PCR技术对临床医学的深远影响
【文献标识码】 B 【文章编号】 1609-6614(2003)01-0047-02
遗传密码在人类和病原体生物学的各个方面均很重要，已得到一致的公认。由PCR(聚合酶链反应)阐明的遗传信息，现在已成为一些临床检验的基础，并且在今后将日益发展。因此，医生应当了解以PCR为基础的诊断学 是如何检出存在于感染性疾病中的病原菌和单纯遗传性疾病中的突变。此外，许多传统上认为不是遗传性的疾病，现在则看作是遗传易感性疾病或由遗传介导的对外界刺激适应不良性疾病。
PCR作为一种体外扩增DNA的方法。还可与其他检测方法相结合，直接从临床样品的DNA中鉴定任何基因。一种热稳定的DNA聚合酶以引物所结合的靶DNA链为模板，在自动的热循环扩增仪中合成互补DNA链。反复循环扩增30～35个循环，使DNA产物以2 n 指数方式增多。
PCR的一个主要长处是目的DNA片段不需要从背景DNA中纯化。另外，几乎可以用任何组织或体液，包括新鲜与存档的手术标本经PCR来诊断疾病。而且，DNA是相对稳定的分子，所以甚至可以从古代木乃伊或冷冻的组织中获得样品。指数扩增使得PCR具有极高的敏感性。而独特引物的使用则使其具有高度特异性。由于在PCR中一个参数增高另一个也会增高。因而不像其他检测方法常为提高特异性而削弱敏感性。医生当前应用PCR的兴趣主要集中在从病原体和患者基因组中扩增与检测具有诊断价值的DNA片段。
, 百拇医药
1 病原体基因组扩增
病原体基因组扩增常用于检测与鉴定微生物，评价治疗反应和检测耐药性突变等。病原体的检测有赖于把非常微少而独特的具有该微生物特异性的DNA片段的扩增。对感染性疾病的评价。PCR已证明在许多情况下较传统方法优越，尤其是在鉴定不易培养、生长缓慢或不能培养的病原体时，PCR为基础的方法可以在数小时内提供结果，并能同时分析多种样品。另外，PCR检测微生物还不受先前药物治疗的干扰，可在单凭以往经验治疗开始后用于确定感染的原因。PCR的这些特点有助于开拓分子流行病学领域。现已证明PCR在检出医院内感染及通过污染的食物(如大肠杆菌)、通气设备(如肺炎军团菌)与各致病菌的接触(如鼠疫杆菌与汉坦病菌)以及生物战等途径传播的人群暴发性流行病中，具有不可估量的价值。
以PCR为基础的研究还使人们对微生物致病机制发生根本改变。历史上长期以来人们一直认为细菌生存力等同于其可培养性，但是研究表明细菌在作培养状况下可在多种组织中生存。例如，中耳炎渗出物中的细菌不能培养，然而这些细菌在体内却代谢活跃，尽管应用抗生素后也能持续生存;这些发现引发了有关慢性细菌感染疾病存在生物网络的假设。生物网络是一个细菌群体，利用细胞间信号传导，通过协调基因表达及表型改变而建立的复杂的多细胞结构。由此，PCR诊断学使巴斯德时代以来细菌学最重要的观念出现了转变。PCR方法对不能培养的微生物所具有的检出能力也向KOCH的假设提出了挑战，在长期怀疑与病原体相关但传统培养方法又找不到感染病原菌的某些疾病中，PCR鉴定出了病原菌，如杆菌性血管瘤病及人类 埃希氏菌病。
, http://www.100md.com
逆转录PCR可扩增RNA，检测RNA病毒(如HCV与HIV)，并能加以定量。这在处理HIV阳性或者免疫抑制剂合并复发性巨细胞病毒感染的器官移植患者尤为重要。2 人类基因组扩增人类基因组扩增的应用包括:(1)检测遗传疾病的遗传缺陷;(2)确定疾病的遗传易感性;(3)确定患者家族后代的发病危险性;(4)检出肿瘤及确定残余病灶的范围;(5)法医鉴定。例如，DOWN综合征可从母亲血液中的胎儿细胞作出诊断，强奸犯的鉴定可通过在犯罪现场收集的微量样品建立。有可能生育患遗传疾病子女的夫妇，通过PCR可能提供遗传筛查与咨询。根据对疾病的认识，在症状出现前行DNA筛检将肯定有益于受鉴定者的健康。
对于癌症的诊断，PCR法可鉴定肿瘤抑制基因突变并提高残留病灶检测的敏感性。在显微镜检正常的肿瘤边缘检测到特异的p53突变与复发相关。测定这种“分子交界区”可能有益于确定最佳治疗方案。通过PCR扩增肿瘤特异性DNA异常或特异性mRNA，可以检测到微转移灶或循环中的肿瘤细胞。这种以PCR为基础的技术对于早期肿瘤检出和治疗前分期提高诊断准确性，鉴定复发或转移的高危病例以及监测治疗效果具有广阔的应用前景。
, 百拇医药
PCR对法医学产生巨大的变革性影响，在人类遗体鉴定、亲子鉴定、罪犯鉴定等方面均取得明显进步，PCR已被用于鉴定无名士兵。
3 PCR的局限性
PCR的过程依赖于引物介导的DNA复制，因此必须具有DNA序列标本信息。另一个缺点是，能可靠扩增的诊断性DNA片段最长约1000个碱基对。如果从存档组织块中提取DNA(由于DNA已部分变性)的话，这是远远不够的。因此，对人类含有许多外显子的长基因，如囊性纤维化乳腺癌基因，PCR不适合于作为进行详尽突变分析的工具。
扩增靶DNA的能力具有双重性，其检测敏感性虽无可比拟，但同时也产生数以亿计的低分子量DNA拷贝。如果形成烟雾悬浮于空气中的话，这些“残留的”DNA会迅速污染试剂、仪器、实验人员，并通过错误扩增的模板污染以后的实验。因此，PCR操作需要专门设计的多室性(至少三间工作室)实验室，特殊培训的人员，严格的实验操作以及阳性和阴性对照。只有这样才能最大限度地减少假阳性结果。
(收稿日期:2002-12-11)
作者单位:404000重庆市三峡中心医院
(编辑一 坤), 百拇医药(罗德生)
遗传密码在人类和病原体生物学的各个方面均很重要，已得到一致的公认。由PCR(聚合酶链反应)阐明的遗传信息，现在已成为一些临床检验的基础，并且在今后将日益发展。因此，医生应当了解以PCR为基础的诊断学 是如何检出存在于感染性疾病中的病原菌和单纯遗传性疾病中的突变。此外，许多传统上认为不是遗传性的疾病，现在则看作是遗传易感性疾病或由遗传介导的对外界刺激适应不良性疾病。
PCR作为一种体外扩增DNA的方法。还可与其他检测方法相结合，直接从临床样品的DNA中鉴定任何基因。一种热稳定的DNA聚合酶以引物所结合的靶DNA链为模板，在自动的热循环扩增仪中合成互补DNA链。反复循环扩增30～35个循环，使DNA产物以2 n 指数方式增多。
PCR的一个主要长处是目的DNA片段不需要从背景DNA中纯化。另外，几乎可以用任何组织或体液，包括新鲜与存档的手术标本经PCR来诊断疾病。而且，DNA是相对稳定的分子，所以甚至可以从古代木乃伊或冷冻的组织中获得样品。指数扩增使得PCR具有极高的敏感性。而独特引物的使用则使其具有高度特异性。由于在PCR中一个参数增高另一个也会增高。因而不像其他检测方法常为提高特异性而削弱敏感性。医生当前应用PCR的兴趣主要集中在从病原体和患者基因组中扩增与检测具有诊断价值的DNA片段。
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1 病原体基因组扩增
病原体基因组扩增常用于检测与鉴定微生物，评价治疗反应和检测耐药性突变等。病原体的检测有赖于把非常微少而独特的具有该微生物特异性的DNA片段的扩增。对感染性疾病的评价。PCR已证明在许多情况下较传统方法优越，尤其是在鉴定不易培养、生长缓慢或不能培养的病原体时，PCR为基础的方法可以在数小时内提供结果，并能同时分析多种样品。另外，PCR检测微生物还不受先前药物治疗的干扰，可在单凭以往经验治疗开始后用于确定感染的原因。PCR的这些特点有助于开拓分子流行病学领域。现已证明PCR在检出医院内感染及通过污染的食物(如大肠杆菌)、通气设备(如肺炎军团菌)与各致病菌的接触(如鼠疫杆菌与汉坦病菌)以及生物战等途径传播的人群暴发性流行病中，具有不可估量的价值。
以PCR为基础的研究还使人们对微生物致病机制发生根本改变。历史上长期以来人们一直认为细菌生存力等同于其可培养性，但是研究表明细菌在作培养状况下可在多种组织中生存。例如，中耳炎渗出物中的细菌不能培养，然而这些细菌在体内却代谢活跃，尽管应用抗生素后也能持续生存;这些发现引发了有关慢性细菌感染疾病存在生物网络的假设。生物网络是一个细菌群体，利用细胞间信号传导，通过协调基因表达及表型改变而建立的复杂的多细胞结构。由此，PCR诊断学使巴斯德时代以来细菌学最重要的观念出现了转变。PCR方法对不能培养的微生物所具有的检出能力也向KOCH的假设提出了挑战，在长期怀疑与病原体相关但传统培养方法又找不到感染病原菌的某些疾病中，PCR鉴定出了病原菌，如杆菌性血管瘤病及人类 埃希氏菌病。
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逆转录PCR可扩增RNA，检测RNA病毒(如HCV与HIV)，并能加以定量。这在处理HIV阳性或者免疫抑制剂合并复发性巨细胞病毒感染的器官移植患者尤为重要。2 人类基因组扩增人类基因组扩增的应用包括:(1)检测遗传疾病的遗传缺陷;(2)确定疾病的遗传易感性;(3)确定患者家族后代的发病危险性;(4)检出肿瘤及确定残余病灶的范围;(5)法医鉴定。例如，DOWN综合征可从母亲血液中的胎儿细胞作出诊断，强奸犯的鉴定可通过在犯罪现场收集的微量样品建立。有可能生育患遗传疾病子女的夫妇，通过PCR可能提供遗传筛查与咨询。根据对疾病的认识，在症状出现前行DNA筛检将肯定有益于受鉴定者的健康。
对于癌症的诊断，PCR法可鉴定肿瘤抑制基因突变并提高残留病灶检测的敏感性。在显微镜检正常的肿瘤边缘检测到特异的p53突变与复发相关。测定这种“分子交界区”可能有益于确定最佳治疗方案。通过PCR扩增肿瘤特异性DNA异常或特异性mRNA，可以检测到微转移灶或循环中的肿瘤细胞。这种以PCR为基础的技术对于早期肿瘤检出和治疗前分期提高诊断准确性，鉴定复发或转移的高危病例以及监测治疗效果具有广阔的应用前景。
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PCR对法医学产生巨大的变革性影响，在人类遗体鉴定、亲子鉴定、罪犯鉴定等方面均取得明显进步，PCR已被用于鉴定无名士兵。
3 PCR的局限性
PCR的过程依赖于引物介导的DNA复制，因此必须具有DNA序列标本信息。另一个缺点是，能可靠扩增的诊断性DNA片段最长约1000个碱基对。如果从存档组织块中提取DNA(由于DNA已部分变性)的话，这是远远不够的。因此，对人类含有许多外显子的长基因，如囊性纤维化乳腺癌基因，PCR不适合于作为进行详尽突变分析的工具。
扩增靶DNA的能力具有双重性，其检测敏感性虽无可比拟，但同时也产生数以亿计的低分子量DNA拷贝。如果形成烟雾悬浮于空气中的话，这些“残留的”DNA会迅速污染试剂、仪器、实验人员，并通过错误扩增的模板污染以后的实验。因此，PCR操作需要专门设计的多室性(至少三间工作室)实验室，特殊培训的人员，严格的实验操作以及阳性和阴性对照。只有这样才能最大限度地减少假阳性结果。
(收稿日期:2002-12-11)
作者单位:404000重庆市三峡中心医院
(编辑一 坤), 百拇医药(罗德生)