Aβ所致拟AD大鼠模型βAPPmRNA及其蛋白表达特点
【摘要】 目的 探讨Aβ所致AD大鼠模型神经病理学相关基因βAPP和βAPPmRNA的表达情况。方法 12个月龄SD大鼠，随机分为正常组与模型组(3天、14天和28天)共4组，模型组给予右侧海马一次性注射凝聚态Aβ 1-40 2μl(10μg)。分3天、14天和28天，4%多聚甲醛灌注取材，常规石蜡切片，用SABC法进行βAPP免疫组织化学染色，原位杂交法检测βAPPmRˉNA表达。用MetaMorph图像分析系统分析海马和皮质损伤区域附近βAPP和βAPPmRNA表达的强度。结果 模型组14天、28天海马与皮质βAPP阳性表达区光密度值和阳性表达面积均显著高于正常组海马与皮质相应数值(P<0.05，P<0.01)。模型组3天、14天、28天海马与皮质βAPPmRNA阳性表达区域光密度值，以及模型组28天海马阳性区域总面积数值分别高于正常组同区域数值(P<0.05)。结论 Aβ所致AD大鼠模型βAPP和βAPPmRNA的表达明显增高。
关键词 Aβ AD大鼠模型 βAPP βAPPmRNA 表达
, http://www.100md.com
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)07-0580-04
Study on expression ofβAPPmRNA andβAPP in AD
rats model caused by Aβ
Cheng Long，Tian Jinzhou，Yin Junxiang，et al.
Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of
Traditional Chinese Medicine，Beijing100070.
【Abstract】 Objective To investigate the expression ofβAPP andβAPPmRNA of
, 百拇医药
the AD rats model which were caused by Aβ.Methods 12month old SD rats were divided into four groups randomly.Model groups were injecˉtion with condensed Aβ 1-40 2μl(10μg)into rat right hippocampi.To make paraffin section after3day，14day and28day.To detectβAPP with SABC andβAPPmRNA expression with in situ hybridization.To analysisβAPP andβAPPmˉRNA expression withMetaMorph image analys
is system at hippocampi and cortex lesion regions.Results TheβAPP exˉpression optical density total and AREA total of model group14day，28day at hippocampi and
, http://www.100md.com
cortex lesion regions were significantly higher than normal group at the same regions(P<0.05or P<0.01).TheβAPPmRNA expression optical density total of model
group3day，14day，28day at hippocampi and cortex lesion regions and AREA total of28day at hippocampi were significantly higher than normal group at the same regions.(P<0.05).Conclusion TheβAPP andβAPPmRNA expression of AD rats model which were caused by Aβincreased significantly.
, 百拇医药
Key words Aβ AD rats model βAPP βAPPmRNA expression
老年斑(senile plagues，SPs)、脑血管内淀粉样蛋白(amyˉloid protein，AP)沉积和神经原纤维缠结(neurofibrillary tanˉgles，NFTs)是阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的三大病理特征，前二者的主要成分为淀粉样蛋白，后者也被证实具有淀粉样蛋白的特性或与其有关。多项研究发现Aβ是AD的原发事件 [1～3] 。因此，理解激活这一事件的分子作用的关键步骤对于在疾病的最早阶段阻断Aβ斑块形成这一治疗战略非常重要。研究发现，淀粉样前蛋白在分泌激素作用下经蛋白水解后产生Aβ。当β淀粉样蛋白在细胞外基质中达到一定量后可聚集并构成β样折叠。实验显示，直接注射入大鼠海马可造成AD的特征性病理变化 [4] 。1994年日本学者Atsumi Nitta等 [5] 研究者提出β-淀粉样蛋白脑内注射的大鼠可被用于AD的动物模型，应用β-淀粉样蛋白直接脑内注射建立AD动物模型的方法受到广泛重视。我们进行了Aβ所致拟痴呆大鼠模型行为学研究，发 现通过Mriss水迷宫检测，表明该模型在模拟AD认知障碍方面较为适宜，并且模拟了淀粉样蛋白沉积、淀粉样血管病变和神经元损害以及胶质细胞增生等病理特点。由于βAPP的代谢异常是自发或作为环境和(或)遗传因子作用的结果，Aβ可导致成簇的激活的小胶质细胞产生许多因子，可引起正反馈，造成βAPP代谢异常更为严重，非纤丝状Aβ转变为纤丝状Aβ，从而加重疾病的发展。本实验进一步探讨该模型模拟AD神经病理学相关基因βAPP和βAPPmRNA表达的变化。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 12月龄Sprague—Dawley(SD)大鼠，雄，体重450±50g，由中国医学科学院实验动物研究所提供(动物号:SCXK11-00-0005)。动物于实验前1周运到实验室，在安静环境下分笼饲养，温度控制在22±1℃的范围内，相对湿度60%，光线自动控制，明(07:00—19:00)暗(19:00—07:00)交替，给予充足清洁饮水、摄食。
1.1.2 主要试剂 Amyloidβ-protein，Fragment1-40(Sigma公司，Lot59H49552)，抗Amyloidβ-protein多克隆抗体(Sanˉta Cruz Biotechnology，Inc)，SABC试剂盒以及DAB购自武汉BOSTER公司。PBS、4%多聚甲醛、刚果红染液(国产分析纯试剂配置)。APP(Anti-Amyloid Precursor Protein(APP)，C-Terminal from rabbit，A8717，MDLNumber:MFCD02095828)βAPPmRNA原位杂交试剂盒(MK1611)。
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1.2 方法
1.2.1 动物筛选与分组 用跳台实验筛选学习记忆功能正常大鼠入选实验。随机分为4组每组6只。
1.2.2 β-淀粉蛋白立体定向微注射于大鼠的右侧海马区 Aβ1～40用双蒸水配制成5g/L，-20℃保存。聚集态的Aβ 1-40 形成:Aβ 1-40 溶液在37℃保温箱中放置7d [6] 。模型组大鼠用10%的水合氯醛(0.035ml/kg)麻醉后，头顶部去毛，消毒皮肤并切开，用脑立体定位仪，参照包新明等著《大鼠脑立体定向图谱》，前囟后4mm，右侧旁开2.8mm，DV3mm)即为海马区注射点，在颅骨上用牙钻打孔，钻薄颅骨而不钻透，由微量注射器稍用力即透颅骨，缓慢注射2μl(10μg)Aβ 1-40 ，在5min内注完，并留针5min，缝合皮肤并消毒。单笼饲养至大鼠完全清醒。28天组术后第23天开始进行行为测试，测试结束后进行病理检查。
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1.2.3 观察指标
1.2.3.1 病理学检查 Morris迷宫测试后24h，大鼠深度麻醉(水合氯醛0.45g/kg)，经主动脉相继快速灌注生理盐水100ml，4%多聚甲醛(4℃)150ml，再以4%多聚甲醛1h内持续灌入。常规脱水包埋，石蜡切片，注射点附近连续冠状切片，片厚6μm，海马区连续切片15套，以备各种染色。取相同切面各4套，分别进行HE和甲醇刚果红染色以及β淀粉样蛋白和βAPP免疫组织化学染色，SABC法，参照试剂盒说明书进行。
1.2.3.2 βAPPmRNA原位杂交 采用Amyloid beta Protein Precursor ISH Detection Kit，MKl611，试剂盒购自武汉博士德公司。采用针对β—APP的寡核苷酸探针，经地高辛标记。由于采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术，并配合使用敏感性加强型的原位检测方法。结果观察:β-APP mRˉNA的细胞胞浆着色呈棕黄色。
, 百拇医药
1.2.4 摄像与图像分析 运用SPOTⅡDIAGNOSTIC INˉSTRUMENTINC成像系统照像，MetaMorph图像分析系统(Meta Imaging Series，TM4.5，Universal Imaging Corporation)分析。选取受损皮质和海马区域附近，在40×的视野下随机摄取图像3张，每组随机取3只动物，共计9个统计数据。摄像时注意定位要准确，各组所选部位尽量保持一致。图像分析时，首先选取阳性表达明显的照片，确定阳性表达部位，并规定阳性表达标准，保存。以后同一指标不同组照片均需以此标准分析，保证图像分析的均衡性。记录光密度值(Optical density Total)、阳性表达面积(AREA total)和平均灰度值(Average gray value Count)，以代表阳性表达面积和强度。
1.2.5 统计学处理 各组数据均数±标准差表示，数据采用SPSS10.0for Windows进行方差分析和多重比较。
, http://www.100md.com 2 结果
2.1 βAPP在各实验组海马和皮质表达情况 见表1、图1、图2。模型组14天、28天海马与皮质βAPP阳性表达区光密度值和阳性表达面积均显著高于正常组海马与皮质相应数值(P<0.05，P<0.01)。其中，14天海马和皮质βAPP阳 性表达区光密度值有略高于28天相应数值的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。
Table1 The protein expression of βAPP at rat hippocampus and cortex of each experiment group (略)
Fig1 The optical density total ofβAPP expression at rat hippocampus and cortex of each experiment group略
, http://www.100md.com Fig2 The AREA total ofβAPP expression at rat hippocampus and cortex of eac
h experiment group 略
2.2 βAPPmRNA在各实验组大鼠海马和皮质表达情况 见表2、图3、图4。模型组3天、14天、28天海马与皮质βAPPmRNA阳性表达区域光密度值，以及模型组28天海马阳性区域总面积数值分别高于正常组同区域数值(P<0.05)。模型组14天皮质βAPPmRNA阳性表达区光密度值与28天海马βAPPmRNA阳性表达面积明显高于模型组第3天的相应区域光密度值或阳性表达面积(P<0.05)。模型组28天海马βAPPmRNA阳性表达面积明显高于同组14天海马阳性表达面积(P<0.01)。
Table2 The expression of βAPPmRNA at rat hippocampus and cortex of each experiment group (略)
, 百拇医药
Fig3 The optical density total ofβAPPmRNA expression at rat hippocampus a
nd cortex of each experiment group 略
Fig4 The AREA total ofβAPPmRNA expression atrat hippocampus and cortex of each experiment group 略
3 讨论
βAP的前体蛋白(APP)剪切代谢成βAP是淀粉样蛋白沉积的主要原因。Aβ周围由轴突，产生胶质斑痕的星形胶质细胞和清除碎片的小胶质细胞所包绕。我们从行为学上来评价该模型，是相当成功的。病理学研究显现明显的海马与皮质神经元的损伤，海马细胞带损伤严重，周围细胞、血管水肿，伴有大量的小胶质细胞增生，血管周围出现β淀 粉样蛋白集聚。海马皮质大量β淀粉样物质沉积淀粉样蛋白集聚。进一步研究希望探讨Aβ所致拟痴呆模型相关基因的表达，以进一步验证模型与真实患者的符合度。
, 百拇医药
Aβ的聚集和沉积是AD的早期和必要的神经病理学特征 [7] 。研究发现，淀粉样前蛋白在分泌激素作用下经蛋白水解后产生Aβ。当β淀粉样蛋白在细胞外基质中达到一定量后可聚集并构成β样折叠。Aβ是一种正常的代谢产物。随着年龄的增长，无论是脑内清除Aβ的功能下降，还是Aβ合成量超过其清除量，都可导致Aβ在脑中的沉积。
目前认为β淀粉样蛋白沉积引起的炎症反应是阿尔茨海默病的病理机制核心。免疫组化显示老年斑中含有急性期反应蛋白、炎性细胞因子、补体蛋白、反应性小胶质细胞等。研究认为，βAPP基因5′端侧面有几个调控因子，包括神经生长因子和白细胞介素1，在某些组织中，它们的作用可导致βAPPmRNA水平增高。IL-l和IL-6等刺激下产生急性期蛋白质(acute phase proteins)，如激活的补体成分al-antichymotryin(ACT)等易使Aβ纤丝形成。βAPP的代谢异常是自发或作为环境和(或)遗传因子作用的结果，使Aβ产生增加和老年斑中、血管壁的沉积，在斑块临近有纤丝状Aβ沉积，成簇的激活的小胶质细胞产生许多因子，包括IL-l和IL-6，这些来自小胶质细胞的因子可引起正反馈，造成βAPP代谢异常更为严重，非纤丝状Aβ转变为纤丝状Aβ，从而加重疾病的发展。
, 百拇医药
我们的研究发现，模型组14天、28天海马与皮质βAPP阳性表达区光密度值和阳性表达面积均显著高于正常组海马与皮质相应数值(P<0.05，P<0.01)。模型组3天、14天、28天海马与皮质βAPPmRNA阳性表达区域光密度值，以及模型组28天海马阳性区域总面积数值分别高于正常组同区域数值(P<0.05)。提示，模型组14天海马和皮质βAPP阳性表达区光密度值有略高于28天相应数值的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。模型组14天皮质βAPPmˉRNA阳性表达区光密度值与28天海马βAPPmRNA阳性表达面积明显高于模型组第3天的相应区域光密度值或阳性表达面积(P<0.05)。模型组28天海马βAPPmRNA阳性表达面积明显高于同组14天海马阳性表达面积(P>0.01)。提示，该模型βAPPmRNA阳性表达增高可持续一定的时间，并且在海马区28天βAPPmRNA表达增加。我们的研究发现了明显的胶质细胞激活，并围绕Aβ沉积斑块，表现了典型的炎症反应现象。启动脑小胶质细胞的过度激活，这些高激活的小胶质细胞的产生似足以引起AD的炎症神经毒的特殊过程。另外，脑缺血和低灌注均可导致βAPP蛋白表达的增高，我们的病理研究发现，Aβ沉积区域有毛细血管的Aβ沉积，也有可能造成局部低灌注，但程度如何，是否起一定的作用，还需要进一步的研究。总之，该模型可使βAPPmRNA表达水平提高，可能来源于炎性反应和低灌注，同时βAPPmRNA水平的升高较好的模拟了AD的病理特征，为进一步的研究打下了基础。
, 百拇医药
参考文献
1 Hardy JA，Higgin GA.Alzheimers disease:the amyloid cascade hypothˉesis.Science，1992，256:184.
2 Arispe N，Rojas E，Dollard H.Alzheimer′s disease amyloid beta proˉtein forms calcium channels in bilayer membranes:blockaded by tromethamine and aluminum.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90:567.
3 Forloni G，Bugiani O，Tagliarini R.Apoptosis-mediated neurotoxicity induced by beta-amyloiol and prp fragments.Mol ChemNeuropathol，1996，28:(1-3):163.
, 百拇医药
4 Kowall，N W，Beal，MF，Busciglio，J，Duffy，L K，et al.An in vivo modˉel for the neurodegenerative effects ofβ-amyloid and protection by subˉstance P.Proc Natl Acad Sci，USA，1991，88:7247-7251.
5 Atsumi Nitta，Akio Itoh，Takaaki Hasegawa，et al.β-Amyloid protein-induced Alzheimer′s disease animal model.Neuroscience Letters，1994，170:63-66.
6 Giovannelli L，Casamenti F，Scali C，et al.Differential effect of amyloid peptidesβ-(1-40)andβ-(25-35)injections into the rat nucleus basalis.Neuroscience，1995，66:781-792.
, http://www.100md.com
7 Watson DJ，Lander AD，Selkoe DJ.Heparin-binding properties of the amyloidogenic peptides Abeta and amylin.Dependence on aggregation state and inhibition by Congo red.J Biol Chem，1997272(50):31617-31624.
基金项目:国家教育部“长江学者奖励计划”资助项目(2000-03)
作者单位:1 100070北京中医药大学东直门医院老年医学研究所
2 北京中医药大学病理教研室
(收稿日期:2002-05-26)
(编辑 曲全), http://www.100md.com(程龙)
关键词 Aβ AD大鼠模型 βAPP βAPPmRNA 表达
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)07-0580-04
Study on expression ofβAPPmRNA andβAPP in AD
rats model caused by Aβ
Cheng Long，Tian Jinzhou，Yin Junxiang，et al.
Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of
Traditional Chinese Medicine，Beijing100070.
【Abstract】 Objective To investigate the expression ofβAPP andβAPPmRNA of
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the AD rats model which were caused by Aβ.Methods 12month old SD rats were divided into four groups randomly.Model groups were injecˉtion with condensed Aβ 1-40 2μl(10μg)into rat right hippocampi.To make paraffin section after3day，14day and28day.To detectβAPP with SABC andβAPPmRNA expression with in situ hybridization.To analysisβAPP andβAPPmˉRNA expression withMetaMorph image analys
is system at hippocampi and cortex lesion regions.Results TheβAPP exˉpression optical density total and AREA total of model group14day，28day at hippocampi and
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cortex lesion regions were significantly higher than normal group at the same regions(P<0.05or P<0.01).TheβAPPmRNA expression optical density total of model
group3day，14day，28day at hippocampi and cortex lesion regions and AREA total of28day at hippocampi were significantly higher than normal group at the same regions.(P<0.05).Conclusion TheβAPP andβAPPmRNA expression of AD rats model which were caused by Aβincreased significantly.
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Key words Aβ AD rats model βAPP βAPPmRNA expression
老年斑(senile plagues，SPs)、脑血管内淀粉样蛋白(amyˉloid protein，AP)沉积和神经原纤维缠结(neurofibrillary tanˉgles，NFTs)是阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的三大病理特征，前二者的主要成分为淀粉样蛋白，后者也被证实具有淀粉样蛋白的特性或与其有关。多项研究发现Aβ是AD的原发事件 [1～3] 。因此，理解激活这一事件的分子作用的关键步骤对于在疾病的最早阶段阻断Aβ斑块形成这一治疗战略非常重要。研究发现，淀粉样前蛋白在分泌激素作用下经蛋白水解后产生Aβ。当β淀粉样蛋白在细胞外基质中达到一定量后可聚集并构成β样折叠。实验显示，直接注射入大鼠海马可造成AD的特征性病理变化 [4] 。1994年日本学者Atsumi Nitta等 [5] 研究者提出β-淀粉样蛋白脑内注射的大鼠可被用于AD的动物模型，应用β-淀粉样蛋白直接脑内注射建立AD动物模型的方法受到广泛重视。我们进行了Aβ所致拟痴呆大鼠模型行为学研究，发 现通过Mriss水迷宫检测，表明该模型在模拟AD认知障碍方面较为适宜，并且模拟了淀粉样蛋白沉积、淀粉样血管病变和神经元损害以及胶质细胞增生等病理特点。由于βAPP的代谢异常是自发或作为环境和(或)遗传因子作用的结果，Aβ可导致成簇的激活的小胶质细胞产生许多因子，可引起正反馈，造成βAPP代谢异常更为严重，非纤丝状Aβ转变为纤丝状Aβ，从而加重疾病的发展。本实验进一步探讨该模型模拟AD神经病理学相关基因βAPP和βAPPmRNA表达的变化。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 12月龄Sprague—Dawley(SD)大鼠，雄，体重450±50g，由中国医学科学院实验动物研究所提供(动物号:SCXK11-00-0005)。动物于实验前1周运到实验室，在安静环境下分笼饲养，温度控制在22±1℃的范围内，相对湿度60%，光线自动控制，明(07:00—19:00)暗(19:00—07:00)交替，给予充足清洁饮水、摄食。
1.1.2 主要试剂 Amyloidβ-protein，Fragment1-40(Sigma公司，Lot59H49552)，抗Amyloidβ-protein多克隆抗体(Sanˉta Cruz Biotechnology，Inc)，SABC试剂盒以及DAB购自武汉BOSTER公司。PBS、4%多聚甲醛、刚果红染液(国产分析纯试剂配置)。APP(Anti-Amyloid Precursor Protein(APP)，C-Terminal from rabbit，A8717，MDLNumber:MFCD02095828)βAPPmRNA原位杂交试剂盒(MK1611)。
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1.2 方法
1.2.1 动物筛选与分组 用跳台实验筛选学习记忆功能正常大鼠入选实验。随机分为4组每组6只。
1.2.2 β-淀粉蛋白立体定向微注射于大鼠的右侧海马区 Aβ1～40用双蒸水配制成5g/L，-20℃保存。聚集态的Aβ 1-40 形成:Aβ 1-40 溶液在37℃保温箱中放置7d [6] 。模型组大鼠用10%的水合氯醛(0.035ml/kg)麻醉后，头顶部去毛，消毒皮肤并切开，用脑立体定位仪，参照包新明等著《大鼠脑立体定向图谱》，前囟后4mm，右侧旁开2.8mm，DV3mm)即为海马区注射点，在颅骨上用牙钻打孔，钻薄颅骨而不钻透，由微量注射器稍用力即透颅骨，缓慢注射2μl(10μg)Aβ 1-40 ，在5min内注完，并留针5min，缝合皮肤并消毒。单笼饲养至大鼠完全清醒。28天组术后第23天开始进行行为测试，测试结束后进行病理检查。
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1.2.3 观察指标
1.2.3.1 病理学检查 Morris迷宫测试后24h，大鼠深度麻醉(水合氯醛0.45g/kg)，经主动脉相继快速灌注生理盐水100ml，4%多聚甲醛(4℃)150ml，再以4%多聚甲醛1h内持续灌入。常规脱水包埋，石蜡切片，注射点附近连续冠状切片，片厚6μm，海马区连续切片15套，以备各种染色。取相同切面各4套，分别进行HE和甲醇刚果红染色以及β淀粉样蛋白和βAPP免疫组织化学染色，SABC法，参照试剂盒说明书进行。
1.2.3.2 βAPPmRNA原位杂交 采用Amyloid beta Protein Precursor ISH Detection Kit，MKl611，试剂盒购自武汉博士德公司。采用针对β—APP的寡核苷酸探针，经地高辛标记。由于采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术，并配合使用敏感性加强型的原位检测方法。结果观察:β-APP mRˉNA的细胞胞浆着色呈棕黄色。
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1.2.4 摄像与图像分析 运用SPOTⅡDIAGNOSTIC INˉSTRUMENTINC成像系统照像，MetaMorph图像分析系统(Meta Imaging Series，TM4.5，Universal Imaging Corporation)分析。选取受损皮质和海马区域附近，在40×的视野下随机摄取图像3张，每组随机取3只动物，共计9个统计数据。摄像时注意定位要准确，各组所选部位尽量保持一致。图像分析时，首先选取阳性表达明显的照片，确定阳性表达部位，并规定阳性表达标准，保存。以后同一指标不同组照片均需以此标准分析，保证图像分析的均衡性。记录光密度值(Optical density Total)、阳性表达面积(AREA total)和平均灰度值(Average gray value Count)，以代表阳性表达面积和强度。
1.2.5 统计学处理 各组数据均数±标准差表示，数据采用SPSS10.0for Windows进行方差分析和多重比较。
, http://www.100md.com 2 结果
2.1 βAPP在各实验组海马和皮质表达情况 见表1、图1、图2。模型组14天、28天海马与皮质βAPP阳性表达区光密度值和阳性表达面积均显著高于正常组海马与皮质相应数值(P<0.05，P<0.01)。其中，14天海马和皮质βAPP阳 性表达区光密度值有略高于28天相应数值的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。
Table1 The protein expression of βAPP at rat hippocampus and cortex of each experiment group (略)
Fig1 The optical density total ofβAPP expression at rat hippocampus and cortex of each experiment group略
, http://www.100md.com Fig2 The AREA total ofβAPP expression at rat hippocampus and cortex of eac
h experiment group 略
2.2 βAPPmRNA在各实验组大鼠海马和皮质表达情况 见表2、图3、图4。模型组3天、14天、28天海马与皮质βAPPmRNA阳性表达区域光密度值，以及模型组28天海马阳性区域总面积数值分别高于正常组同区域数值(P<0.05)。模型组14天皮质βAPPmRNA阳性表达区光密度值与28天海马βAPPmRNA阳性表达面积明显高于模型组第3天的相应区域光密度值或阳性表达面积(P<0.05)。模型组28天海马βAPPmRNA阳性表达面积明显高于同组14天海马阳性表达面积(P<0.01)。
Table2 The expression of βAPPmRNA at rat hippocampus and cortex of each experiment group (略)
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Fig3 The optical density total ofβAPPmRNA expression at rat hippocampus a
nd cortex of each experiment group 略
Fig4 The AREA total ofβAPPmRNA expression atrat hippocampus and cortex of each experiment group 略
3 讨论
βAP的前体蛋白(APP)剪切代谢成βAP是淀粉样蛋白沉积的主要原因。Aβ周围由轴突，产生胶质斑痕的星形胶质细胞和清除碎片的小胶质细胞所包绕。我们从行为学上来评价该模型，是相当成功的。病理学研究显现明显的海马与皮质神经元的损伤，海马细胞带损伤严重，周围细胞、血管水肿，伴有大量的小胶质细胞增生，血管周围出现β淀 粉样蛋白集聚。海马皮质大量β淀粉样物质沉积淀粉样蛋白集聚。进一步研究希望探讨Aβ所致拟痴呆模型相关基因的表达，以进一步验证模型与真实患者的符合度。
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Aβ的聚集和沉积是AD的早期和必要的神经病理学特征 [7] 。研究发现，淀粉样前蛋白在分泌激素作用下经蛋白水解后产生Aβ。当β淀粉样蛋白在细胞外基质中达到一定量后可聚集并构成β样折叠。Aβ是一种正常的代谢产物。随着年龄的增长，无论是脑内清除Aβ的功能下降，还是Aβ合成量超过其清除量，都可导致Aβ在脑中的沉积。
目前认为β淀粉样蛋白沉积引起的炎症反应是阿尔茨海默病的病理机制核心。免疫组化显示老年斑中含有急性期反应蛋白、炎性细胞因子、补体蛋白、反应性小胶质细胞等。研究认为，βAPP基因5′端侧面有几个调控因子，包括神经生长因子和白细胞介素1，在某些组织中，它们的作用可导致βAPPmRNA水平增高。IL-l和IL-6等刺激下产生急性期蛋白质(acute phase proteins)，如激活的补体成分al-antichymotryin(ACT)等易使Aβ纤丝形成。βAPP的代谢异常是自发或作为环境和(或)遗传因子作用的结果，使Aβ产生增加和老年斑中、血管壁的沉积，在斑块临近有纤丝状Aβ沉积，成簇的激活的小胶质细胞产生许多因子，包括IL-l和IL-6，这些来自小胶质细胞的因子可引起正反馈，造成βAPP代谢异常更为严重，非纤丝状Aβ转变为纤丝状Aβ，从而加重疾病的发展。
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我们的研究发现，模型组14天、28天海马与皮质βAPP阳性表达区光密度值和阳性表达面积均显著高于正常组海马与皮质相应数值(P<0.05，P<0.01)。模型组3天、14天、28天海马与皮质βAPPmRNA阳性表达区域光密度值，以及模型组28天海马阳性区域总面积数值分别高于正常组同区域数值(P<0.05)。提示，模型组14天海马和皮质βAPP阳性表达区光密度值有略高于28天相应数值的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。模型组14天皮质βAPPmˉRNA阳性表达区光密度值与28天海马βAPPmRNA阳性表达面积明显高于模型组第3天的相应区域光密度值或阳性表达面积(P<0.05)。模型组28天海马βAPPmRNA阳性表达面积明显高于同组14天海马阳性表达面积(P>0.01)。提示，该模型βAPPmRNA阳性表达增高可持续一定的时间，并且在海马区28天βAPPmRNA表达增加。我们的研究发现了明显的胶质细胞激活，并围绕Aβ沉积斑块，表现了典型的炎症反应现象。启动脑小胶质细胞的过度激活，这些高激活的小胶质细胞的产生似足以引起AD的炎症神经毒的特殊过程。另外，脑缺血和低灌注均可导致βAPP蛋白表达的增高，我们的病理研究发现，Aβ沉积区域有毛细血管的Aβ沉积，也有可能造成局部低灌注，但程度如何，是否起一定的作用，还需要进一步的研究。总之，该模型可使βAPPmRNA表达水平提高，可能来源于炎性反应和低灌注，同时βAPPmRNA水平的升高较好的模拟了AD的病理特征，为进一步的研究打下了基础。
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参考文献
1 Hardy JA，Higgin GA.Alzheimers disease:the amyloid cascade hypothˉesis.Science，1992，256:184.
2 Arispe N，Rojas E，Dollard H.Alzheimer′s disease amyloid beta proˉtein forms calcium channels in bilayer membranes:blockaded by tromethamine and aluminum.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90:567.
3 Forloni G，Bugiani O，Tagliarini R.Apoptosis-mediated neurotoxicity induced by beta-amyloiol and prp fragments.Mol ChemNeuropathol，1996，28:(1-3):163.
, 百拇医药
4 Kowall，N W，Beal，MF，Busciglio，J，Duffy，L K，et al.An in vivo modˉel for the neurodegenerative effects ofβ-amyloid and protection by subˉstance P.Proc Natl Acad Sci，USA，1991，88:7247-7251.
5 Atsumi Nitta，Akio Itoh，Takaaki Hasegawa，et al.β-Amyloid protein-induced Alzheimer′s disease animal model.Neuroscience Letters，1994，170:63-66.
6 Giovannelli L，Casamenti F，Scali C，et al.Differential effect of amyloid peptidesβ-(1-40)andβ-(25-35)injections into the rat nucleus basalis.Neuroscience，1995，66:781-792.
, http://www.100md.com
7 Watson DJ，Lander AD，Selkoe DJ.Heparin-binding properties of the amyloidogenic peptides Abeta and amylin.Dependence on aggregation state and inhibition by Congo red.J Biol Chem，1997272(50):31617-31624.
基金项目:国家教育部“长江学者奖励计划”资助项目(2000-03)
作者单位:1 100070北京中医药大学东直门医院老年医学研究所
2 北京中医药大学病理教研室
(收稿日期:2002-05-26)
(编辑 曲全), http://www.100md.com(程龙)