胃癌前病变和胃癌组织中TGF-β1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的表达
http://www.100md.com
中华现代中西医杂志 2003年4月
【摘要】 目的 探讨TGF-β(转化生长因子-β)信号转导通路中TGF-β 1 、TGF-βRⅡ(转化生长因子-βⅡ型受体)和Smad4蛋白与胃癌发生发展的关系。方法 106例标本包括正常胃粘膜20例、肠上皮化生20例、不典型增生20例以及胃癌46例，通过免疫组化方法检测TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的表达。结果 TGF-β 1 阳性率在不典型增生组明显高于正常组，胃癌组显著高于其他三组(P<0.05，P<0.01);TGF-βRⅡ和Smad4蛋白在胃癌组阳性率均显著低于正常组(P<0.01，P<0.01)。结论 对胃粘膜TGF-β 1 的检测可能有助于胃癌的早期发现;TGF-β信号转导通路中不仅存在TGF-βRⅡ表达低下还存在受体后Smad4蛋白表达低下，TGF-β 1 高表达与TGF-βRⅡ和Smad4蛋白低表达与胃癌的发生发展密切相关。
关键词 胃癌前病变 胃癌 转化生长因子-β 1 转化生长因子-βⅡ型受体 Smad4
【文献标识码】A 【文章编号】 1726-6424(2003)01-0006-03
, http://www.100md.com
The expression of TGF-β 1 、TGF-βRⅡand Smad4protein in precancerous lesions and gastric cancer
Shi Yingying，Zhang Manli.
Department of Gastroenterology，People’s Hospital，Hebei050051.
【Abstract】 Objective To study the function of TGF-β 1 ，TGF-βRⅡand Smad4protein which belong to TGF-βsignal passway in the carcinogenesis and development of gastric cancer.Methods The expression of TGF-β 1 ，TGF-βRⅡand Smad4protein were determined by immunohistochemistry in mormal gastric mucosa(20cases)，intestinal metaplasia(20cases)，dysplasia(20cases)and gastric carcinoma(46cases).Results The positive staining rates of TGF-β 1 was higher in dysplasiathan that in normal gastric mucosa，it was even higher in cancer than that in dysplasia(P<0.05，P<0.01).There was a much lower positivity rate of TGF-βRⅡand Smad4protein in gastric cancer than that in normal gastric mucosa(P<0.01，P<0.01).Conclusion There exist not only the abnormal expression of TGF-βRⅡbut the Smad4protein in TGF-βsignal passway.The higher expression of TGF-β 1 and thelower expression of TGF-βRⅡand Smad4inGC gropu are involved in the carcinogenesis and development of gastric cancer.Key words precancerous lesions gastric cancer transforming growth factor-β 1transforming growth factor-βreceptorⅡ Smad4
, 百拇医药
TGF-β是为数不多的具有负生长调控功能的细胞因子之一，许多实验表明TGF-β与肿瘤的发生、演进关系密切。本研究通过对胃癌前病变和胃癌组织中TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的检测，探讨TGF-β信号传导通路失活与胃癌发生发展的关系。
1 材料与方法
1.1 标本选择 1999～2002年间广州第一军医大学南方医院经手术切除或内镜活检的标本106例。其中正常胃粘膜20例，肠上皮化生20例、不典型增生20例、胃癌46例。所有病例均经病理学证实，所 有胃癌患者术前均未行放、化疗及生物学治疗。
1.2 试剂 TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4多克隆抗体及SABC试剂盒均购自武汉博士德公司。
1.3 免疫组化染色 采用SABC法，常规脱蜡至水，滴加3%过氧化氢20min以抑制内源性过氧化物酶，PBS冲洗，正常羊血清封闭非特异性抗原20min，倾去后滴加一抗，4℃湿盒内孵育过夜，PBS洗5min3次，滴加二抗(生物素标记)室温30min，PBS洗5min3次，滴加SABC，室温
, 百拇医药
20min，PBS洗5min3次，DAB显色液显色3～10min，自来水冲洗，苏木精复染，梯度酒精脱水二甲苯透明，封片观察。PBS液代替一抗作阴性对照，乳腺癌组织标本作阳性对照。
1.4 结果判定 以胞浆和(或)胞膜、胞浆和(或)胞核出现棕黄或棕褐色物质为阳性细胞。阳性组:切片中癌细胞显色且显色的癌细胞占全部癌细胞25%或以上者;阴性组:切片中癌组织不显色或显色的癌细胞占全部癌细胞的25%以下者。1.5 统计学分析 各组间蛋白阳性表达率的差异性经X 2 检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 免疫组化染色 TGF-β 1 阳性反应物位于胞浆内，在正常胃粘膜，TGF-β 1 阳性细胞较少，着色均匀;癌组织中，TGF-β 1 在胞浆内着色不均，呈棕褐色，颗粒状。TGF-βRⅡ阳性反应物位于胞浆和(或)胞膜，正常胃粘膜TGF-βRⅡ呈弥漫或颗粒状染色;癌组织中TGF-βRⅡ表达较正常组织明显减弱甚至无表达。Smad4蛋白阳性反应物位于胞浆和(或)胞核，正常胃粘膜Smad4蛋白在胞浆和胞核中均有染色;癌组织中Smad4蛋白阳性染色较正常组织明显减弱甚至缺失，且阳性细胞胞核染色罕见。
, 百拇医药
2.2 TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的表达TGF-β 1 阳性率随胃粘膜恶性程度增高而增高，不典型增生组即明显高于正常组(P<0.05)，胃癌组显著高于其他三组(P<0.01);TGF-βRⅡ和Smad4蛋白在胃癌组中阳性率均显著低于正常组(P<0.01，P<0.01)，见表1。
2.3 胃癌组中TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白表达的关系 胃癌组TGF-β 1 阳性标本的TGF-βRⅡ阳性率和Smad4阳性率显著低于GF-β 1 阴性标本的TGF-βRⅡ和Smad4阳性率(P<0.01，P<0.01)，见表2。
表1 TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的表达 例(略)
注:与正常胃粘膜相比，ˇP<0.05; ˇˇ P<0.01。
表2 胃癌组织中TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白阳性表达的关系
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3 讨论
TGF-β是为数不多的具有负调控生长功能的细胞因子之一，它可通过阻止G 1 期细胞进入S期而使许多上皮细胞生长发生停滞[1]。我们的研究发现，TGF-β 1 阳性率随胃粘膜恶性程度增高而增高，不典型增生组即明显高于正常组，提示TGF-β 1 在细胞内表达增加可能是胃癌形成早期的一个生物学征象，对胃粘膜TGF-β 1 的检测可能有助于胃癌的早期发现。有学者认为肿瘤形成阶段细胞自分泌TGF-β 1 可抑制细胞生长和恶性转化，因此TGF-β 1 可能是肿瘤早期发生的一个保护性标志物[2] 。但Ebert认为TGF-β 1 高表达可能是胃癌发生的危险因素之一 [3] ，故TGF-β 1 在胃癌形成前阶段高表达的作用和意义有待进一步探讨。胃癌组TGF-β 1 阳性率显著高于其他三组，提示TGF-β 1 表达的增加并没有发挥其生长抑制作用，胃癌组织可能通过某种途径逃逸了TGF-β的生长抑制作用。
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TGF-β的生长抑制作用是通过其信号转导通路完成的。其信号转导机制为:TGF-β首先与其受体(Ⅰ、Ⅱ型)结合，形成TGF-βRⅡ-TGF-β-TGF-βRⅠ复合物，该复合物可活化下游的Smad2、Smad3蛋白，活化的Smad2、Smad3与Smad4结合后形成转录复合物才能进入细胞核，并与核酸转录因子及靶基因启动子结合调节靶基因的转录，发挥普遍的生长抑制效应。研究发现TGF-βR尤其是GF-βRⅡ基因突变致TGF-βRⅡ蛋白表达的缺失或功能失活是TGF-β信号中断的重要原因之一 [4] 。本研究表明TGF-βRⅡ在胃癌组中的阳性表达率显著降低，与官国先的研究结果一致 [5] ，提示由于细胞丧失功能性TGF-βRⅡ，从而使TGF-β抑制信号不能进入细胞内，可能与胃癌的形成密切相关。
随着Smad蛋白家族的发现，对TGF-β的信号通路取得了突破性进展，并发现某些恶性肿瘤不仅存在TGF-βRⅡ的表达异常，还同时存在Smad蛋白异常，其中最常见的就是Smad4 [6] 。Smad4基因位于染色体18q21.1，Smad4蛋白的功能是作为受体后信号通路的中心环节与其他Smad蛋白一起参与TGF-β细胞内信号传导。Xu等的动物实验观察到Smad4杂合性缺失可促进胃息肉形成并逐渐发展成癌，提示Smad4是胃部的一个重要肿瘤抑制基因 [7] 。本实验观察到正常、肠化和不典型增生的胃粘膜细胞中可见胞浆和胞核均有Smad4蛋白染色，提示这些组织中存在Smad4的核转位，而表达阳性的胃癌细胞则罕见有核染色，提示Smad4核转位受阻。Smad4蛋白阳性率在胃癌组显著降低，表明其低表达与胃癌的发生发展有关，提示TGF-β信号通路不仅存在受体水平的缺陷还存在受体后Smad4蛋白的异常，此发现为胃癌的发病、演进机制和防治途径提供了新的理论依据。
, 百拇医药
我们还发现胃癌组织中TGF-β 1 阳性标本的TGF-βRⅡ阳性率和Smad4阳性率均明显低于TGF-β 1 阴性表达的TGF-βRⅡ和Smad4阳性率，提示胃癌中TGF-β 1 高表达可能与TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的低表达有关，后二者表达低下提示TGF-β抑制信号传导的阻断，这种阻断作用可能同时还是胃癌TGF-β 1 高表达的原因:由于胃癌细胞失去了对TGF-β 1 的敏感性，最终引起TGF-β 1 的负反馈调节而致TGF-β 1 表达过度。此时胃癌细胞自分泌的TGF-β 1对癌细胞本身的生长抑制效应已不起主要作用，而TGF-β 1 其他生理功能的发挥则间接促进了癌细胞的生长，如作用于邻近其细胞分泌较多的细胞外基质或其他因子;促进癌组织周围血管形成间接促进癌细胞浸润和转移;抑制淋巴细胞的增殖和免疫功能，也利于癌细胞逃逸免疫监视机制而 增殖 [8] 。
参考文献
1 Alexandrow MG，Moses HL.Transforming growth factorβand cell cycle regulation.Cancer Res，1995，55(7):1452-1457.
, http://www.100md.com
2 邓登豪，罗金燕，朱海杭，等.食管癌和异型增生中TGF-β 1 表达的意义.新消化病学杂志，1997，5(7):475.
3 Ebert MP，Yu J，Miehlke S，et al.Expression of transforming growth factorβ-1in gastric cancer and in the gastric mucosa of first-degree relation of patients with gastric cancer.Br J Cancer，2000，82(11):1795-1800.
4 Shinmura K，Tani M，Isogaki J，et al.RER phenotype and its associated mutations in familial gastric cancer.Carcinogenesis，1998，19(2):247-251.
, http://www.100md.com
5 官国先，张祥福，杨发瑞.转化生长因子βⅡ型受体在胃癌组织中表达水平与侵袭、转移的相关性研究.肿瘤，1999，19(4):216-219.
6 Xie W，Mertens JC，Reiss DJ，et al.Alterations of Smad signaling in huˉman breast carcinoma are associated with porr outcome:a tissue microarray study.Cancer Res，2002，62(2):497-505.
7 Xu X，Brodie SG，Yang X，et al.Haploid loss of the suppressor Smad4/DPC4initiates gastric polyposis and cancer in mice.Oncogene，2000，19(15):1868-1874.
8 萧树东.消化病学新理论与新技术.上海:上海科技教育出版社，1999，97-106.
(收稿日期:2003-04-20)
作者单位:050051河北省人民医院消化内科
(编辑晓 亮), 百拇医药(施英瑛)
关键词 胃癌前病变 胃癌 转化生长因子-β 1 转化生长因子-βⅡ型受体 Smad4
【文献标识码】A 【文章编号】 1726-6424(2003)01-0006-03
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The expression of TGF-β 1 、TGF-βRⅡand Smad4protein in precancerous lesions and gastric cancer
Shi Yingying，Zhang Manli.
Department of Gastroenterology，People’s Hospital，Hebei050051.
【Abstract】 Objective To study the function of TGF-β 1 ，TGF-βRⅡand Smad4protein which belong to TGF-βsignal passway in the carcinogenesis and development of gastric cancer.Methods The expression of TGF-β 1 ，TGF-βRⅡand Smad4protein were determined by immunohistochemistry in mormal gastric mucosa(20cases)，intestinal metaplasia(20cases)，dysplasia(20cases)and gastric carcinoma(46cases).Results The positive staining rates of TGF-β 1 was higher in dysplasiathan that in normal gastric mucosa，it was even higher in cancer than that in dysplasia(P<0.05，P<0.01).There was a much lower positivity rate of TGF-βRⅡand Smad4protein in gastric cancer than that in normal gastric mucosa(P<0.01，P<0.01).Conclusion There exist not only the abnormal expression of TGF-βRⅡbut the Smad4protein in TGF-βsignal passway.The higher expression of TGF-β 1 and thelower expression of TGF-βRⅡand Smad4inGC gropu are involved in the carcinogenesis and development of gastric cancer.Key words precancerous lesions gastric cancer transforming growth factor-β 1transforming growth factor-βreceptorⅡ Smad4
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TGF-β是为数不多的具有负生长调控功能的细胞因子之一，许多实验表明TGF-β与肿瘤的发生、演进关系密切。本研究通过对胃癌前病变和胃癌组织中TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的检测，探讨TGF-β信号传导通路失活与胃癌发生发展的关系。
1 材料与方法
1.1 标本选择 1999～2002年间广州第一军医大学南方医院经手术切除或内镜活检的标本106例。其中正常胃粘膜20例，肠上皮化生20例、不典型增生20例、胃癌46例。所有病例均经病理学证实，所 有胃癌患者术前均未行放、化疗及生物学治疗。
1.2 试剂 TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4多克隆抗体及SABC试剂盒均购自武汉博士德公司。
1.3 免疫组化染色 采用SABC法，常规脱蜡至水，滴加3%过氧化氢20min以抑制内源性过氧化物酶，PBS冲洗，正常羊血清封闭非特异性抗原20min，倾去后滴加一抗，4℃湿盒内孵育过夜，PBS洗5min3次，滴加二抗(生物素标记)室温30min，PBS洗5min3次，滴加SABC，室温
, 百拇医药
20min，PBS洗5min3次，DAB显色液显色3～10min，自来水冲洗，苏木精复染，梯度酒精脱水二甲苯透明，封片观察。PBS液代替一抗作阴性对照，乳腺癌组织标本作阳性对照。
1.4 结果判定 以胞浆和(或)胞膜、胞浆和(或)胞核出现棕黄或棕褐色物质为阳性细胞。阳性组:切片中癌细胞显色且显色的癌细胞占全部癌细胞25%或以上者;阴性组:切片中癌组织不显色或显色的癌细胞占全部癌细胞的25%以下者。1.5 统计学分析 各组间蛋白阳性表达率的差异性经X 2 检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 免疫组化染色 TGF-β 1 阳性反应物位于胞浆内，在正常胃粘膜，TGF-β 1 阳性细胞较少，着色均匀;癌组织中，TGF-β 1 在胞浆内着色不均，呈棕褐色，颗粒状。TGF-βRⅡ阳性反应物位于胞浆和(或)胞膜，正常胃粘膜TGF-βRⅡ呈弥漫或颗粒状染色;癌组织中TGF-βRⅡ表达较正常组织明显减弱甚至无表达。Smad4蛋白阳性反应物位于胞浆和(或)胞核，正常胃粘膜Smad4蛋白在胞浆和胞核中均有染色;癌组织中Smad4蛋白阳性染色较正常组织明显减弱甚至缺失，且阳性细胞胞核染色罕见。
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2.2 TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的表达TGF-β 1 阳性率随胃粘膜恶性程度增高而增高，不典型增生组即明显高于正常组(P<0.05)，胃癌组显著高于其他三组(P<0.01);TGF-βRⅡ和Smad4蛋白在胃癌组中阳性率均显著低于正常组(P<0.01，P<0.01)，见表1。
2.3 胃癌组中TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白表达的关系 胃癌组TGF-β 1 阳性标本的TGF-βRⅡ阳性率和Smad4阳性率显著低于GF-β 1 阴性标本的TGF-βRⅡ和Smad4阳性率(P<0.01，P<0.01)，见表2。
表1 TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的表达 例(略)
注:与正常胃粘膜相比，ˇP<0.05; ˇˇ P<0.01。
表2 胃癌组织中TGF-β 1 、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白阳性表达的关系
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3 讨论
TGF-β是为数不多的具有负调控生长功能的细胞因子之一，它可通过阻止G 1 期细胞进入S期而使许多上皮细胞生长发生停滞[1]。我们的研究发现，TGF-β 1 阳性率随胃粘膜恶性程度增高而增高，不典型增生组即明显高于正常组，提示TGF-β 1 在细胞内表达增加可能是胃癌形成早期的一个生物学征象，对胃粘膜TGF-β 1 的检测可能有助于胃癌的早期发现。有学者认为肿瘤形成阶段细胞自分泌TGF-β 1 可抑制细胞生长和恶性转化，因此TGF-β 1 可能是肿瘤早期发生的一个保护性标志物[2] 。但Ebert认为TGF-β 1 高表达可能是胃癌发生的危险因素之一 [3] ，故TGF-β 1 在胃癌形成前阶段高表达的作用和意义有待进一步探讨。胃癌组TGF-β 1 阳性率显著高于其他三组，提示TGF-β 1 表达的增加并没有发挥其生长抑制作用，胃癌组织可能通过某种途径逃逸了TGF-β的生长抑制作用。
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TGF-β的生长抑制作用是通过其信号转导通路完成的。其信号转导机制为:TGF-β首先与其受体(Ⅰ、Ⅱ型)结合，形成TGF-βRⅡ-TGF-β-TGF-βRⅠ复合物，该复合物可活化下游的Smad2、Smad3蛋白，活化的Smad2、Smad3与Smad4结合后形成转录复合物才能进入细胞核，并与核酸转录因子及靶基因启动子结合调节靶基因的转录，发挥普遍的生长抑制效应。研究发现TGF-βR尤其是GF-βRⅡ基因突变致TGF-βRⅡ蛋白表达的缺失或功能失活是TGF-β信号中断的重要原因之一 [4] 。本研究表明TGF-βRⅡ在胃癌组中的阳性表达率显著降低，与官国先的研究结果一致 [5] ，提示由于细胞丧失功能性TGF-βRⅡ，从而使TGF-β抑制信号不能进入细胞内，可能与胃癌的形成密切相关。
随着Smad蛋白家族的发现，对TGF-β的信号通路取得了突破性进展，并发现某些恶性肿瘤不仅存在TGF-βRⅡ的表达异常，还同时存在Smad蛋白异常，其中最常见的就是Smad4 [6] 。Smad4基因位于染色体18q21.1，Smad4蛋白的功能是作为受体后信号通路的中心环节与其他Smad蛋白一起参与TGF-β细胞内信号传导。Xu等的动物实验观察到Smad4杂合性缺失可促进胃息肉形成并逐渐发展成癌，提示Smad4是胃部的一个重要肿瘤抑制基因 [7] 。本实验观察到正常、肠化和不典型增生的胃粘膜细胞中可见胞浆和胞核均有Smad4蛋白染色，提示这些组织中存在Smad4的核转位，而表达阳性的胃癌细胞则罕见有核染色，提示Smad4核转位受阻。Smad4蛋白阳性率在胃癌组显著降低，表明其低表达与胃癌的发生发展有关，提示TGF-β信号通路不仅存在受体水平的缺陷还存在受体后Smad4蛋白的异常，此发现为胃癌的发病、演进机制和防治途径提供了新的理论依据。
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我们还发现胃癌组织中TGF-β 1 阳性标本的TGF-βRⅡ阳性率和Smad4阳性率均明显低于TGF-β 1 阴性表达的TGF-βRⅡ和Smad4阳性率，提示胃癌中TGF-β 1 高表达可能与TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的低表达有关，后二者表达低下提示TGF-β抑制信号传导的阻断，这种阻断作用可能同时还是胃癌TGF-β 1 高表达的原因:由于胃癌细胞失去了对TGF-β 1 的敏感性，最终引起TGF-β 1 的负反馈调节而致TGF-β 1 表达过度。此时胃癌细胞自分泌的TGF-β 1对癌细胞本身的生长抑制效应已不起主要作用，而TGF-β 1 其他生理功能的发挥则间接促进了癌细胞的生长，如作用于邻近其细胞分泌较多的细胞外基质或其他因子;促进癌组织周围血管形成间接促进癌细胞浸润和转移;抑制淋巴细胞的增殖和免疫功能，也利于癌细胞逃逸免疫监视机制而 增殖 [8] 。
参考文献
1 Alexandrow MG，Moses HL.Transforming growth factorβand cell cycle regulation.Cancer Res，1995，55(7):1452-1457.
, http://www.100md.com
2 邓登豪，罗金燕，朱海杭，等.食管癌和异型增生中TGF-β 1 表达的意义.新消化病学杂志，1997，5(7):475.
3 Ebert MP，Yu J，Miehlke S，et al.Expression of transforming growth factorβ-1in gastric cancer and in the gastric mucosa of first-degree relation of patients with gastric cancer.Br J Cancer，2000，82(11):1795-1800.
4 Shinmura K，Tani M，Isogaki J，et al.RER phenotype and its associated mutations in familial gastric cancer.Carcinogenesis，1998，19(2):247-251.
, http://www.100md.com
5 官国先，张祥福，杨发瑞.转化生长因子βⅡ型受体在胃癌组织中表达水平与侵袭、转移的相关性研究.肿瘤，1999，19(4):216-219.
6 Xie W，Mertens JC，Reiss DJ，et al.Alterations of Smad signaling in huˉman breast carcinoma are associated with porr outcome:a tissue microarray study.Cancer Res，2002，62(2):497-505.
7 Xu X，Brodie SG，Yang X，et al.Haploid loss of the suppressor Smad4/DPC4initiates gastric polyposis and cancer in mice.Oncogene，2000，19(15):1868-1874.
8 萧树东.消化病学新理论与新技术.上海:上海科技教育出版社，1999，97-106.
(收稿日期:2003-04-20)
作者单位:050051河北省人民医院消化内科
(编辑晓 亮), 百拇医药(施英瑛)