X射线对不同辐射敏感性鼻咽癌细胞株细胞周期分布的影响
【摘要】 目的 探讨X线对不同辐射敏感性鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2)细胞周期分布的影响。方法 采用流式细胞仪检测不同X线剂量及照射后不同时间点CNE1、CNE2细胞周期的变化。结果 X线照射后，CNE1，辐射相对抗拒株，主要表现为G 2 期阻滞，且有时间剂量效应;CNE2，辐射相对敏感株，未见明显G 2 期阻滞;CNE1、CNE2均未见G 1 期阻滞。结论 鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2)内在的辐射敏感性的差异原因之一可能与其在经电离辐射后发生的G 2 期阻滞程度不同有关。
关键词 鼻咽癌细胞株 辐射敏感性 细胞周期 X线
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)20-1847-03
The effect of X-ray Irradiation on cell cycle of NPC cell
, http://www.100md.com
lines with different radiosensitivity
Wang Hongmei，Wu Xinyao，Xia Yunfei.
The Department of Forensic Medicine，Sun Yat-sen Medical University，Guangzhou510080.
【Abstract】 Objective To try to elucidate the effect of X-Ray irradiation on cell cycle of NPC cell lines(CNE1and CNE2)with different radiosensitivity.Methods Flow cytometry was used to observe the changes of phasˉes in CNE1and CNE2cell cycle at different time when the two cell lines were exposed to different dose of X-ray irˉradiation.Results In CNE1，which was more radioresistant to irradiation than CNE2，X-ray irradiation resulted in G 2 arrest in a time-dose-dependent manner，while in(NE)，there was no obvious G 2 arrest.No radiation-induced G 1 arrest wasdetected both in CNE1and in CNE2.Conclusion It indicates that one of causes of the different inherˉentradiosensitivity between NPC cell linesCNE1，CNE2may be related with their variant levels of ionizing radiation-induced G 2 arrest.
, 百拇医药
Key words nasopharyngeal carcinoma cell lines radiosensitivity cell cycle x-ray
随着分子生物学的发展，大量的研究表明，细胞周期调控是影响细胞辐射敏感性的主要决定因素之一 [1] 。鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2)均为p53突变株，我们已有的实验结果表明CNE2比CNE1对电离辐射更为敏感 [2] ，本研究的目的是从细胞周期角度探讨二者之间辐射敏感性差异的机制，为临床通过对细胞周期调控实现鼻咽癌辐射增敏提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 细胞系 人鼻咽癌细胞株(CNE1，CNE2)，由中山医科大学肿瘤研究所提供。用含10%小牛血清(杭州四季青公司)，RMPI-1640培养基(美国Gibco公司)，37℃，5%CO 2 培养箱常规贴壁培养。
, http://www.100md.com
1.2 实验方法
1.2.1 细胞照射 采用F24-1型深部X线机，照射条件:电压210kV，电流12mA，滤过板0.25mm Cu，半价层0.51mm Cu，限光筒大小为10cm×15cm，剂量率为100.71cGy/min。照射前由中山大学肿瘤防治中心放射物理室测量照射剂量率，并对玻璃培养瓶进行衰减校正。
1.2.2 细胞处理 未照射和2、5Gy X线照射后不同时间点收获细胞，经胰酶消化后PBS重悬，计数取1×10 6 细胞， 1500rpm离心收集，PBS洗3次，70%乙醇固定4℃过夜后，1500rpm离心去除固定液，用PBS洗2次，去上清后加入300μl DNA染液PI(含RNAase A)，避光，室温30min，细胞用400目网筛过滤后上机检测。
1.2.3 流式细胞仪检测 激光管预热30min后用荧光微球(美国BECKMAN-COULTER公司)调整仪器，使各放大器接收的信号的HCV值<2%，计算12000个细胞，DNA周期分析用美国PHEONIX公司的MULTYCYCLE软件，最后计算出细胞周期各期的百分数。
, 百拇医药
2 结果
2.1 照射对CNE1细胞周期分布的影响 将照射不同剂量的CNE1继续培养24h后收获，进行FCM检测，照射前后细胞DNA含量的变化，见图1。细胞未照射时G 2 期比例为19.8%，照射2Gy和5Gy后，G 2 期比例明显升高，分别为59.2%和90.4%。照射明显导致CNE1细胞G 2 期阻滞，阻滞的程度与照射后时间正相关，见图2、3。照射后未引起细胞G 1 期阻滞。
2.2 照射对CNE2细胞周期分布的影响 将照射不同剂量的CNE2继续培养24h后收获，进行FCM检测，照射前后细胞DNA含量的变化，见图4。细胞未照射时，G 2 期比例为14.3%，照射2Gy和5Gy后，G 2 期比例分别为20.8%和18.3%，即没有出现G 2 期阻滞。照射后不同时间点CNE2细胞周期没有明显改变，见图5、6。结果表明:照射后未引起细胞G 1 期阻滞。图1 照射对CNE1细胞周期分布的影响图2 2Gy照射后不同时间CNE1细胞的周期分布 图3 5Gy照射后不同时间CNE1细胞的周期分布图4 照射对CNE2细胞周期分布的影响图5 2Gy照射后不同时间CNE2细胞的周期分布 图6 5Gy照射后不同时间CNE2细胞的周期分布
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3 讨论
已有的研究表明，当在正常的细胞内存在DNA损伤时，G 1 /S及S期的检查点(checkpoint)阻止损伤了的DNA进入S期进行复制，这就避免了新合成的DNA将损伤固定下来;G 2 /M检查点则阻止细胞在其DNA损伤得到修复前进行分裂，可以避免错误的遗传信息进入子代细胞，以造成癌变的可能 [3] 。p53基因在人类细胞周期G 1 期检查点中的作用极其重要，化学药物或放射线引起的DNA损伤通过多种途径 将信号传递给p53基因，引起p53蛋白增高，并进一步启动p21基因转录，p21蛋白与cyclin D-CDK4/5、cyclinE-CDK2、cyclinA-CDK2等复合物结合，抑制CDK激活，引起G 1 期阻滞 [4～6] ;而p53基因突变的细胞在DNA受损时因不能启动G 1 期检查点，表现为G 2 期阻滞 [7] 。实验证实，C33-A，C4-I，CHO等p53突变或缺失的细胞被化学药物或放射线处理后，仅表现为G 2 期阻滞 [8～10] 。本实验所用细胞CNE1、CNE2，二者均为p53基因突变的细胞株，在照射后无G 1 期阻滞的现象，与文献报道一致。但在对辐射相对抗拒的CNE1细胞在X线照射后出现明显的G 2 期阻滞，而在对辐射相对敏感的CNE2细胞在X线照射后细胞周期变化不明显。有报道认为，细胞的辐射敏感性与G 2 期阻滞有关，G 2 期阻滞的长短与照射后残留的未被修复的DNA损伤程度成正比 [11，12] 。我们推测，在CNE2细胞中存在某种机制，妨碍了其在X线照射后G 2 期阻滞的发生，这样含DNA损伤的CNE2细胞在DNA损伤未得到修复的情况下进入了细胞分裂期，导致细胞的增殖性死亡增加，使得CNE2比CNE1对电离辐射更加敏感。
, http://www.100md.com
在所有肿瘤细胞中，50%以上有p53基因功能缺陷，对于这些肿瘤细胞，去除G 2 期阻滞，理论上可以增加细胞的辐射敏感性。目前最常用于去除细胞周期的药物有两大类:咖啡因类如咖啡因或己酮可可碱(pentoxcifylline，PTX)和Staurosporine类如UCN-01(7-hydroxystauro-sporine)，其作用机制均与去除G 2 期阻滞有关 [13] 。本文的实验结果表明虽然同是p53突变鼻咽癌细胞株，但在X线照射后细胞周期的变化完全不同，提示我们如果盲目使用去除细胞周期药物治疗CNE2类没有明显G 2 期阻滞的肿瘤细胞，可能不能获得预期疗效。
参考文献
1 Lei Li，Michael S，Randy JL.Cellular responses to ionizing radiation damˉage.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2001，49:1157-1162.
, 百拇医药
2 Xia Yun-fei，LI Man-zhi，Huang Bing，et al.Cellular radiobiological characteristics of human nasopharyngeal carcinoma cell lines.Chinese Journal of Cancer，2001，20:683-687.
3 Hartwell LH，Kastan MB.Cell cycle control and cancer.Science，1994，266:1821-1828.
4 Mazurik VK，Moroz BB.Problems of radiobiology and p53protein.Radiats Biol Radiooncol，2001，41:548-572.
5 McIlwrath AJ，Vasey PA，Ross GM，et al.Cell cycle arrests and radiosenˉsitivity of human tumor cell lines:dependence on wild-type p53for raˉdiosensitivity.Cancer Res，1994，54:3718-3822.
, 百拇医药
6 Pellegata NS，Antoniono RJ，Redpath JL，et al.DNA damage and p53-mediated cell cycle arrest:a reevaluation.Cell Biol，1996，93:15209-15214.
7 Taylor WR，Stark GR.Regulation of the G2/M transition by p53.Oncoˉgene，2001，20:1803-1815.
9 Li YX，Weber-Jonson K，Son LQ，et al.Effect of pentoxifylline on radiaˉtion induced G2delay and radiosensitivity of human colon and cervical cancer cells.Radiat Res，1998，149:338-342.
, 百拇医药
10 Bunch RT，Easstman A.7-Hydroxystaurosprine(UCN-01)causes reˉdistribution of proliferation cell nuclear antigen and abrogates ciplantin-induced S-phasearrest in Chinese hamster ovary cells.Cell Growth Differ，1997，8:779-788.
11 Warenius HM，Jones MD，Thompson CCM.Exit form G2phase after2Gy gamma irradiation is faster in radiosensitive human cells with high exˉpression of RAF1proto-oncogene.Radiat Res，1996，146:485-493.
12 Schwartz JL，Cowan J，Grdina DJ，et al.Attenuation of G2-phase cell cycle checkpoint control is associated with increased frequencies of unreˉjoined chromosome breaks in human tumor cells.Radiat Res，1996，146:139-143.
, 百拇医药
13 Hui ZG，Li YX，Yang WZ，et al.Abrogation of radiation-induced G2arrest and radiosensitization by7-hydroxystaurosporine(UCN-01)in human nasopharyngeal carcinoma cell line.Chinese Journal of Cancer，2003，22:6-10.
基金项目:本课题受国家自然科学基金资助(编号:30070237)
作者单位:1 510080广州中山大学中山医学院法医物证教研室
2 510080广州中山大学肿瘤防治中心
(编辑 花楹), http://www.100md.com(王宏梅 伍新尧 夏云飞)
关键词 鼻咽癌细胞株 辐射敏感性 细胞周期 X线
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)20-1847-03
The effect of X-ray Irradiation on cell cycle of NPC cell
, http://www.100md.com
lines with different radiosensitivity
Wang Hongmei，Wu Xinyao，Xia Yunfei.
The Department of Forensic Medicine，Sun Yat-sen Medical University，Guangzhou510080.
【Abstract】 Objective To try to elucidate the effect of X-Ray irradiation on cell cycle of NPC cell lines(CNE1and CNE2)with different radiosensitivity.Methods Flow cytometry was used to observe the changes of phasˉes in CNE1and CNE2cell cycle at different time when the two cell lines were exposed to different dose of X-ray irˉradiation.Results In CNE1，which was more radioresistant to irradiation than CNE2，X-ray irradiation resulted in G 2 arrest in a time-dose-dependent manner，while in(NE)，there was no obvious G 2 arrest.No radiation-induced G 1 arrest wasdetected both in CNE1and in CNE2.Conclusion It indicates that one of causes of the different inherˉentradiosensitivity between NPC cell linesCNE1，CNE2may be related with their variant levels of ionizing radiation-induced G 2 arrest.
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Key words nasopharyngeal carcinoma cell lines radiosensitivity cell cycle x-ray
随着分子生物学的发展，大量的研究表明，细胞周期调控是影响细胞辐射敏感性的主要决定因素之一 [1] 。鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2)均为p53突变株，我们已有的实验结果表明CNE2比CNE1对电离辐射更为敏感 [2] ，本研究的目的是从细胞周期角度探讨二者之间辐射敏感性差异的机制，为临床通过对细胞周期调控实现鼻咽癌辐射增敏提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 细胞系 人鼻咽癌细胞株(CNE1，CNE2)，由中山医科大学肿瘤研究所提供。用含10%小牛血清(杭州四季青公司)，RMPI-1640培养基(美国Gibco公司)，37℃，5%CO 2 培养箱常规贴壁培养。
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1.2 实验方法
1.2.1 细胞照射 采用F24-1型深部X线机，照射条件:电压210kV，电流12mA，滤过板0.25mm Cu，半价层0.51mm Cu，限光筒大小为10cm×15cm，剂量率为100.71cGy/min。照射前由中山大学肿瘤防治中心放射物理室测量照射剂量率，并对玻璃培养瓶进行衰减校正。
1.2.2 细胞处理 未照射和2、5Gy X线照射后不同时间点收获细胞，经胰酶消化后PBS重悬，计数取1×10 6 细胞， 1500rpm离心收集，PBS洗3次，70%乙醇固定4℃过夜后，1500rpm离心去除固定液，用PBS洗2次，去上清后加入300μl DNA染液PI(含RNAase A)，避光，室温30min，细胞用400目网筛过滤后上机检测。
1.2.3 流式细胞仪检测 激光管预热30min后用荧光微球(美国BECKMAN-COULTER公司)调整仪器，使各放大器接收的信号的HCV值<2%，计算12000个细胞，DNA周期分析用美国PHEONIX公司的MULTYCYCLE软件，最后计算出细胞周期各期的百分数。
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2 结果
2.1 照射对CNE1细胞周期分布的影响 将照射不同剂量的CNE1继续培养24h后收获，进行FCM检测，照射前后细胞DNA含量的变化，见图1。细胞未照射时G 2 期比例为19.8%，照射2Gy和5Gy后，G 2 期比例明显升高，分别为59.2%和90.4%。照射明显导致CNE1细胞G 2 期阻滞，阻滞的程度与照射后时间正相关，见图2、3。照射后未引起细胞G 1 期阻滞。
2.2 照射对CNE2细胞周期分布的影响 将照射不同剂量的CNE2继续培养24h后收获，进行FCM检测，照射前后细胞DNA含量的变化，见图4。细胞未照射时，G 2 期比例为14.3%，照射2Gy和5Gy后，G 2 期比例分别为20.8%和18.3%，即没有出现G 2 期阻滞。照射后不同时间点CNE2细胞周期没有明显改变，见图5、6。结果表明:照射后未引起细胞G 1 期阻滞。图1 照射对CNE1细胞周期分布的影响图2 2Gy照射后不同时间CNE1细胞的周期分布 图3 5Gy照射后不同时间CNE1细胞的周期分布图4 照射对CNE2细胞周期分布的影响图5 2Gy照射后不同时间CNE2细胞的周期分布 图6 5Gy照射后不同时间CNE2细胞的周期分布
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3 讨论
已有的研究表明，当在正常的细胞内存在DNA损伤时，G 1 /S及S期的检查点(checkpoint)阻止损伤了的DNA进入S期进行复制，这就避免了新合成的DNA将损伤固定下来;G 2 /M检查点则阻止细胞在其DNA损伤得到修复前进行分裂，可以避免错误的遗传信息进入子代细胞，以造成癌变的可能 [3] 。p53基因在人类细胞周期G 1 期检查点中的作用极其重要，化学药物或放射线引起的DNA损伤通过多种途径 将信号传递给p53基因，引起p53蛋白增高，并进一步启动p21基因转录，p21蛋白与cyclin D-CDK4/5、cyclinE-CDK2、cyclinA-CDK2等复合物结合，抑制CDK激活，引起G 1 期阻滞 [4～6] ;而p53基因突变的细胞在DNA受损时因不能启动G 1 期检查点，表现为G 2 期阻滞 [7] 。实验证实，C33-A，C4-I，CHO等p53突变或缺失的细胞被化学药物或放射线处理后，仅表现为G 2 期阻滞 [8～10] 。本实验所用细胞CNE1、CNE2，二者均为p53基因突变的细胞株，在照射后无G 1 期阻滞的现象，与文献报道一致。但在对辐射相对抗拒的CNE1细胞在X线照射后出现明显的G 2 期阻滞，而在对辐射相对敏感的CNE2细胞在X线照射后细胞周期变化不明显。有报道认为，细胞的辐射敏感性与G 2 期阻滞有关，G 2 期阻滞的长短与照射后残留的未被修复的DNA损伤程度成正比 [11，12] 。我们推测，在CNE2细胞中存在某种机制，妨碍了其在X线照射后G 2 期阻滞的发生，这样含DNA损伤的CNE2细胞在DNA损伤未得到修复的情况下进入了细胞分裂期，导致细胞的增殖性死亡增加，使得CNE2比CNE1对电离辐射更加敏感。
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在所有肿瘤细胞中，50%以上有p53基因功能缺陷，对于这些肿瘤细胞，去除G 2 期阻滞，理论上可以增加细胞的辐射敏感性。目前最常用于去除细胞周期的药物有两大类:咖啡因类如咖啡因或己酮可可碱(pentoxcifylline，PTX)和Staurosporine类如UCN-01(7-hydroxystauro-sporine)，其作用机制均与去除G 2 期阻滞有关 [13] 。本文的实验结果表明虽然同是p53突变鼻咽癌细胞株，但在X线照射后细胞周期的变化完全不同，提示我们如果盲目使用去除细胞周期药物治疗CNE2类没有明显G 2 期阻滞的肿瘤细胞，可能不能获得预期疗效。
参考文献
1 Lei Li，Michael S，Randy JL.Cellular responses to ionizing radiation damˉage.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2001，49:1157-1162.
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2 Xia Yun-fei，LI Man-zhi，Huang Bing，et al.Cellular radiobiological characteristics of human nasopharyngeal carcinoma cell lines.Chinese Journal of Cancer，2001，20:683-687.
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9 Li YX，Weber-Jonson K，Son LQ，et al.Effect of pentoxifylline on radiaˉtion induced G2delay and radiosensitivity of human colon and cervical cancer cells.Radiat Res，1998，149:338-342.
, 百拇医药
10 Bunch RT，Easstman A.7-Hydroxystaurosprine(UCN-01)causes reˉdistribution of proliferation cell nuclear antigen and abrogates ciplantin-induced S-phasearrest in Chinese hamster ovary cells.Cell Growth Differ，1997，8:779-788.
11 Warenius HM，Jones MD，Thompson CCM.Exit form G2phase after2Gy gamma irradiation is faster in radiosensitive human cells with high exˉpression of RAF1proto-oncogene.Radiat Res，1996，146:485-493.
12 Schwartz JL，Cowan J，Grdina DJ，et al.Attenuation of G2-phase cell cycle checkpoint control is associated with increased frequencies of unreˉjoined chromosome breaks in human tumor cells.Radiat Res，1996，146:139-143.
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13 Hui ZG，Li YX，Yang WZ，et al.Abrogation of radiation-induced G2arrest and radiosensitization by7-hydroxystaurosporine(UCN-01)in human nasopharyngeal carcinoma cell line.Chinese Journal of Cancer，2003，22:6-10.
基金项目:本课题受国家自然科学基金资助(编号:30070237)
作者单位:1 510080广州中山大学中山医学院法医物证教研室
2 510080广州中山大学肿瘤防治中心
(编辑 花楹), http://www.100md.com(王宏梅 伍新尧 夏云飞)