均匀双轴机械刺激影响成骨细胞COX-2的表达
【摘要】 目的 探讨均匀双轴机械刺激对SD大鼠的乳鼠成骨细胞环氧合酶(cyclooxygenase-2，COX-2)表达的影响。方法 采用均匀双轴机械刺激作用成骨细胞4h，给予不同强度20，000microstrain，100，000microstrain，200，000microstrain的机械刺激。利用免疫荧光，免疫细胞化学和Western blot等方法检测均匀双轴机械刺激4h后成骨细胞COX-2的表达。结果 免疫荧光和免疫细胞化学均显示COX-2表达主要位于胞质，在核周聚集明显，Western blot检测4h机械刺激后COX-2的表达上调，随刺激强度增加COX-2表达逐渐增多，与免疫细胞化学结果一致。结论 均匀双轴机械刺激4h时能促进大鼠乳鼠成骨细胞COX-2的表达。
关键词 均匀双轴 机械刺激 成骨细胞 COX-2
【文献标识码】 A 【文章编号】1609-6614(2003)19-1744-03
, 百拇医药
The effects of cyclooxygenase-2of rats primary osteoblasts by
uniform biaxial mechanical stimulation
Zhao Man，Xiao Junjun，Dong Xiaomin，et al.
Health Science Center of Peking University，Peking100083.
【Abstract】 Objective To study the effects of cyclooxygenase(COX-2)of SD rat primary osteoblasts by uniˉform biaxial mechanical stimulation.Methods A new uniform biaxial mechanical stimulation model has been deˉsigned at the firsttime.The isolated rats primary osteoblasts had been exposed to uniform biaxial mechanical stimulaˉtion at different intensity(20，000microstrain，100，000microstrain，200，000microstrain)for four hours.The expresˉsion changes of COX-2protein caused by respective mechanical stimulation were detected by immunofluorescence technique，Immunocytochemistry and Western blot.Results After mechanical stimulation treatment for four hours hours，the expression of COX-2is obviously upregulated，while in the control groups，there is nearly no COX-2exˉpressed.In additon，the expression of COX-2of rat primary osteoblasts is increasing with theenhancement of the inˉtensity.Conclusion The uniform biaxial mechanical stimulation of four hours can promote the expression of COX-2of rats primary osteoblasts.
, 百拇医药
Key words uniform biaxial mechanical stimulation osteoblast COX-2
成骨细胞受到机械刺激后启动机械信号传导通路，经过一系列的分子事件，调节其表型基因和相关蛋白发生变化导致骨重建 [1] 。在此过程中作为机械刺激敏感基因和早期快反应基因的COX-2表达上调 [2] 。COX有两种异构酶:COX-1是结构酶，在大多数组织中都有表达，催化具有生理功能的前列腺素的合成;而COX-2是诱导表达的，正常的生理条件下则几乎检测不到。COX是催化花生四烯酸(或其它的20碳脂肪酸)生成前列腺素(prostaglandin，PG)的关键酶。而PG对于机械刺激的骨形成有重要作用，特别是PGE 2 能刺激成骨细胞增殖和骨形成[3] ，并能调节破骨细胞的分化与功能，因此机械刺激通过诱导COX-2能够调节骨新陈代谢的整个过程 [4] 。
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目前有许多的实验体系通过体内和体外的模型研究机械刺激对骨重建的影响，然而模拟临床牵引成骨的机械刺激的机械刺激模型还未见报道。本研究对体外培养的大鼠乳鼠成骨细胞采用一种新型的均匀双轴机械刺激模型，通过观察不同刺激强度对成骨细胞COX-2的调节作用，探 ˇ 基金项目:教育部教育振兴行动计划特殊专项基金(985)资助索机械刺激调节骨重建的作用机制。
1 材料和方法
1.1 动物和试剂 24h内的SD大鼠乳鼠，DMEM培养基(Gibicol)，胎牛血清(Hyclone)，兔抗大鼠COX-2多抗(Santa Cruz)，辣根酶标记的羊抗兔IgG(Santa Cruz)，FITC标记的羊抗兔IgG(Santa Cruz)，DAB试剂盒(Histostain TM -Plus Kits北京中山公司)。Hoefer MiniVe垂直电泳仪(Amersham Pharmaˉcia)，石墨半干式转印仪(Amersham Pharmacia)，凝胶成像系统(Biostep GmbH)。
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1.2 成骨细胞培养与鉴定 无菌条件下取出24h之内的SD大鼠乳鼠的颅骨，去除骨膜及软组织，用PBS冲洗骨片并剪碎，1mg/ml胶原酶37℃消化8～12min后，用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养液吹打消化的骨片，收集上清液离心1000r/min×5min，再用上述培养液重悬细胞，移至培养瓶中，在37℃，5%(v/v)CO 2 孵箱中培养。24h后换液，视细胞生长情况每2～3天换液1次，直至细胞长满。经差相贴壁法获得纯化的成骨细胞，通过细胞形态观察、改良Goˉmori氏钙钴法显示碱性磷酸酶(ALP)、细胞骨钙素免疫细胞化学染色等鉴定成骨细胞。取纯化后3～5代的成骨细胞进行实验。
1.3 均匀双轴机械刺激模型 本实验采用的是一种根据临床牵张术的特点设计的机械力直接牵拉的模型(已另文投稿，待刊发)，是由钛合金支架和硅胶膜制成，目前这两种生物材料在医学上得到广泛应用而对细胞生长均无不良影响。该模型中将硅胶膜用钛合金螺丝固定于钛合金制成的支架上，呈火柴盒样3cm×5cm大小，支架上固定有螺旋杆，通过调节该螺旋杆可以牵拉有弹性的硅胶膜，从而对生长于硅胶膜上的成骨细胞产生一个均匀双向的机械牵拉刺激。使用前将该模型用超声清洗2h以上，PBS冲洗干净，经75%的酒精浸泡消毒1～2h后，紫外灯照射3～4h晾干。使用Ⅰ型胶原蛋白包被模型的硅胶膜20～30min以增加细胞的附着力。使用0.25%胰酶消化细胞，加血清培养基终止反应，细胞计数5×10 6 /ml，制备成单细胞悬液加入模型内，培养过夜，次日显微镜下观察细胞铺展至90%以上时，进行实验。均匀双向牵拉刺激强度分为20，000microstrain组，100，000microstrain组，200，000microstrain组和未受刺激的对照组，各组同步培养并同步牵拉刺激4h后取样。
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1.4 细胞免疫荧光染色 PBS冲洗上述各组成骨细胞，4%多聚甲醛固定15min，0.1%TritonX-100作用2min，3%的山羊血清封闭室温15min之后勿洗，滴加COX-2兔抗鼠一抗(1∶100)，37℃湿盒内孵育1.5h，PBS冲洗3次×10min，滴加FITC标记的羊抗兔二抗(1∶50)37℃湿盒内避光孵育30min，PBS冲洗洗3次×10min，激光共聚焦显微镜拍摄记录并分析。
1.5 免疫组化 依照DAB试剂盒(Histostin TM -Plus Kits北京中山公司)说明严格进行操作。倒置显微镜下观察，图像分析仪拍摄并分析。
1.6 Western blot PBS冲洗各组细胞，加入50μl裂解液(50mMTris[pH7.5]，150mM NaCl，5mM MgCl 2 ，5mM EDTA，0.5%NP40，1mMPMSF，20μg/ml Aprotintin)冰浴30min，12，000r/min离心10min转移上清至一干净管中，用Bradford法进行蛋白定量。样品100℃煮沸5min，蛋白上样量为50μg，经SDS-PAGE5%的积层胶和12%的分离胶电泳2.5h(浓缩胶80V进入分离胶后调至120V);半干石墨电极转移法将蛋白质从SDS-PAGE胶转移至硝酸纤维膜，按凝胶面积0.75mA/cm 2 接通电流，电转2h;按0.1ml/cm 2 的量加入封闭液[TBS(pH7.4)，5%脱脂牛奶，0.05%Tween-20]室温封闭2h;兔抗COX-2一抗(1∶200)室温杂交2h后，用洗膜缓冲液TBST(pH7.4)洗膜3×10min;羊抗兔IgG(1∶2000)室温作用1.5h，洗膜缓冲液TBST(pH7.4)冲洗2×10min，TBS(pH8.0)1×10min;ECL显色，凝胶成像系统灰度扫描分析。
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2 结果
2.1 成骨细胞纯化与鉴定结果 利用差相贴壁法分离成纤维等杂质细胞得到纯化的成骨细胞，显微镜下观察细胞贴壁生长，形态均匀一致，梭形或多角形，胞质透明颗粒少，单个核，核仁1～2个。成骨细胞合成的碱性磷酸酶经改良的钙钴法染色呈棕黑色细微颗粒，阴性对照细胞内无棕黑色微粒。细胞骨钙素免疫化学染色鉴定成骨细胞的胞浆中有黄褐色阳性着色，而阴性对照无黄褐着色。
2.2 细胞免疫荧光染色 免疫荧光显示各刺激强度时COX-2蛋白的表达，如图所示COX-2的绿色荧光主要分布在胞质中，在核周聚集明显，并随单轴单向机械应力强度20，000microstrain，100，000microstrain，200，000microstrain的增强COX-2蛋白荧光强度有逐渐增强的趋势，而对照(未受 机械应力)则无明显荧光。
2.3 免疫细胞化学结果 均匀双轴机械刺激作用后，成骨细胞的胞浆中出现棕色的颗粒表示COX-2蛋白免疫反应呈阳性。机械刺激作用4h时COX-2的表达明显增多，并随刺激强度的增强成骨细胞体积增大，数量增多，COX-2阳性颗粒也增多、着色加深，吸光度值逐渐增高，而对照组的胞浆中无明显着色颗粒，COX-2蛋白免疫反应呈阴性。
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2.4 Western blot结果 给予成骨细胞不同时间(2h，4h，8h)和不同强度(20，000microstrain，100，000microstrain，200，000microstrain)的均匀双轴的机械刺激，对照1(con1)和对照2(con2)分别是生长于培养瓶和均匀双轴机械模型硅胶膜上的未给予刺激的成骨细胞。对照1和对照2的COX-2表达几无差异。均匀双轴机械刺激4h后成骨细胞COX-2蛋白的表达随着刺激强度的增强依次增多。
3 讨论
生物化学和分子生物学的研究已经证实机械刺激能导致骨细胞基因水平的改变。目前骨细胞基因水平表达改变的研究诸多集中在编码酶，转录因子，细胞因子，骨基质蛋白等方面。cox-2基因编码的COX-2蛋白酶的调节也已经得到了广泛的研究 [5] 。骨组织的感觉细胞(可能是骨细胞)能够识别机械刺激引起的环境的改变 [6] ，由跨膜的离子通道，细胞骨架的组分，整合素等机械敏感结构将机械刺激信号转换为化学信号传至细胞内部，随后c-fos和cox-2等早期反应基因的表达水平发生上调，cAMP水平增加，NO和PGs产生增多。这些早期事件之后，IGF-1、Ⅰ型胶原、OPN和骨钙素的表达水平也增加。这样机械刺激产生的张力经过一系列的生化反应，最终激活成骨细胞和破骨细胞导致骨重建。
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成骨细胞受到机械刺激后的信号传导涉及PGs，特别是由可诱导的COX-2产生的PGE 2 。研究发现流体剪切力能快速诱导成骨细胞COX-2的表达增高 [7] ，特异的抑止大鼠体内COX-2的表达能阻止新骨的形成 [8] 。此外，机械刺激后的成骨细胞NO与PGE 2 分泌都增加，而且NO的产生对于PGE 2 的升高有重要作用 [9] 。Yoshiko [10] 认为NO能诱导机械刺激后成骨细胞COX-2的表达，但COX-2mRNA的表达水平不变，可能NO是通过COX-2转录后和翻译的水平来调节PG的合成，目前的研究表明成骨细胞受机械刺激后产生的PGE 2 可能是NO依赖型的。
以往建立的机械牵拉细胞的模型虽然有多种，诸如重力(gravity)，张力(tension)，压力(compression)，减切力(shear)等机械应力均能快速地诱导COX-2基因的表达 [11] 和成骨细胞的增值与分化，但它们都存在着一个共同的缺点即对培养的细胞不能达到完全均匀的牵拉，而本实验采用的模型最大的优点就是对弹性硅胶膜形成均匀的机械牵拉，并且由于钛合金稳定的理化性质，该机械应力模型拥有良好的生物兼容性，弹性硅胶膜也使面积可根据需要进行调整，可满足多种检测需要。
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研究采用无菌Ⅰ型胶原(0.3%)作用硅胶膜10～15min以增强成骨细胞在硅胶膜上的附着力。Western blot的结果显示各刺激时段内对照组1(con1)和对照组2(con2)的COX-2蛋白表达无差异，证实Ⅰ型胶原附着的硅胶膜对COX-2蛋白的表达无影响。研究发现均匀双轴机械刺激作用4h时各刺激强度COX-2的表达不同，随均匀双轴机械刺激强度的增加，成骨细胞COX-2的表达逐渐升高，提示了成骨细胞COX-2表达的高低与机械刺激的强度密切相关。同时免疫细胞化学和激光共聚焦证实COX-2在核周表达明显，与Ikou Morita [12] 等人的COX-2定位分布在内质网和核被膜、在核被膜聚集更多的结论一致。
机械刺激可以诱导新骨形成，促进成骨细胞的增殖和分化，并能增强成骨细胞的新陈代谢活力和基因表达，COX-2等相关蛋白表达的上调与上述过程密切相关。本研究初步探讨了均匀双轴机械刺激与成骨细胞COX-2表达的关系，发现了均匀双轴机械刺激作用4h可以增强体外成骨细胞COX-2的表达，希望能对临床的牵引成骨有理论上的支持与更新阐述。(本文图见附页)
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参考文献
1 Meyer U，Terodde M，Joos U，et al.Mechanical stimulation of osteoblasts in cell culture.Mund-Kiefer-Gesichtschir，2001，5(3):166-172.
2 Shintaro N，Teruko T-Y，et al.Molecuoar events caused by mechanical stress in bone.Matrix Biology，2000，(19):91-96.
3 Nauman E.A，Satcher R.L，Keaveny T.M，et al.Osteoblasts respond to pulsatile fluid flow with shortterm increases in PGE2but no change in mineralization.J Appl Physiol，2001，(90):1849-1854.
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4 Cheng B，YOICHI K，Zhao S，et al.PGE2Is Essential for Gap Junction-Mediated Intercellular Communication between Osteocyte-Like MLO-Y4Cells in Response to Mechanical Strain.Endocrinology，2001，142 (8):3464-3473.
5 Pavalko F.M，Chen N.X.，Turner C.H，et al.Fluid shear-induced mechanical signaling in MC3T3-E1osteoblasts requires cytoskeleton integrin interactions.Am.J.Physiol，1998，(275):C1591-1601.
6 Lanyon L.E.，Osteocytes，strain detection，bone modeling and remodelˉing，Calcif.Tissue Int，1993，53:S102-107.
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7 Burger K-N J，Semeins E.H，Raisz C.M，et al.Pulsating fluid flow stimulates prostaglandin release and inducible prostaglandin G/H synˉthase mRNA expression in primary mouse bone cells，J.Bone Miner.Res，1997，(12):45-51C.
8 Forwood M.R.Inducible cyclooxygenase(COX-2)mediates the inducˉtion of bone formation by mechanical loading in vivo.J.Bone Miner.Res，1996，11(11):1688-1693.
9 Elisabeth H.B，Jenneke K-N，et al.Mechanotransduction in bone-role of the lacunocanalicular network.1999，(13):S101-112. [ZK)]
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10 [ZK(#] Yoskiko O，Chisato M，Tamotsu K，et al.IL-13and IL-4Inˉhibit Bone Resorption by Suppressing Cyclooxygenase-2-Dependent Prostaglandin Synthesis in Osteoblasts.The Journal of Immunology，1996，156(2):758-764.
11 Sonia K，David J.B，K.-H.William Lau.Fluid flow shear stress stimulates human osteoblast proliferation and differentiation.Bone，2003，(32):241-251.
12 Ikuo Morita.Distinct functions of COX-1and COX-2.Prostaglandins&other Lipid Mediators，68-69(2002):165-175.
(编辑使 臻)
作者单位:100083北京大学医学部细胞生物学系( 通讯作者)
北京大学口腔医院, 百拇医药(赵 曼 肖军军 董晓敏 孟书聪 王稚英 王兴)
关键词 均匀双轴 机械刺激 成骨细胞 COX-2
【文献标识码】 A 【文章编号】1609-6614(2003)19-1744-03
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The effects of cyclooxygenase-2of rats primary osteoblasts by
uniform biaxial mechanical stimulation
Zhao Man，Xiao Junjun，Dong Xiaomin，et al.
Health Science Center of Peking University，Peking100083.
【Abstract】 Objective To study the effects of cyclooxygenase(COX-2)of SD rat primary osteoblasts by uniˉform biaxial mechanical stimulation.Methods A new uniform biaxial mechanical stimulation model has been deˉsigned at the firsttime.The isolated rats primary osteoblasts had been exposed to uniform biaxial mechanical stimulaˉtion at different intensity(20，000microstrain，100，000microstrain，200，000microstrain)for four hours.The expresˉsion changes of COX-2protein caused by respective mechanical stimulation were detected by immunofluorescence technique，Immunocytochemistry and Western blot.Results After mechanical stimulation treatment for four hours hours，the expression of COX-2is obviously upregulated，while in the control groups，there is nearly no COX-2exˉpressed.In additon，the expression of COX-2of rat primary osteoblasts is increasing with theenhancement of the inˉtensity.Conclusion The uniform biaxial mechanical stimulation of four hours can promote the expression of COX-2of rats primary osteoblasts.
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Key words uniform biaxial mechanical stimulation osteoblast COX-2
成骨细胞受到机械刺激后启动机械信号传导通路，经过一系列的分子事件，调节其表型基因和相关蛋白发生变化导致骨重建 [1] 。在此过程中作为机械刺激敏感基因和早期快反应基因的COX-2表达上调 [2] 。COX有两种异构酶:COX-1是结构酶，在大多数组织中都有表达，催化具有生理功能的前列腺素的合成;而COX-2是诱导表达的，正常的生理条件下则几乎检测不到。COX是催化花生四烯酸(或其它的20碳脂肪酸)生成前列腺素(prostaglandin，PG)的关键酶。而PG对于机械刺激的骨形成有重要作用，特别是PGE 2 能刺激成骨细胞增殖和骨形成[3] ，并能调节破骨细胞的分化与功能，因此机械刺激通过诱导COX-2能够调节骨新陈代谢的整个过程 [4] 。
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目前有许多的实验体系通过体内和体外的模型研究机械刺激对骨重建的影响，然而模拟临床牵引成骨的机械刺激的机械刺激模型还未见报道。本研究对体外培养的大鼠乳鼠成骨细胞采用一种新型的均匀双轴机械刺激模型，通过观察不同刺激强度对成骨细胞COX-2的调节作用，探 ˇ 基金项目:教育部教育振兴行动计划特殊专项基金(985)资助索机械刺激调节骨重建的作用机制。
1 材料和方法
1.1 动物和试剂 24h内的SD大鼠乳鼠，DMEM培养基(Gibicol)，胎牛血清(Hyclone)，兔抗大鼠COX-2多抗(Santa Cruz)，辣根酶标记的羊抗兔IgG(Santa Cruz)，FITC标记的羊抗兔IgG(Santa Cruz)，DAB试剂盒(Histostain TM -Plus Kits北京中山公司)。Hoefer MiniVe垂直电泳仪(Amersham Pharmaˉcia)，石墨半干式转印仪(Amersham Pharmacia)，凝胶成像系统(Biostep GmbH)。
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1.2 成骨细胞培养与鉴定 无菌条件下取出24h之内的SD大鼠乳鼠的颅骨，去除骨膜及软组织，用PBS冲洗骨片并剪碎，1mg/ml胶原酶37℃消化8～12min后，用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养液吹打消化的骨片，收集上清液离心1000r/min×5min，再用上述培养液重悬细胞，移至培养瓶中，在37℃，5%(v/v)CO 2 孵箱中培养。24h后换液，视细胞生长情况每2～3天换液1次，直至细胞长满。经差相贴壁法获得纯化的成骨细胞，通过细胞形态观察、改良Goˉmori氏钙钴法显示碱性磷酸酶(ALP)、细胞骨钙素免疫细胞化学染色等鉴定成骨细胞。取纯化后3～5代的成骨细胞进行实验。
1.3 均匀双轴机械刺激模型 本实验采用的是一种根据临床牵张术的特点设计的机械力直接牵拉的模型(已另文投稿，待刊发)，是由钛合金支架和硅胶膜制成，目前这两种生物材料在医学上得到广泛应用而对细胞生长均无不良影响。该模型中将硅胶膜用钛合金螺丝固定于钛合金制成的支架上，呈火柴盒样3cm×5cm大小，支架上固定有螺旋杆，通过调节该螺旋杆可以牵拉有弹性的硅胶膜，从而对生长于硅胶膜上的成骨细胞产生一个均匀双向的机械牵拉刺激。使用前将该模型用超声清洗2h以上，PBS冲洗干净，经75%的酒精浸泡消毒1～2h后，紫外灯照射3～4h晾干。使用Ⅰ型胶原蛋白包被模型的硅胶膜20～30min以增加细胞的附着力。使用0.25%胰酶消化细胞，加血清培养基终止反应，细胞计数5×10 6 /ml，制备成单细胞悬液加入模型内，培养过夜，次日显微镜下观察细胞铺展至90%以上时，进行实验。均匀双向牵拉刺激强度分为20，000microstrain组，100，000microstrain组，200，000microstrain组和未受刺激的对照组，各组同步培养并同步牵拉刺激4h后取样。
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1.4 细胞免疫荧光染色 PBS冲洗上述各组成骨细胞，4%多聚甲醛固定15min，0.1%TritonX-100作用2min，3%的山羊血清封闭室温15min之后勿洗，滴加COX-2兔抗鼠一抗(1∶100)，37℃湿盒内孵育1.5h，PBS冲洗3次×10min，滴加FITC标记的羊抗兔二抗(1∶50)37℃湿盒内避光孵育30min，PBS冲洗洗3次×10min，激光共聚焦显微镜拍摄记录并分析。
1.5 免疫组化 依照DAB试剂盒(Histostin TM -Plus Kits北京中山公司)说明严格进行操作。倒置显微镜下观察，图像分析仪拍摄并分析。
1.6 Western blot PBS冲洗各组细胞，加入50μl裂解液(50mMTris[pH7.5]，150mM NaCl，5mM MgCl 2 ，5mM EDTA，0.5%NP40，1mMPMSF，20μg/ml Aprotintin)冰浴30min，12，000r/min离心10min转移上清至一干净管中，用Bradford法进行蛋白定量。样品100℃煮沸5min，蛋白上样量为50μg，经SDS-PAGE5%的积层胶和12%的分离胶电泳2.5h(浓缩胶80V进入分离胶后调至120V);半干石墨电极转移法将蛋白质从SDS-PAGE胶转移至硝酸纤维膜，按凝胶面积0.75mA/cm 2 接通电流，电转2h;按0.1ml/cm 2 的量加入封闭液[TBS(pH7.4)，5%脱脂牛奶，0.05%Tween-20]室温封闭2h;兔抗COX-2一抗(1∶200)室温杂交2h后，用洗膜缓冲液TBST(pH7.4)洗膜3×10min;羊抗兔IgG(1∶2000)室温作用1.5h，洗膜缓冲液TBST(pH7.4)冲洗2×10min，TBS(pH8.0)1×10min;ECL显色，凝胶成像系统灰度扫描分析。
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2 结果
2.1 成骨细胞纯化与鉴定结果 利用差相贴壁法分离成纤维等杂质细胞得到纯化的成骨细胞，显微镜下观察细胞贴壁生长，形态均匀一致，梭形或多角形，胞质透明颗粒少，单个核，核仁1～2个。成骨细胞合成的碱性磷酸酶经改良的钙钴法染色呈棕黑色细微颗粒，阴性对照细胞内无棕黑色微粒。细胞骨钙素免疫化学染色鉴定成骨细胞的胞浆中有黄褐色阳性着色，而阴性对照无黄褐着色。
2.2 细胞免疫荧光染色 免疫荧光显示各刺激强度时COX-2蛋白的表达，如图所示COX-2的绿色荧光主要分布在胞质中，在核周聚集明显，并随单轴单向机械应力强度20，000microstrain，100，000microstrain，200，000microstrain的增强COX-2蛋白荧光强度有逐渐增强的趋势，而对照(未受 机械应力)则无明显荧光。
2.3 免疫细胞化学结果 均匀双轴机械刺激作用后，成骨细胞的胞浆中出现棕色的颗粒表示COX-2蛋白免疫反应呈阳性。机械刺激作用4h时COX-2的表达明显增多，并随刺激强度的增强成骨细胞体积增大，数量增多，COX-2阳性颗粒也增多、着色加深，吸光度值逐渐增高，而对照组的胞浆中无明显着色颗粒，COX-2蛋白免疫反应呈阴性。
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2.4 Western blot结果 给予成骨细胞不同时间(2h，4h，8h)和不同强度(20，000microstrain，100，000microstrain，200，000microstrain)的均匀双轴的机械刺激，对照1(con1)和对照2(con2)分别是生长于培养瓶和均匀双轴机械模型硅胶膜上的未给予刺激的成骨细胞。对照1和对照2的COX-2表达几无差异。均匀双轴机械刺激4h后成骨细胞COX-2蛋白的表达随着刺激强度的增强依次增多。
3 讨论
生物化学和分子生物学的研究已经证实机械刺激能导致骨细胞基因水平的改变。目前骨细胞基因水平表达改变的研究诸多集中在编码酶，转录因子，细胞因子，骨基质蛋白等方面。cox-2基因编码的COX-2蛋白酶的调节也已经得到了广泛的研究 [5] 。骨组织的感觉细胞(可能是骨细胞)能够识别机械刺激引起的环境的改变 [6] ，由跨膜的离子通道，细胞骨架的组分，整合素等机械敏感结构将机械刺激信号转换为化学信号传至细胞内部，随后c-fos和cox-2等早期反应基因的表达水平发生上调，cAMP水平增加，NO和PGs产生增多。这些早期事件之后，IGF-1、Ⅰ型胶原、OPN和骨钙素的表达水平也增加。这样机械刺激产生的张力经过一系列的生化反应，最终激活成骨细胞和破骨细胞导致骨重建。
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成骨细胞受到机械刺激后的信号传导涉及PGs，特别是由可诱导的COX-2产生的PGE 2 。研究发现流体剪切力能快速诱导成骨细胞COX-2的表达增高 [7] ，特异的抑止大鼠体内COX-2的表达能阻止新骨的形成 [8] 。此外，机械刺激后的成骨细胞NO与PGE 2 分泌都增加，而且NO的产生对于PGE 2 的升高有重要作用 [9] 。Yoshiko [10] 认为NO能诱导机械刺激后成骨细胞COX-2的表达，但COX-2mRNA的表达水平不变，可能NO是通过COX-2转录后和翻译的水平来调节PG的合成，目前的研究表明成骨细胞受机械刺激后产生的PGE 2 可能是NO依赖型的。
以往建立的机械牵拉细胞的模型虽然有多种，诸如重力(gravity)，张力(tension)，压力(compression)，减切力(shear)等机械应力均能快速地诱导COX-2基因的表达 [11] 和成骨细胞的增值与分化，但它们都存在着一个共同的缺点即对培养的细胞不能达到完全均匀的牵拉，而本实验采用的模型最大的优点就是对弹性硅胶膜形成均匀的机械牵拉，并且由于钛合金稳定的理化性质，该机械应力模型拥有良好的生物兼容性，弹性硅胶膜也使面积可根据需要进行调整，可满足多种检测需要。
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研究采用无菌Ⅰ型胶原(0.3%)作用硅胶膜10～15min以增强成骨细胞在硅胶膜上的附着力。Western blot的结果显示各刺激时段内对照组1(con1)和对照组2(con2)的COX-2蛋白表达无差异，证实Ⅰ型胶原附着的硅胶膜对COX-2蛋白的表达无影响。研究发现均匀双轴机械刺激作用4h时各刺激强度COX-2的表达不同，随均匀双轴机械刺激强度的增加，成骨细胞COX-2的表达逐渐升高，提示了成骨细胞COX-2表达的高低与机械刺激的强度密切相关。同时免疫细胞化学和激光共聚焦证实COX-2在核周表达明显，与Ikou Morita [12] 等人的COX-2定位分布在内质网和核被膜、在核被膜聚集更多的结论一致。
机械刺激可以诱导新骨形成，促进成骨细胞的增殖和分化，并能增强成骨细胞的新陈代谢活力和基因表达，COX-2等相关蛋白表达的上调与上述过程密切相关。本研究初步探讨了均匀双轴机械刺激与成骨细胞COX-2表达的关系，发现了均匀双轴机械刺激作用4h可以增强体外成骨细胞COX-2的表达，希望能对临床的牵引成骨有理论上的支持与更新阐述。(本文图见附页)
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参考文献
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(编辑使 臻)
作者单位:100083北京大学医学部细胞生物学系( 通讯作者)
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