定反应过程中产生的氨量,从而计算血清ADA活性单位。

    1.2.4 统计学方法 χ 2 检验、Youden指数。

    2 结果

    2.1 胸腔积液端粒酶活性检测结果

    2.1.1 端粒酶活性检测在良、恶性胸水间的比较

    2.1.1.1 TRAP-银染法(PAGE)检测 30例恶性胸水标本中端粒酶活性阳性24例(见图1),其阳性率为80%(24/30),其中腺癌14例,肺鳞癌3例,肺小细胞癌1例,肝癌2例,卵巢粘液性癌1例,骨肉瘤1例,乙状结肠癌1例,胃癌1例。20例良性胸水标本中,端粒酶活性阳性3例,其阳性率为15%(3/20),其中2例为结核性胸水,1例为肝硬化胸水。良、恶性组端粒酶活性检测阳性率相比差异有非常显著性(P<0.01,χ 2 =10.48,ν=1),见表1。表1 良、恶性胸水组端粒酶活性检测结果 注:良、恶性组阳性率相比 ˇ P<0.01 图1 良、恶性胸水端粒酶活性测定TRAP—银染法结果P为阳性,N为阴性,(+)阳性对照,(-)阴性对照
, http://www.100md.com
    2.1.1.2 TRAP-ELISA法检测 30例恶性胸水标本中端粒酶阳性26例(△A值0.201~3.377),其阳性率87%(26/30),其中腺癌14例,肺鳞癌4例,肺小细胞癌1例,肝癌3例,卵巢粘液性癌1例,骨肉瘤1例,乙状结肠癌1例,胃癌1例。端粒酶阴性4例(△A值<0.200)。20例良性胸水标本中,端粒酶阳性3例(△A值0.21~0.37),其阳性率为15%(3/20),与良性胸水端粒酶PAGE法阳性同标本,2例为结核性胸水,1例为肝硬化胸水。二者相比差异亦有非常显著性(P<0.01,χ 2 =12.11,ν=1),见表1。

    2.1.2 PAGE法和ELISA法的比较 进行端粒酶活性检测时,PAGE法恶性胸水阳性率80%,灵敏度80%,特异性85%;ELISA法恶性胸水阳性率87%,灵敏度87%,特异性85%。ELISA法阳性率、灵敏度略高于PAGE法阳性率,但两者阳性率相比差异无显著性(P>0.05)。且实验中发现ELISA法△A值越高,PAGE法电泳条带越清晰。
, http://www.100md.com
    2.2 胸水ADA、CEA检测结果 CEA在30例恶性胸水中18例为阳性,阳性率为60%(18/30),20例良性胸水中CEA阳性2例,阳性率10%(2/20)。良、恶性胸水阳性率比较差异有显著性(P<0.05,χ 2 =5.11,ν=1)。CEA特异性90%,灵敏度60%,见表2。

    ADA在30例恶性胸水中有17例为阳性,阳性率为57%(17/30),20例良性胸水中ADA阳性1例,阳性率5%(1/20)。良、恶性胸水阳性率相比差异有显著性(P<0.05,χ 2 =7.35,ν=1)。ADA特异性95%,灵敏度57%,见表2。表2 50例胸水ADA、CEA检测结果

    2.3 胸水端粒酶活性、CEA、ADA诊断效能的比较 端粒酶活性检测PAGE法灵敏度80%,特异性85%,诊断符合率82%,Youden指数J=0.65。ELISA法灵敏度87%,特异性85%,诊断符合率86%,Youden指数J=0.72。二者的综合判断指标:符合率、Youden指数J皆高于CEA和ADA(详见表3),说明端粒酶对恶性胸水诊断的有效性比ADA、CEA更高。其中ELISA法又略高于PAGE法,本实验中2例恶性胸水(肺鳞癌1例,肝癌1例)ELISA法阳性而PAGE法阴性。表3 胸水端粒酶、CEA、ADA诊断效能的比较
, 百拇医药
    3 讨论

    端粒(telomere)是染色体末端结构,对维持染色体的完整性和稳定性具有重要作用。端粒酶(telomerase)是一种核糖核酸蛋白酶,其活性增高可以自身RNA为模板,合成端粒,补偿细胞分裂时端粒的丢失,维持端粒长度,因而使细胞获得“不死性”,因此端粒酶活性增高在肿瘤发生发展中起重要作用 [3] 。迄今为止,在大多数人体肿瘤组织中均检测到了端粒酶活性,而在正常组织中或良性肿瘤组织中多为阴性 [4] ,因此它可能作为肿瘤诊断重要标记物。当恶性肿瘤细胞浸润胸膜,可脱落于胸水里混杂于间皮细胞及炎症细胞中,这就为检测胸水细胞的端粒酶活性,鉴别良、恶性胸水提供了可能。

    本研究应用TRAP法检测了50例良、恶性胸水,并分别以PAGE法和ELISA法检测扩增产物。30例恶性胸水中端粒酶活性升高,PAGE法占80%,ELISA法占87%,而良性胸水中升高为15%。良、恶性胸水之间阳性率差别有显著性,其敏感度80%,特异性88%,与最近国内外一些有关报道显示端粒酶活性测定恶性胸水其阳性率为75%~92%,而良性胸水阳性率为5.7%~15%大致相符 [5,6] 。表明端粒酶活性升高在良、恶性胸水有显著不同,对于临床鉴别诊断具有重要意义。PAGE法须银染后肉眼观察,可因背景染色过深或DNA片断少致条带分辨不清而误判。ELISA法以半定量检测较PAGE法更为敏感、客观。在恶性胸水中出现2例标本PAGE法阴性而ELISA法阳性可能就为上述因素。
, http://www.100md.com
    诊断符合率是真实的阳性数和阴性数与总数比例的综合判断,越接近100%,说明试验的结果与真实情况越相符。Youden指数J是误诊率和漏诊率的综合判断,J数值越接近1,说明试验的有效性越高。本研究端粒酶活性测定符合率、Youden指数都高于CEA和ADA。进一步表明端粒酶活性检测诊断效能高于CEA、ADA,可作为鉴别良、恶性 胸水的辅助手段,且优于CEA和ADA,三者联合应用能明显提高癌性胸水的确诊率。其中端粒酶活性检测ELISA法优于PAGE法。

    端粒酶TRAP方法须先以RNA为模板进行逆转录DNA后再扩增,因此反应过程中有诸多因素导致假阴性,假阳性。本实验有4例恶性胸水标本TRAP之后经PAGE法及ELISA法都未测出活性,可能与下列因素有关:(1)RNA酶的污染导致RNA模板降解。(2)标本中红细胞过多,未能完全处理,红细胞破坏后释放血红蛋白对Taq酶有抑制作用 [7] ,可抑制PCR扩增,导致假阴性。(3)端粒维持还存在除端粒酶以外的途径 [8] 。20例良性胸水中,检测到2例结核性及1例肝硬化胸水端粒酶活性呈阳性反应,这可能和胸水中炎性细胞可低水平表达端粒酶活性有关 [9] 。Branda和Hiyaman等也证实在胸水和良性组织有大量淋巴母细胞和淋巴细胞浸润时,可检出端粒酶活性,但只是低水平 [10,11] 。以上问题都须进一步探讨。
, 百拇医药
    总之,由本研究结果表明,临床上应用TRAP-PCR检测胸水中细胞端粒酶活性,对胸水良、恶性鉴别有一定帮助。

    参考文献

    1 Breslow RA,Shay JW,Gazdar AF,et al.Telomerase and early detection of cancer:a National cancer institute workshop.JNCI,1997,89:618.

    2 Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.specific association of human telomerase activity with immortal cell and cancer.Science,1994,266:2011-2015.

    3 Autexier C,Greider CW.Telomerase and cancer:revisiting the telomere hypothesis.Trends Biochem Sci,1996,21(10):387-391.
, 百拇医药
    4 Shy JW,Bacchetii S.A Survey of Telomerase Activity in Human Canˉcer.Eur Jof Cancer,1997,33:787.

    5 Cheng TY,Lee MH,Lan RS,et al.Telomerase activity in pleural effuˉsions:diagnostic significance,J Clin Oncol,1998,16:567-573.

    6 倪松石,冯健,王惠民.肺癌组织和癌性胸液细胞端粒酶活性测定.中华结核和呼吸杂志,2000,23(7):437.

    7 Yang CT,Lee MH,Lau RS,et al.Telomerase activity in pleural effuˉsion:diagnostic significance.J Clin Oncol,1998,16:567-573.
, 百拇医药
    8 Brgan TM,Englezou A,Gupta J,et al.Evidence for an alternative mechˉanism for maintaining telomere length in human tumors and tumor-deˉrived cell lines.Nat Med,1997,3:1271-1278.

    9 Couter CM,Gupta J,Harley CB,et al.Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies.Blood,1995,85:2315-2320.

    10 Branda TH,Sang CL,Elide M,et al.Telomerase is up-regulated in human germinal center B cells in vivo.T Immunol,1997,159:1068-1073.
, 百拇医药
    11 Hiyama E,Kodoma T,Shinbara K,et al.Telomerase activity is detected in pancreatic cancer but not in benign tumors.Cancer Res,1997,57(2):326-331.

    (收稿日期:2003-07-29)

    基金项目:江西省卫生厅重点招标资助项目(编号:2000-2003)

    作者单位:330006南昌江西医学院第二附属医院呼吸科

    (编 辑 于少伟), 百拇医药(叶小群)