体外循环后基因的差异表达
【文献标识码】 A 【文章编号】1609-6614(2003)19-1778-04
体外循环(CPB)是大多数心内直视手术不可缺少的条件，但CPB的应用可同时引起全身器官及组织生理状态的改变，导致多种病理生理变化。为了减少CPB引起的并发症，半个多世纪内从各方面进行了基础和临床的研究与探索，包括血流动力学、病理及病理生理等方面。核酸水平的研究可发现更多、更深层次的改变。
1 心肌细胞中的差异表达
热休克引起保护性基因和热休克蛋白(HSP)表达，可加强心肌对缺血损伤的耐受。Maulik等 [1] 在猪急性心梗再血管化前肌注安非他明将体温升高到42.5℃，结果显示术后心功能恢复好，且HSP27表达增强，铜/锌超氧化物歧化酶及过氧化氢酶增高。推测安非他明改善术后心功可能和它们有关系。
Storti等 [2] 对先天性心脏病患儿CPB前后心房组织HSP70-1的基因表达进行研究，证明主动脉阻断前后其表达无明显变化，且表达量和CPB时间、阻断时间及温度无明显关系。认为心脏停跳期间心肌对手术打击无适当的适应性反应。Qing等 [3] 在动物实验中发现低温CPB时猪右心室HSP72基因转录及蛋白合成增加，免疫组化在心肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞中发现了HSP72。虽然坏死细胞 低温CPB低于常温CPB，但凋亡调节蛋白(Bcl-xL，Bak和Fas)和凋亡细胞差异无显著性。因此认为CPB时中度低温的心肌保护作用包括HSP72上调和坏死的抑制，而无凋亡的抑制。
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IL-8是白细胞激活、向组织内渗入的主要介质。无论成人 [4～6] 还是儿童 [7～9] ，CPB开始后血中IL-8水平均升高，但合成部位一直未确定。Burns等 [10] 检测了儿童先心病患者CPB前后心房及骨骼肌组织IL-8mRNA的表达，发现大部分CPB后升高，其升高程度与CPB时间及阻断时间无直接关系。骨骼肌mRNA表达与有无DHCA无关，提示单纯CPB即可引起其升高。其结果可能是血浆中IL-8升高，导致CPB后组织损伤。这是首次人类在体心脏IL-8mRNA表达的报道。
促炎性细胞因子如TNF-α、IL-6及IL-8与CPB后的心肌损伤有关。FHL2(four and a half LIM-only protein2)只在myofibres中表达，为了探索其上调与心肌损伤及TNF-α、IL-6、IL-8基因表达的关系，Wan等 [11] 对CPB、间断冷血灌注下行瓣膜置换及CABG的患者进行了研究，于CPB开始及结束即刻取心房组织，应用半定量RT-PCR对TNF-α、IL-6、IL-8基因表达进行检测，Western blot检测FHL2的表达。结果显示TNF-α无表达，33%的患者IL-6高表达，42%的患者IL-8高表达，33%的患者FHL2高表达，FHL2的高表达和IL-6、IL-8的高表达有关，且FHL2表达患者血浆中CK-MB及cTnI浓度明显高于不表达者。这是首次报道CPB后心肌细胞IL-6基因上调。这些细胞因子可能参与缺血再灌注损伤，且和FHL2的表达有关。Aebert等 [12] 发现冷晶体保护心脏及再灌注后的鼠左室c-fos，EGR-1和c-jun基因mRNA表达增强，同样，CABG患者CPB前后的右房组织这些基因也表达增强。认为低温是诱导这些促癌基因表达的主要原因。
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Iascone等 [13] 首先应用定量RT-PCR(Q.RT-PCR)对小量心房组织(10-15mg)进行心房利钠因子(ANF)、脑利钠肽(BNP)和β-actin mRNA表达的检测。其结果显示Q.RT-PCR是一种简单、特异性强、无放射性定量评价利钠肽基因表达的方法，尤其适用于少量心房标本;ANF、BNP和β-actin与先心病类型明显相关;BNP mRNA的变化较ANF的大;β-actin似乎不适于在先心病心脏基因表达中作为定量标准，因其mRNA基础水平在不同先心病类型中变化较大。Rel/NF-kappaB是对氧张力刺激有反应的转录因子，暂时参与基因转录的控制。Canty等[14] 检测了CPB患者右房组织缺血及再灌注前后的NF-kappaB，发现均有显著激活，缺血HUVECs再氧化后NF-kappaB也被激活。
先天性心脏病手术中缺血心肌再氧化导致心室功能不全和细胞损伤，缺氧时内皮素1(ET-1)增高，这个有力的血管收缩剂可能影响心肌功能和激活白细胞。为证实这点，Pearl等[15] 在缺血心肌再氧化的研究中应用小猪进行CPB试验，在缺氧和再氧化期间给予ET受体拮抗剂Bosenˉtan。发现Bosentan治疗组完全保护了右心室的dP/dt，左心室的dP/dt轻度下降;ET-1和iNOS的mRNA表达减少;心肌髓过氧化物酶活性和脂质过氧化反应降低;心肌凋亡指数降低。认为ET-1受体拮抗剂有助于再氧化后的功能恢复，且减少白细胞介导的损伤，心肌细胞死亡的减少可能改善再氧化损伤后的长期功能。
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在心肌缺血再灌注损伤的研究中，Nelson等 [16] 发现早期反应基因TIS7/PC4、c-fos和c-jun均表达增高，而iNOS未见差异表达。原位杂交方法显示c-fos表达是弥散、均匀的，而c-jun表达却有明显的局部分布特点。认为早期反应基因可能对CPB后的炎症介质激活有关系，组织表达模式的差异可能对其下游基因的激活有作用。
2 在肺内的差异表达
ET-1是CPB和DHCA后肺动脉高压的一种介质。为了弄清楚到底是ET-1生成增加还是肺内ET-1受体变化所致，Kirshbom等 [17] 的动物实验证实:DHCA组肺动脉内皮活化，ET-1mRNA明显升高;肺实质ET-1mRNA无明显变化;肺内内皮素B受体明显增加。
缺血再灌注损伤和炎性级联反应的激活导致内皮损伤和血管通透性增加，临床表现为术后肺水肿和低心排出量，婴幼儿更易受到影响。Tabbutt等 [18] 在新生羔羊HCA模型中，发现肺内Aquaporin-1mRNA水平在HCA再灌注后6h升高3倍，而在心室、心房、骨骼肌、肾、脑和肝内无改变。Aquaporin-1的升高晚于其他炎性介质(如ICAM-1，E-selectin，IL-8)，可能在术后肺水肿的形成中起重要作用，尚需对其进一步研究。
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Kotani等 [19] 同时检测了外周血及肺泡内细胞因子mRˉNA的表达，发现肺泡内IL-6、IL-8和TNF-α表达比外周 血强，认为CPB对肺炎性反应的刺激作用强于对全身的作用。
ARDS死亡率在50%左右，肺纤维化是ARDS严重程度的预后指标。CPB可引起ARDS，且常常引起肺泡损伤，这是ARDS的早期病变，CPB提供了研究纤维化分子机制的唯一模型。Deheinzelin等 [20] 在冠脉患者手术前后取肺组织标本进行实验，发现肺泡损伤的特点是肺间质水肿和分叶核细胞渗入，Ⅰ型胶原mRNA在CPB后立即升高。认为纤维形成是继肺泡弥漫性损伤的早期事件，主要由局部纤维母细胞活化所致。
Sato等 [21] 在动物实验中发现CPB后肺血管阻力增高，5-HT引起血管舒张反应，NOS抑制剂N(G)-nitro-l-arginine不能影响此反应。
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CPB后血管活性的变化是并发症的主要原因，尤其是肺血增多的儿童心脏病患者更是如此。McMullan等 [22] 应用羊主—肺动脉吻合模拟肺血增多的儿童患者。CPB后平均肺动脉压和左肺动脉阻力明显升高，主—肺动脉吻合者肺动脉压较对照组明显升高。CPB后4h，NO、亚硝酸盐、硝酸盐和cGMP降低到CPB前的70%。NOS活性和内皮NOS蛋白水平无变化。认为基础NO含量降低和(或)NO产量增加无力，在CPB后肺动脉血管活性的变化中可能起作用;NO的减少和基因表达无关，其机制尚需进一步研究。
肺栓塞所致肺动脉高压患者的持续病理状态是肺细动脉中层增生，其分子机制尚不清楚。Angiopoietin-1基因和子宫血管形成有关，为了弄清Angiopoietin-1基因异常表达和成人肺高压的关系，Thistlethwaite等 [23] 对35例肺动脉内膜切除患者进行了研究。结果显示肺动脉高压患者肺内Angiopoietin-1基因上调，其上调水平和术前患者肺血管阻力及中层肥厚程度成正比，免疫组织化学结果显示Anˉgiopoietin-1蛋白局限于肺细动脉中层，且和术前患者肺血管阻力及中层肥厚程度成正比。无肺动脉高压患者肺内未检测到Angiopoietin-1基因和蛋白水平的表达。Angiopoiˉetin-1基因可能是治疗肺栓塞肺动脉高压患者的一位点。
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3 大脑中的差异表达
72-kD的HSP72是脑缺血反应的一有用指标。有报道称30℃的中度低温可抑制短时间脑缺血中HSP72生成。Shaver等 [24] 报道深低温(15℃)明显减少HSP72的表达。
脑缺血、缺氧、严重代谢障碍早期基因(immediate-early gene)表达的变化立即发生，可导致神经元分子表现型的长期变化。Bokesch等 [25] 报道HCA后的新生羔羊海马区神经元c-fos mRNA表达增强，相应地c-fos蛋白在HCA90min达到高峰，继而下降。认为CPB和HCA改变了脑早期反应基因的表达，翻译过程在HCA120min减弱，并和海马区神经元死亡有关。
在继之的系列研究中，Bokesch等 [26] 发现延长的HCA时间与海马区和皮层增强的c-fos mRNA表达有关，而fos蛋白合成在HCA90min达高峰，在120min明显下降。N-methyl-D-aspartate拮抗剂aptiganel明显减少HCA90min的c-fos mRNA表达和fos蛋白合成，但保护了120min时的fos蛋白合成，神经元坏死明显减少。1998年Bokesch等 [27] 报道海马区c-Jun和fos表达增强，aptiganel完全阻断c-Jun蛋白的表达，改善功能，明显降低神经元坏死，但对fos蛋白表达无作用。并且指出c-Jun和神经元坏死有关，fos与术后生存有关。
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Hindman等 [28] 为验证和CPB有关的系统性促炎细胞因子和(或)内毒素血症将增加脑内诱导型环氧酶(COX-2)和(或)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的合成，应用老鼠进行CPB实验。发现CPB组和对照组内毒素浓度无明显变化;CPB组IL-6浓度明显升高，脑COX-2表达明显增加，且4h后COX-2表达和IL-6浓度相关;在任一组脑内都未检测到iNOS的mRNA。肝内只有微量COX-2和iˉNOS的mRNA表达。
Sato等 [29] 应用老鼠进行CPB实验，发现CPB引起脑内促凋亡和抗凋亡基因(bcl-x，bcl-2，bax，和caspase2)的转录，caspase3的转录无明显差异，且caspase介导的凋亡本身似乎未激活。阐述CPB后脑细胞的分子生物学改变可能有助于了解与心脏手术有关的脑功能障碍的病理生理，可能有助于发现药物性脑保护的作用点。
4 在PBMC中的差异表达
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Okubo等 [30] 在核酸水平比较了微创非体外循环冠状动脉旁路移植术(OPCAB)和体外循环下冠状动脉旁路移植术(CCABG)患者促炎细胞因子及粘附分子的差异。实验采集术前及术后6h外周血白细胞，发现CCABG组IL-1、IL-8、IL-10、TNF-α、亚铁血红素加氧酶-1(HO-1)、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM)和Mac-1明显高于OPCAB组。因此说明在mRNA水平OPCAB比CCABG对机体的创伤小。
5 其他方面
CPB后不同患者对苯肾上腺素的反应不同，NO在很大程度上影响着血管对血管收缩剂的反应。Philip等 [31] 发现eNOS基因多态性与苯肾上腺素的用量有关，认为894T基因型患者对α-受体激动剂刺激的反应强。
参考文献
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(编辑罗彬)
作者单位:100730北京首都医科大学附属北京同仁医院心血管疾病诊治中心
100853北京军医进修学院专家组, 百拇医药(齐弘炜)
体外循环(CPB)是大多数心内直视手术不可缺少的条件，但CPB的应用可同时引起全身器官及组织生理状态的改变，导致多种病理生理变化。为了减少CPB引起的并发症，半个多世纪内从各方面进行了基础和临床的研究与探索，包括血流动力学、病理及病理生理等方面。核酸水平的研究可发现更多、更深层次的改变。
1 心肌细胞中的差异表达
热休克引起保护性基因和热休克蛋白(HSP)表达，可加强心肌对缺血损伤的耐受。Maulik等 [1] 在猪急性心梗再血管化前肌注安非他明将体温升高到42.5℃，结果显示术后心功能恢复好，且HSP27表达增强，铜/锌超氧化物歧化酶及过氧化氢酶增高。推测安非他明改善术后心功可能和它们有关系。
Storti等 [2] 对先天性心脏病患儿CPB前后心房组织HSP70-1的基因表达进行研究，证明主动脉阻断前后其表达无明显变化，且表达量和CPB时间、阻断时间及温度无明显关系。认为心脏停跳期间心肌对手术打击无适当的适应性反应。Qing等 [3] 在动物实验中发现低温CPB时猪右心室HSP72基因转录及蛋白合成增加，免疫组化在心肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞中发现了HSP72。虽然坏死细胞 低温CPB低于常温CPB，但凋亡调节蛋白(Bcl-xL，Bak和Fas)和凋亡细胞差异无显著性。因此认为CPB时中度低温的心肌保护作用包括HSP72上调和坏死的抑制，而无凋亡的抑制。
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IL-8是白细胞激活、向组织内渗入的主要介质。无论成人 [4～6] 还是儿童 [7～9] ，CPB开始后血中IL-8水平均升高，但合成部位一直未确定。Burns等 [10] 检测了儿童先心病患者CPB前后心房及骨骼肌组织IL-8mRNA的表达，发现大部分CPB后升高，其升高程度与CPB时间及阻断时间无直接关系。骨骼肌mRNA表达与有无DHCA无关，提示单纯CPB即可引起其升高。其结果可能是血浆中IL-8升高，导致CPB后组织损伤。这是首次人类在体心脏IL-8mRNA表达的报道。
促炎性细胞因子如TNF-α、IL-6及IL-8与CPB后的心肌损伤有关。FHL2(four and a half LIM-only protein2)只在myofibres中表达，为了探索其上调与心肌损伤及TNF-α、IL-6、IL-8基因表达的关系，Wan等 [11] 对CPB、间断冷血灌注下行瓣膜置换及CABG的患者进行了研究，于CPB开始及结束即刻取心房组织，应用半定量RT-PCR对TNF-α、IL-6、IL-8基因表达进行检测，Western blot检测FHL2的表达。结果显示TNF-α无表达，33%的患者IL-6高表达，42%的患者IL-8高表达，33%的患者FHL2高表达，FHL2的高表达和IL-6、IL-8的高表达有关，且FHL2表达患者血浆中CK-MB及cTnI浓度明显高于不表达者。这是首次报道CPB后心肌细胞IL-6基因上调。这些细胞因子可能参与缺血再灌注损伤，且和FHL2的表达有关。Aebert等 [12] 发现冷晶体保护心脏及再灌注后的鼠左室c-fos，EGR-1和c-jun基因mRNA表达增强，同样，CABG患者CPB前后的右房组织这些基因也表达增强。认为低温是诱导这些促癌基因表达的主要原因。
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Iascone等 [13] 首先应用定量RT-PCR(Q.RT-PCR)对小量心房组织(10-15mg)进行心房利钠因子(ANF)、脑利钠肽(BNP)和β-actin mRNA表达的检测。其结果显示Q.RT-PCR是一种简单、特异性强、无放射性定量评价利钠肽基因表达的方法，尤其适用于少量心房标本;ANF、BNP和β-actin与先心病类型明显相关;BNP mRNA的变化较ANF的大;β-actin似乎不适于在先心病心脏基因表达中作为定量标准，因其mRNA基础水平在不同先心病类型中变化较大。Rel/NF-kappaB是对氧张力刺激有反应的转录因子，暂时参与基因转录的控制。Canty等[14] 检测了CPB患者右房组织缺血及再灌注前后的NF-kappaB，发现均有显著激活，缺血HUVECs再氧化后NF-kappaB也被激活。
先天性心脏病手术中缺血心肌再氧化导致心室功能不全和细胞损伤，缺氧时内皮素1(ET-1)增高，这个有力的血管收缩剂可能影响心肌功能和激活白细胞。为证实这点，Pearl等[15] 在缺血心肌再氧化的研究中应用小猪进行CPB试验，在缺氧和再氧化期间给予ET受体拮抗剂Bosenˉtan。发现Bosentan治疗组完全保护了右心室的dP/dt，左心室的dP/dt轻度下降;ET-1和iNOS的mRNA表达减少;心肌髓过氧化物酶活性和脂质过氧化反应降低;心肌凋亡指数降低。认为ET-1受体拮抗剂有助于再氧化后的功能恢复，且减少白细胞介导的损伤，心肌细胞死亡的减少可能改善再氧化损伤后的长期功能。
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在心肌缺血再灌注损伤的研究中，Nelson等 [16] 发现早期反应基因TIS7/PC4、c-fos和c-jun均表达增高，而iNOS未见差异表达。原位杂交方法显示c-fos表达是弥散、均匀的，而c-jun表达却有明显的局部分布特点。认为早期反应基因可能对CPB后的炎症介质激活有关系，组织表达模式的差异可能对其下游基因的激活有作用。
2 在肺内的差异表达
ET-1是CPB和DHCA后肺动脉高压的一种介质。为了弄清楚到底是ET-1生成增加还是肺内ET-1受体变化所致，Kirshbom等 [17] 的动物实验证实:DHCA组肺动脉内皮活化，ET-1mRNA明显升高;肺实质ET-1mRNA无明显变化;肺内内皮素B受体明显增加。
缺血再灌注损伤和炎性级联反应的激活导致内皮损伤和血管通透性增加，临床表现为术后肺水肿和低心排出量，婴幼儿更易受到影响。Tabbutt等 [18] 在新生羔羊HCA模型中，发现肺内Aquaporin-1mRNA水平在HCA再灌注后6h升高3倍，而在心室、心房、骨骼肌、肾、脑和肝内无改变。Aquaporin-1的升高晚于其他炎性介质(如ICAM-1，E-selectin，IL-8)，可能在术后肺水肿的形成中起重要作用，尚需对其进一步研究。
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Kotani等 [19] 同时检测了外周血及肺泡内细胞因子mRˉNA的表达，发现肺泡内IL-6、IL-8和TNF-α表达比外周 血强，认为CPB对肺炎性反应的刺激作用强于对全身的作用。
ARDS死亡率在50%左右，肺纤维化是ARDS严重程度的预后指标。CPB可引起ARDS，且常常引起肺泡损伤，这是ARDS的早期病变，CPB提供了研究纤维化分子机制的唯一模型。Deheinzelin等 [20] 在冠脉患者手术前后取肺组织标本进行实验，发现肺泡损伤的特点是肺间质水肿和分叶核细胞渗入，Ⅰ型胶原mRNA在CPB后立即升高。认为纤维形成是继肺泡弥漫性损伤的早期事件，主要由局部纤维母细胞活化所致。
Sato等 [21] 在动物实验中发现CPB后肺血管阻力增高，5-HT引起血管舒张反应，NOS抑制剂N(G)-nitro-l-arginine不能影响此反应。
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CPB后血管活性的变化是并发症的主要原因，尤其是肺血增多的儿童心脏病患者更是如此。McMullan等 [22] 应用羊主—肺动脉吻合模拟肺血增多的儿童患者。CPB后平均肺动脉压和左肺动脉阻力明显升高，主—肺动脉吻合者肺动脉压较对照组明显升高。CPB后4h，NO、亚硝酸盐、硝酸盐和cGMP降低到CPB前的70%。NOS活性和内皮NOS蛋白水平无变化。认为基础NO含量降低和(或)NO产量增加无力，在CPB后肺动脉血管活性的变化中可能起作用;NO的减少和基因表达无关，其机制尚需进一步研究。
肺栓塞所致肺动脉高压患者的持续病理状态是肺细动脉中层增生，其分子机制尚不清楚。Angiopoietin-1基因和子宫血管形成有关，为了弄清Angiopoietin-1基因异常表达和成人肺高压的关系，Thistlethwaite等 [23] 对35例肺动脉内膜切除患者进行了研究。结果显示肺动脉高压患者肺内Angiopoietin-1基因上调，其上调水平和术前患者肺血管阻力及中层肥厚程度成正比，免疫组织化学结果显示Anˉgiopoietin-1蛋白局限于肺细动脉中层，且和术前患者肺血管阻力及中层肥厚程度成正比。无肺动脉高压患者肺内未检测到Angiopoietin-1基因和蛋白水平的表达。Angiopoiˉetin-1基因可能是治疗肺栓塞肺动脉高压患者的一位点。
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3 大脑中的差异表达
72-kD的HSP72是脑缺血反应的一有用指标。有报道称30℃的中度低温可抑制短时间脑缺血中HSP72生成。Shaver等 [24] 报道深低温(15℃)明显减少HSP72的表达。
脑缺血、缺氧、严重代谢障碍早期基因(immediate-early gene)表达的变化立即发生，可导致神经元分子表现型的长期变化。Bokesch等 [25] 报道HCA后的新生羔羊海马区神经元c-fos mRNA表达增强，相应地c-fos蛋白在HCA90min达到高峰，继而下降。认为CPB和HCA改变了脑早期反应基因的表达，翻译过程在HCA120min减弱，并和海马区神经元死亡有关。
在继之的系列研究中，Bokesch等 [26] 发现延长的HCA时间与海马区和皮层增强的c-fos mRNA表达有关，而fos蛋白合成在HCA90min达高峰，在120min明显下降。N-methyl-D-aspartate拮抗剂aptiganel明显减少HCA90min的c-fos mRNA表达和fos蛋白合成，但保护了120min时的fos蛋白合成，神经元坏死明显减少。1998年Bokesch等 [27] 报道海马区c-Jun和fos表达增强，aptiganel完全阻断c-Jun蛋白的表达，改善功能，明显降低神经元坏死，但对fos蛋白表达无作用。并且指出c-Jun和神经元坏死有关，fos与术后生存有关。
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Hindman等 [28] 为验证和CPB有关的系统性促炎细胞因子和(或)内毒素血症将增加脑内诱导型环氧酶(COX-2)和(或)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的合成，应用老鼠进行CPB实验。发现CPB组和对照组内毒素浓度无明显变化;CPB组IL-6浓度明显升高，脑COX-2表达明显增加，且4h后COX-2表达和IL-6浓度相关;在任一组脑内都未检测到iNOS的mRNA。肝内只有微量COX-2和iˉNOS的mRNA表达。
Sato等 [29] 应用老鼠进行CPB实验，发现CPB引起脑内促凋亡和抗凋亡基因(bcl-x，bcl-2，bax，和caspase2)的转录，caspase3的转录无明显差异，且caspase介导的凋亡本身似乎未激活。阐述CPB后脑细胞的分子生物学改变可能有助于了解与心脏手术有关的脑功能障碍的病理生理，可能有助于发现药物性脑保护的作用点。
4 在PBMC中的差异表达
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Okubo等 [30] 在核酸水平比较了微创非体外循环冠状动脉旁路移植术(OPCAB)和体外循环下冠状动脉旁路移植术(CCABG)患者促炎细胞因子及粘附分子的差异。实验采集术前及术后6h外周血白细胞，发现CCABG组IL-1、IL-8、IL-10、TNF-α、亚铁血红素加氧酶-1(HO-1)、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM)和Mac-1明显高于OPCAB组。因此说明在mRNA水平OPCAB比CCABG对机体的创伤小。
5 其他方面
CPB后不同患者对苯肾上腺素的反应不同，NO在很大程度上影响着血管对血管收缩剂的反应。Philip等 [31] 发现eNOS基因多态性与苯肾上腺素的用量有关，认为894T基因型患者对α-受体激动剂刺激的反应强。
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(编辑罗彬)
作者单位:100730北京首都医科大学附属北京同仁医院心血管疾病诊治中心
100853北京军医进修学院专家组, 百拇医药(齐弘炜)