脆性X相关基因1cDNA基因克隆及序列测定
【摘要】 目的 克隆人脆性X相关基因1(fragile X related gene1，FXR1)全长cDNA，进一步探讨FXR1的功能。方法 采用RT-PCR的方法从人胎脑组织中扩增FXR1并克隆到真核表达载体pGBKT7中。结果 经PCR及DNA序列测定证实其序列正确。结论 成功克隆了FXR1cDNA，并将其重组构建了表达载体pGBKT7-FXR1。
关键词 脆性X综合征 FXR1 FXR1P 克隆
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)19-1741-03
Cloning and sequecing of cDNA of fragile X related gene1
Wang Guiliang，HeShuya，Chen Qiong，et al.
, 百拇医药
Dept.of Biochemistry and Molecular Biology Rearch，Nanhua University Hengyang，421001Hunan.
【Abstract】 Objective In order to study the function of FXR1，we cloned the cDNA of fragile X retardation gene1(FXR1).Methods FXR1-cDNA was obtained byRT-PCR from human embryo brain tissue，and was cloned into eukaryote vector-pGBKT7.Results FXR1sequence and was confirmed by PCR and DNA sequencing.ConclusionFXR1-cDNA was cloned and was constructed into expressing vector pGBKT7successfully.
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Key words fragile X syndrome FXR1 FXR1P clone
脆性X综合征(Fragile X syndrome，FraX)是一种发病仅次于Down综合征的遗传性先天性智力低下综合征 [1] ，发病率1/2500(女)及1/1500(男)，呈X连锁遗传，该病主要表现为智力低下、体型异常、头大、方额、大耳朵、大下颌，大多数男性患者在青春期发育后出现大睾丸，行为障碍。最主要的致病突变为脆性X智力低下基因1(fragile X mental retarˉdationgene1，FMR1)5′端非翻译区(UTR)中一段不稳定(CGG)n的扩增及CpG岛的异常甲基化，使其失去转录活性，因而其表达产物———脆性X智力低下蛋白FMRP(Fragˉile X mental retardation protein)不表达或低表达，遂出现典型的临床表现 [2] 。脆性X相关基因1(fragile X related gene1，FXR1)和脆性X相关基因2(fragile X related gene2，FXR2)是由Zhang Y等克隆出的分别位于常染色体(3q28和17q13.1)、与FMR1基因非常相似的基因，分别编码脆性X相关蛋白1(fragile X related protein1，FXR1P)和脆性X相关蛋白2(fragile X related protein2，FXR2P)两种蛋白质，FXR1P和FXR2P均定位于胞质，与FMRP的氨基酸序列有60%相同，均含有2个KH结构域和一个RGG盒，且都与60S核糖体大亚基结合 [3，4] 。FMR1、FXR1、FXR2三基因都很保守，除了FXR22个外显子以外，都有一致的外显子，在体外状态下FMRP与自身及FXR1P/2P具有相互作用，可形成蛋白同源二聚体和异源二聚体，3种蛋白可通过聚合与解离调节其功能。FMRP是一种胞质蛋白，在多数组织细胞的胞质中都有该蛋白的表达，以人脑组织海马区和皮质部的浦肯野细胞及表层、颗粒层神经元和睾丸组织中的精原细胞内表 ˇ 基金项目:国家自然科学基金(30370795)，湖南省自然科学基金 (01JJY1002)达最强，FXR1P在肌肉组织中高表达，FXR2P在脑和睾丸组织中高表达 [5] 。3种蛋白的的具体功能不十分清楚，本实验采用RT-PCR的方法从人胎脑组织中扩增FXR1并克隆到真核表达载体pGBKT7中，为FXR1的功能研究以及与FMR1之间的关系打下了基础。
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1 材料和方法。
1.1 实验材料
1.1.1 菌株、载体 大肠杆菌DH5a由本室保种，载体pGˉBKT7由美国纽约州立基础研究所人类遗传研究室Nanbert Zhong博士惠赠，pGEM-T载体购自Promega公司。
1.1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、EcoRI和SalI、总RNA提取试剂盒、RT kit、购自BBI公司，胰蛋白胨、酵母提取物为OXOID公司产品。
1.1.3 引物 PCR引物参照文献 [6] ，适当加以调整，由上海生工合成，序列如下:上游引物:5’-ATGTCTACTTATˉGAAACACCATT-3’下游引物:5’GATGTCTACTTATˉGAAACACCATT-3’。
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1.2 实验方法
1.2.1 标本采取 取6个月的合法引产胎儿，无菌手术取脑组织50～100mg。
1.2.2 组织RNA的提取 用TRIzol试剂盒提取总RNA。向100mg胎脑组织中加入1ml TRIzol，置于研磨器中破碎组织细胞。待细胞完全裂解，转移至1.5mlEppendorf管;按每1mlTRIzol加氯仿0.2ml，振荡混匀后室温放置5min。4℃，1000rpm离心10min，吸取上层水相，移置另一离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置2h;4℃，10000rpm离心10min，弃上层液相。加冰冻75%乙醇1ml，充分洗涤沉淀，4℃，5000rpm离心5min。弃上清，置空气中干燥(15～20min)，沉淀溶于无Rnase水中，浓度约0.5～1.0μg/μl;OD260/OD280测纯度和浓度;电泳观察。
1.2.3 逆转录cDNA的合成 取总RNA0.5μg加OligodT0.5μg，65℃5min，冰浴5min加入AMV5×buffer4μl Rnase20U、dNTP(each10mmol/L)1μl、AMV逆转录酶10U，然后用灭菌DEPC水将体系加至20μl，样品94℃预变性2min，94℃变性20s，60℃复性20s，72℃延伸45s，30个循环后72℃延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
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1.2.4 PCR扩增FXR1cDNA片段 程序:95℃预变性5min，94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min;体系:50μl。
1.2.5 FXR1cDNA的基因克隆 RT-PCR产物回收，吸取PCR产物，加入1/10体积的3MNaAC(pH=5.5)和3倍体积的无水乙醇，-70℃沉淀过夜，以洗去PCR反应体系中的盐分，1000×g离心，回收FXR1cDNA片段，溶解于50μl灭菌双蒸水中。克隆至pGEM-T vector中，连接体系如下:5μl RT-PCR产物，2μl pGEM-T vector，1.5μl10×连接缓冲液，0.5μl T4DNA连接酶2U，灭菌水6μl，16℃连接12h，氯化钙 沉淀法转化大肠杆菌DH5a。
1.2.6 FXR1的亚克隆(重组表达质粒的构建) 用EcoRI、Sa1I对pGEM-T-FXR1和pGBKT7进行双消化，37℃酶切2h，电泳后，回收FXR1和pGBKT7大片段，16℃连接12h，将连接产物转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞。
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1.2.7 pGBKT7-FXR1序列分析 用T7引物对其进行全序列分析，由上海生工生物工程公司完成。
2 结果
2.1 mRNA分离与cDNA合成 从胎脑组织中提取的总RNA，测得OD260/OD280=1.8，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见3条清晰的RNA带(28S、18S与5S)，见图1。mRNA分离并浓缩后，其OD260/OD280=1.848，合并总cDNA并经PCR扩增后，取1μl PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见约1611bpDNA条带，见图2。
图1 胎脑组织RNA琼脂糖凝胶电泳
图2 FXR1cDNA RT-PCR琼脂糖凝M DNA Marker:1PCR产物
2.2 重组FXR1cDNA的鉴定 将FXR1cDNA2种重组体(pGEM-T-FXR1和pGBKT7-FXR1)阳性克隆扩增后提取质粒，对质粒进行PCR扩增，也产生约1611bp的区带，见图3。用EcoRI和Sa1I将pGBKT7-FXR1双酶切，也产生约1611bp的区带。
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图3 pGBKT7-FXR1经EcorI和SalI双酶切M:DNA Marker;
1PCR产物;2pGBKT7-FXR1经EcoRI和SalI双酶切;
3pGBKT7;4PUC18(对照质粒)
2.3 DNA测序分析 经DNA分子测序证实为FXR1cDNA序列，序列如下:划线部分为引物序列位置，其中加粗部分为酶切位点，划框部分为起始和终止位置，编码蛋白部分共约1611bp，共编码557个氨基酸。(序列图见下页)
3 讨论
FXR1、FXR2、FMR1是同源基因，学者们对FMR1基因及其编码产物FMRP进行了大量的研究，对FMRP的功能作了较为深入的探讨，但是除对FXR1/2基因的结构有一定研究外，对其表达蛋白FXR1P/2P的功能模式研究较少。FXR1P/2P及其互作蛋白的基本功能是什么?在体细胞内究竟还与哪些蛋白质相互作用而实现调控作用?它们在脆性X综合征的发病机制中起什么作用?这些问题仍需进一步探索。本实验以人胎脑组织为原料，采用RT-PCR方法对FXR1进行了cDNA的克隆，并且构建出含有FXR1的真核表达载体pGBKT7-FXR1，下一步对FXR1的表达产物FXR1P进行研究，探索FXR1P的功能并有助于阐明FXR1、FXR2、FMR1三者之间的关系。FXR1cDNA序列:
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参考文献
1 Sutherland GR.The fragile X chromosome.Int Rev Cytol，1983，81:107:143.
2 Verkerk AJMH，Pieretti M，Sutcliffe JS，et al.Identification of a gene(FMR1)containing a CGG repeat coincidentwith a fragile x bereakpoint cluster region exhibition length variation in fragile x syndrome.Cell，1991，65(5):905-914.
3 Zhang Y，O’Connor JP，Siomi MC，et al.The Fragile X mental retardaˉtion syndrome protein interacts with novel homlogs FXR1and FXR2.EMBO J，1995，14(21):5358-5366.
, http://www.100md.com
4 Somi MC，Zhang Y，Siomi H，et al.Specific sequences in the Fragile X syndrome protein FMR1and FXR proteins mediate their binding to60s ribosomal subunits and the interactions among them.Mol Cell Biol，1996，16(7):3832-3952.
5 Bontekoe CJ，McIlwain KL，Nieuwenhuizen IM，et al.Knockout mouse model forFxr2:a model for mental retardation.HumMol Genet，2002，1(5):487-498.
6 Barbara Bardoni，Annette Schenck，Jean Louis Mandel.A novel RNA-binding nuclear protein that interacts with the fragile x mentlal retardaˉtion(FMR1)protein.Human Moleular Genetics，1999，8(13):2557-2566.
(编辑使 臻)
作者单位:421001湖南衡阳南华大学生物化学与分子生物学教研室(通讯作者)
410008湖南长沙中南大学湘雅医院
NY10314美国纽约州立基础研究所人类遗传研究室, http://www.100md.com(王桂良)
关键词 脆性X综合征 FXR1 FXR1P 克隆
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)19-1741-03
Cloning and sequecing of cDNA of fragile X related gene1
Wang Guiliang，HeShuya，Chen Qiong，et al.
, 百拇医药
Dept.of Biochemistry and Molecular Biology Rearch，Nanhua University Hengyang，421001Hunan.
【Abstract】 Objective In order to study the function of FXR1，we cloned the cDNA of fragile X retardation gene1(FXR1).Methods FXR1-cDNA was obtained byRT-PCR from human embryo brain tissue，and was cloned into eukaryote vector-pGBKT7.Results FXR1sequence and was confirmed by PCR and DNA sequencing.ConclusionFXR1-cDNA was cloned and was constructed into expressing vector pGBKT7successfully.
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Key words fragile X syndrome FXR1 FXR1P clone
脆性X综合征(Fragile X syndrome，FraX)是一种发病仅次于Down综合征的遗传性先天性智力低下综合征 [1] ，发病率1/2500(女)及1/1500(男)，呈X连锁遗传，该病主要表现为智力低下、体型异常、头大、方额、大耳朵、大下颌，大多数男性患者在青春期发育后出现大睾丸，行为障碍。最主要的致病突变为脆性X智力低下基因1(fragile X mental retarˉdationgene1，FMR1)5′端非翻译区(UTR)中一段不稳定(CGG)n的扩增及CpG岛的异常甲基化，使其失去转录活性，因而其表达产物———脆性X智力低下蛋白FMRP(Fragˉile X mental retardation protein)不表达或低表达，遂出现典型的临床表现 [2] 。脆性X相关基因1(fragile X related gene1，FXR1)和脆性X相关基因2(fragile X related gene2，FXR2)是由Zhang Y等克隆出的分别位于常染色体(3q28和17q13.1)、与FMR1基因非常相似的基因，分别编码脆性X相关蛋白1(fragile X related protein1，FXR1P)和脆性X相关蛋白2(fragile X related protein2，FXR2P)两种蛋白质，FXR1P和FXR2P均定位于胞质，与FMRP的氨基酸序列有60%相同，均含有2个KH结构域和一个RGG盒，且都与60S核糖体大亚基结合 [3，4] 。FMR1、FXR1、FXR2三基因都很保守，除了FXR22个外显子以外，都有一致的外显子，在体外状态下FMRP与自身及FXR1P/2P具有相互作用，可形成蛋白同源二聚体和异源二聚体，3种蛋白可通过聚合与解离调节其功能。FMRP是一种胞质蛋白，在多数组织细胞的胞质中都有该蛋白的表达，以人脑组织海马区和皮质部的浦肯野细胞及表层、颗粒层神经元和睾丸组织中的精原细胞内表 ˇ 基金项目:国家自然科学基金(30370795)，湖南省自然科学基金 (01JJY1002)达最强，FXR1P在肌肉组织中高表达，FXR2P在脑和睾丸组织中高表达 [5] 。3种蛋白的的具体功能不十分清楚，本实验采用RT-PCR的方法从人胎脑组织中扩增FXR1并克隆到真核表达载体pGBKT7中，为FXR1的功能研究以及与FMR1之间的关系打下了基础。
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1 材料和方法。
1.1 实验材料
1.1.1 菌株、载体 大肠杆菌DH5a由本室保种，载体pGˉBKT7由美国纽约州立基础研究所人类遗传研究室Nanbert Zhong博士惠赠，pGEM-T载体购自Promega公司。
1.1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、EcoRI和SalI、总RNA提取试剂盒、RT kit、购自BBI公司，胰蛋白胨、酵母提取物为OXOID公司产品。
1.1.3 引物 PCR引物参照文献 [6] ，适当加以调整，由上海生工合成，序列如下:上游引物:5’-ATGTCTACTTATˉGAAACACCATT-3’下游引物:5’GATGTCTACTTATˉGAAACACCATT-3’。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 标本采取 取6个月的合法引产胎儿，无菌手术取脑组织50～100mg。
1.2.2 组织RNA的提取 用TRIzol试剂盒提取总RNA。向100mg胎脑组织中加入1ml TRIzol，置于研磨器中破碎组织细胞。待细胞完全裂解，转移至1.5mlEppendorf管;按每1mlTRIzol加氯仿0.2ml，振荡混匀后室温放置5min。4℃，1000rpm离心10min，吸取上层水相，移置另一离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置2h;4℃，10000rpm离心10min，弃上层液相。加冰冻75%乙醇1ml，充分洗涤沉淀，4℃，5000rpm离心5min。弃上清，置空气中干燥(15～20min)，沉淀溶于无Rnase水中，浓度约0.5～1.0μg/μl;OD260/OD280测纯度和浓度;电泳观察。
1.2.3 逆转录cDNA的合成 取总RNA0.5μg加OligodT0.5μg，65℃5min，冰浴5min加入AMV5×buffer4μl Rnase20U、dNTP(each10mmol/L)1μl、AMV逆转录酶10U，然后用灭菌DEPC水将体系加至20μl，样品94℃预变性2min，94℃变性20s，60℃复性20s，72℃延伸45s，30个循环后72℃延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
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1.2.4 PCR扩增FXR1cDNA片段 程序:95℃预变性5min，94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min;体系:50μl。
1.2.5 FXR1cDNA的基因克隆 RT-PCR产物回收，吸取PCR产物，加入1/10体积的3MNaAC(pH=5.5)和3倍体积的无水乙醇，-70℃沉淀过夜，以洗去PCR反应体系中的盐分，1000×g离心，回收FXR1cDNA片段，溶解于50μl灭菌双蒸水中。克隆至pGEM-T vector中，连接体系如下:5μl RT-PCR产物，2μl pGEM-T vector，1.5μl10×连接缓冲液，0.5μl T4DNA连接酶2U，灭菌水6μl，16℃连接12h，氯化钙 沉淀法转化大肠杆菌DH5a。
1.2.6 FXR1的亚克隆(重组表达质粒的构建) 用EcoRI、Sa1I对pGEM-T-FXR1和pGBKT7进行双消化，37℃酶切2h，电泳后，回收FXR1和pGBKT7大片段，16℃连接12h，将连接产物转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞。
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1.2.7 pGBKT7-FXR1序列分析 用T7引物对其进行全序列分析，由上海生工生物工程公司完成。
2 结果
2.1 mRNA分离与cDNA合成 从胎脑组织中提取的总RNA，测得OD260/OD280=1.8，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见3条清晰的RNA带(28S、18S与5S)，见图1。mRNA分离并浓缩后，其OD260/OD280=1.848，合并总cDNA并经PCR扩增后，取1μl PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见约1611bpDNA条带，见图2。
图1 胎脑组织RNA琼脂糖凝胶电泳
图2 FXR1cDNA RT-PCR琼脂糖凝M DNA Marker:1PCR产物
2.2 重组FXR1cDNA的鉴定 将FXR1cDNA2种重组体(pGEM-T-FXR1和pGBKT7-FXR1)阳性克隆扩增后提取质粒，对质粒进行PCR扩增，也产生约1611bp的区带，见图3。用EcoRI和Sa1I将pGBKT7-FXR1双酶切，也产生约1611bp的区带。
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图3 pGBKT7-FXR1经EcorI和SalI双酶切M:DNA Marker;
1PCR产物;2pGBKT7-FXR1经EcoRI和SalI双酶切;
3pGBKT7;4PUC18(对照质粒)
2.3 DNA测序分析 经DNA分子测序证实为FXR1cDNA序列，序列如下:划线部分为引物序列位置，其中加粗部分为酶切位点，划框部分为起始和终止位置，编码蛋白部分共约1611bp，共编码557个氨基酸。(序列图见下页)
3 讨论
FXR1、FXR2、FMR1是同源基因，学者们对FMR1基因及其编码产物FMRP进行了大量的研究，对FMRP的功能作了较为深入的探讨，但是除对FXR1/2基因的结构有一定研究外，对其表达蛋白FXR1P/2P的功能模式研究较少。FXR1P/2P及其互作蛋白的基本功能是什么?在体细胞内究竟还与哪些蛋白质相互作用而实现调控作用?它们在脆性X综合征的发病机制中起什么作用?这些问题仍需进一步探索。本实验以人胎脑组织为原料，采用RT-PCR方法对FXR1进行了cDNA的克隆，并且构建出含有FXR1的真核表达载体pGBKT7-FXR1，下一步对FXR1的表达产物FXR1P进行研究，探索FXR1P的功能并有助于阐明FXR1、FXR2、FMR1三者之间的关系。FXR1cDNA序列:
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参考文献
1 Sutherland GR.The fragile X chromosome.Int Rev Cytol，1983，81:107:143.
2 Verkerk AJMH，Pieretti M，Sutcliffe JS，et al.Identification of a gene(FMR1)containing a CGG repeat coincidentwith a fragile x bereakpoint cluster region exhibition length variation in fragile x syndrome.Cell，1991，65(5):905-914.
3 Zhang Y，O’Connor JP，Siomi MC，et al.The Fragile X mental retardaˉtion syndrome protein interacts with novel homlogs FXR1and FXR2.EMBO J，1995，14(21):5358-5366.
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4 Somi MC，Zhang Y，Siomi H，et al.Specific sequences in the Fragile X syndrome protein FMR1and FXR proteins mediate their binding to60s ribosomal subunits and the interactions among them.Mol Cell Biol，1996，16(7):3832-3952.
5 Bontekoe CJ，McIlwain KL，Nieuwenhuizen IM，et al.Knockout mouse model forFxr2:a model for mental retardation.HumMol Genet，2002，1(5):487-498.
6 Barbara Bardoni，Annette Schenck，Jean Louis Mandel.A novel RNA-binding nuclear protein that interacts with the fragile x mentlal retardaˉtion(FMR1)protein.Human Moleular Genetics，1999，8(13):2557-2566.
(编辑使 臻)
作者单位:421001湖南衡阳南华大学生物化学与分子生物学教研室(通讯作者)
410008湖南长沙中南大学湘雅医院
NY10314美国纽约州立基础研究所人类遗传研究室, http://www.100md.com(王桂良)