利用多肿瘤组织芯片研究癌细胞增殖与侵袭行为
【摘要】 目的 研究多种常见肿瘤组织芯片在观察癌细胞增殖和侵袭行为中的作用。方法 在病理档案材料中选取10种常见恶性肿瘤及其癌旁或正常组织的石蜡包埋标本，HE染色切片定位穿刺部位，每一蜡块穿取直径0.6mm大小组织柱，排布成196点列阵的芯片;用Ki-67，p53，rasp21，nm-23和E-cadherin单抗和S-P法进行免疫组化染色，对各切片阳性细胞进行计数观察。结果 组织芯片经染色后结构完整，在肿瘤组织中Ki-67，p53和rasp21标记的阳性细胞比癌旁和正常组织明显增高，而大多数肿瘤中nm-23和E-cadherin表达减弱或丧失。结论组织芯片技术可以同时用于评价多种不同类型肿瘤样本的增殖活性和侵袭行为，为临床预后判断提供资料。
关键词 组织芯片 癌细胞 增殖 侵袭
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)06-0481-03
Tissue microarray technology and its preliminary application
, 百拇医药
in evaluation of proliferative acitivity and invasive behaviors in cancer cells
Zheng Yanhua，Han Ruigang，Zhang Jianzhong，et al.
Department of Pathology and Laboratory Medicine，306Hospital，Beijing100101.
【Abstract】 Objective To explore the methodology of tissue microarray(TMA)technology and its application in evaluation of proliferative activity and invasive behavior of cancer cells.Methods Beecher tissue arrayer was used to create a196-dot tissue microarray，derived from99cases of common carcinomas，and their para-cancerous tissues and corresponding normal tissues which were formalin-fixedand paraffin embedded.Hematoxylin-eosin and imˉmunohistochemical stains were performed to evaluate the morphology and expression of Ki-67，p53，rasp21，nm-23and E-cadherin in the specimens.The labeling index(LI)was calculated in the different groups of the tissues.Reˉsults Histological appearance was well preserved in the most dots of the TMA section.Labeling index of Ki-67，p53and rasp21in low-differentiated carcinoma was much higher than that in well-differentiated ones and para-cancerˉous and normal tissues.In the most of cancers，there was decreased or loss expression of nm-23and E-cadherin，with a significant difference from that in normal tissues.Conclusion Multiple-tumor TMA is a simple and easy-doing method，which can be widely used in evaluation of proliferative activity andinvasive behaviors of cancer cells in large-scale specimens，and it provides more information to judge the patients’prognosis.
, 百拇医药
Key words tissue microarray cancer cells proliferative activity invasive behaviors
组织芯片技术又称组织微阵列(tissue microarray，TMA) [1～5] ，是近年来发展起来的以形态学为基础的分子生物学新技术，是在一张切片上高通量获取组织学、基因和蛋白表达信息的新方法，因而倍受组织病理学家的青睐。本研究重点探讨多肿瘤TMA在评价上皮性恶性肿瘤细胞增殖与侵袭行为研究中的作用，为肿瘤的临床治疗和预后评估提供资料。
1 材料与方法
1.1 组织选取 从本院病理科档案材料中选取上皮性恶性肿瘤及其相关正常和增生性石蜡包埋组织99例，其中包括食管癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌和肝硬化各6例;上述癌旁组织或相应正常组织各3例。每一标本各取2点，共198点。所有标本均经10%甲醛溶液固定。
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1.2 组织芯片制作 对每一组织标本，均先观察HE切片以确定肿瘤部位。所用组织芯片仪及其0.6mm组织穿刺 ˇ 基金项目:全军十五科研基金课题(编号:01MA071)针均为Beecher Instruments产品。组织芯片制作流程如图1。
图1 组织芯片制作流程模式图:观察HE切片选择穿刺部位(A)，将穿刺组织柱放入预制石蜡模块中(B)并进行常规切片(C)(图略)
1.2.1 载玻片的准备 组织载玻片经过夜泡酸、充分清洗并烘干，用10%多聚赖氨酸或APES包被玻片，烘干备用。
1.2.2 组织芯片模块制备 莱卡石蜡(Leica Histowax)与蜂蜡(上海华灵)混合(比例为7:3)，制成2.2cm×3.5cm×1cm大小的空白蜡块。在该蜡块1.2cm×1.8cm范围内设计11×18点组织列阵，用组织芯片仪打孔制成模块。
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1.2.3 组织芯片的设计和制备 将蜡块放在39～42℃水浴中软化3min。然后，从组织块选定部位逐个取出0.6mm组织柱，随即推入预先设计的阵列模块中，排布成组织芯片。最后，将制成的组织芯片面朝下放在玻片上，于37℃放置30min;取出玻片与组织芯片，轻压玻片使组织柱在模块中排平。
1.3 组织芯片免疫组化标记 nm-23，E-cadherin，p53、c-myc、WAF单克隆抗体(SantaCruz)为北京中山公司馈赠，MIB-1(Beckman Coulter)为英国Aberdeen大学赵敏教授馈赠，按L-P法(Zymed检测试剂盒)进行染色。主要步骤为:微波抗原修复:95℃枸橼酸缓冲液中10min;一抗4℃下过夜;二抗和三抗室温下孵育各60min;DAB显色，苏木精复染。
1.4 标记指数(labeling index，LI)计算 选取每例/点阳性肿瘤细胞最多的高倍视野，由两人分别计数200个细胞中阳性细胞数，取其均值作为标记指数(LI)。用半定量表示:阴性(-)为LI<10%，弱阳性(+)为LI10%～20%，中度阳性(++)为LI21%～40%，强阳性(+++)为LI>40%。
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2 结果
2.1 大体及组织学观察 组织点列阵模块排列整齐(图2)，切片后可见组织例数/点样例数=195/198。经HE染色后，个别组织点发生了脱片、易位和皱折，但组织学可观测率仍为96%以上。每一肿瘤组织点中均可见具有诊断意义的肿瘤组织结构(图3)。
2.2 增殖相关抗原在不同肿瘤中的表达 见表1。Ki-67和p53表达为核着色，而c-myc和WAF(p21ras)阳性反应主要表现为胞浆呈棕黄色颗粒状。Ki-67阳性标记细胞见于各种肿瘤，其中以食管癌LI最高(图4)，达40%以上;胃腺癌、结肠癌、肺鳞癌和乳腺癌次之(LI20%～40%)，而正常和增生性结肠粘膜上皮亦见Ki-67标记细胞，但少于10%。p53阳性细胞仅见于恶性肿瘤(图5)，其阳性细胞数量与Ki-67标记细胞相平行，而正常和增生性组织未见p53表达。c-myc和WAF在上皮性恶性肿瘤呈较广谱性表达，尤以胃肠道肿瘤、乳腺和肺癌阳性细胞数量和阳性强度为高(图6)，正常和增生性组织中呈阴性或弱阳性表达。
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表1 10种常见肿瘤细胞增殖相关抗原表达强度(略)
2.3 nm-23和E-cadherin在不同肿瘤中的表达 见表2。正常和癌旁组织两种基因均见表达，其中nm-23主要为胞浆型表达，亦见核着色;E-cadherin表达主要位于胞膜，偶见胞浆着色。在所检测的10种常见上皮性恶性肿瘤中，nm-23和E-cadherin表达水平在不同类型肿瘤中具有明显差异，即大多数高度侵袭性生长恶性肿瘤nm-23和E-cadherin表达明显减弱，约1/3肿瘤未见表达，而个别肿瘤表达增强(图7)。其中大多数食管癌、胃腺癌、结肠癌和胰腺癌等两者表达水平均明显减低或丧失(图8)。(图2～8 略)
表2 10种常见肿瘤细胞凋亡相关抗原表达强度
3 讨论
研究表明，调控细胞增生、死亡和分化的许多基因及其信号通路与肿瘤的发生发展有关 [6～8] 。基因芯片及基因表达谱分析等新技术使得一次分析数千种基因改变成为可能，进而发现了许多新的具有潜在重要意义的癌相关基因。但是，基因芯片等筛查技术只能一次检测一种肿瘤，而确定哪种肿瘤存在某一特定肿瘤基因的扩增常常需要大量繁杂单调的工作，因此迫切需要一种从处于疾病不同阶段或不同肿瘤患者的数百种标本中确立那些对于诊断、治疗和预后均具有重要意义的候选基因的方法。因此，TMA技术应运而生。为便于对多种不同肿瘤进行快速分子筛查，我们构建了由10种常见肿瘤和相应正常组织的198点阵列组织芯片，对于评价肿瘤细胞增殖与侵袭行为具有重要价值。
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免疫组化染色是通过检测增殖细胞相关抗原来判断细胞活性的方法，其中最常用的指标物是Ki-67 [9～11] 。该抗体只识别G 1 、G 2 、M和S期细胞，G 0 期细胞不表达该抗原。起初Ki-67只能在新鲜组织冰冻切片上工作，在一定程度上限制了其应用范围;后来发展起来的抗体MIB-1可与石蜡包埋组织反应，其应用范围大大拓宽，是目前判断细胞增殖状态最好的标记物之一。研究表明，Ki-67与细胞周期增殖相关蛋白之作用相一致，在肿瘤的转移与预后关系评估中具有重要意义 [12，13] 。LI与核分裂指数在某些肿瘤中亦具有密切相关性;本组病例结果显示，伴有广泛浸润和淋巴结转移的低分化癌之LI明显高于高分化肿瘤组，提示MIB-1标记在肿瘤生物学行为判断中的价值。但不同肿瘤类型及其在不同部位的表达的意义可能有所差异，在临床生物学行为的评估中应结合其它指标。组织芯片免疫细胞化学分析蛋白表达的技术已经成熟，但石蜡包埋组织芯片mRNA分析方法(原位杂交或FISH)尚有待于进一步完善。
研究表明 [14] ，在癌细胞和生长活跃的细胞中，p53蛋白表达量是正常细胞的5倍。p53基因突变产生的蛋白构型发生改变，使蛋白的稳定性增加，半衰期延长，再加上组织内的各种病毒蛋白、正常等位基因蛋白、SV40大T抗原和热休克蛋白，形成一寡聚蛋白复合物，导致p53蛋白稳定性进一步升高。临床研究工作中我们也发现，p53蛋白高表达与肿瘤的恶性程度和增殖活性呈正比，生长活跃、高侵袭性肿瘤往往伴有p53以及其它癌基因(如ras、c-myc等)蛋白表达增强。因此，细胞增殖相关癌基因和Ki-67合用，可以更精确的反映肿瘤细胞的生物学行为 [15，16] 。
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肿瘤转移与基因的异常表达有关，其中转移抑制基因nm23基因表达降低、等位基因缺失和表达产物分布异常与肿瘤的高转移能力和易复发有关 [17，18] 。Terasaki-Fukuzawa等 [19] 在44例乳腺癌中发现17例呈nm23弥漫性阳性表达，其中4例(23%)出现淋巴结转移;27例呈nm23局限性或阴性表达，其中18例(66.7%)发生淋巴结转移，而有转移者和无转移者Ki-67标记指数差异无显著性，说明肿瘤细胞增殖活性与转移无关。本研究发现，nm23在10种恶性肿瘤中的表达有明显异质性，主要为胞浆阳性表达，亦可出现在核和胞膜染色。本组病例nm23表达丧失对于转移评估的价值有赖于大宗病例的研究。
E-cadherin是一种钙依赖性细胞粘附分子，属于维持上皮单层性的蛋白家族。该基因位于16q24，在恶性肿瘤中常出现该区域等位基因缺失。一般认为，癌组织具有特征性细胞粘附丧失与E-cadherin蛋白功能破坏有关 [20，21] 。免疫组化检测E-cadherin功能状态具有不管其失活机制如何(等位基因丢失、突变或高甲基化)均可进行的优点，比任何单一基因分析方法获取信息更多，因此可用于临床标本的检测。本组10种肿瘤具有不同程度的E-cadherin丢失，特别是高恶性程度者更为明显，结合nm23等指标，对于判断肿瘤的侵袭行为具有重要参考价值。
, 百拇医药
参考文献
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, http://www.100md.com 4 Zhang JZ.Tissue microarray technology and its preliminary application in the study of large intestinal carcinoma.Histopathology，2002，41(1):15，006.
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7 Manley S，Mucci NR，De Marzo AM，et al.Relational database structure to image high-density tissue microarray data and images for pathology studies focusing on clinical outcome:the prostate specialized program of research excellence model.Am J Pathol，2001，159:837-843.
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(收稿日期:2003-03-13) (编辑 小川), 百拇医药(郑燕华)
关键词 组织芯片 癌细胞 增殖 侵袭
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)06-0481-03
Tissue microarray technology and its preliminary application
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in evaluation of proliferative acitivity and invasive behaviors in cancer cells
Zheng Yanhua，Han Ruigang，Zhang Jianzhong，et al.
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【Abstract】 Objective To explore the methodology of tissue microarray(TMA)technology and its application in evaluation of proliferative activity and invasive behavior of cancer cells.Methods Beecher tissue arrayer was used to create a196-dot tissue microarray，derived from99cases of common carcinomas，and their para-cancerous tissues and corresponding normal tissues which were formalin-fixedand paraffin embedded.Hematoxylin-eosin and imˉmunohistochemical stains were performed to evaluate the morphology and expression of Ki-67，p53，rasp21，nm-23and E-cadherin in the specimens.The labeling index(LI)was calculated in the different groups of the tissues.Reˉsults Histological appearance was well preserved in the most dots of the TMA section.Labeling index of Ki-67，p53and rasp21in low-differentiated carcinoma was much higher than that in well-differentiated ones and para-cancerˉous and normal tissues.In the most of cancers，there was decreased or loss expression of nm-23and E-cadherin，with a significant difference from that in normal tissues.Conclusion Multiple-tumor TMA is a simple and easy-doing method，which can be widely used in evaluation of proliferative activity andinvasive behaviors of cancer cells in large-scale specimens，and it provides more information to judge the patients’prognosis.
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1.2 组织芯片制作 对每一组织标本，均先观察HE切片以确定肿瘤部位。所用组织芯片仪及其0.6mm组织穿刺 ˇ 基金项目:全军十五科研基金课题(编号:01MA071)针均为Beecher Instruments产品。组织芯片制作流程如图1。
图1 组织芯片制作流程模式图:观察HE切片选择穿刺部位(A)，将穿刺组织柱放入预制石蜡模块中(B)并进行常规切片(C)(图略)
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1.2.3 组织芯片的设计和制备 将蜡块放在39～42℃水浴中软化3min。然后，从组织块选定部位逐个取出0.6mm组织柱，随即推入预先设计的阵列模块中，排布成组织芯片。最后，将制成的组织芯片面朝下放在玻片上，于37℃放置30min;取出玻片与组织芯片，轻压玻片使组织柱在模块中排平。
1.3 组织芯片免疫组化标记 nm-23，E-cadherin，p53、c-myc、WAF单克隆抗体(SantaCruz)为北京中山公司馈赠，MIB-1(Beckman Coulter)为英国Aberdeen大学赵敏教授馈赠，按L-P法(Zymed检测试剂盒)进行染色。主要步骤为:微波抗原修复:95℃枸橼酸缓冲液中10min;一抗4℃下过夜;二抗和三抗室温下孵育各60min;DAB显色，苏木精复染。
1.4 标记指数(labeling index，LI)计算 选取每例/点阳性肿瘤细胞最多的高倍视野，由两人分别计数200个细胞中阳性细胞数，取其均值作为标记指数(LI)。用半定量表示:阴性(-)为LI<10%，弱阳性(+)为LI10%～20%，中度阳性(++)为LI21%～40%，强阳性(+++)为LI>40%。
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2 结果
2.1 大体及组织学观察 组织点列阵模块排列整齐(图2)，切片后可见组织例数/点样例数=195/198。经HE染色后，个别组织点发生了脱片、易位和皱折，但组织学可观测率仍为96%以上。每一肿瘤组织点中均可见具有诊断意义的肿瘤组织结构(图3)。
2.2 增殖相关抗原在不同肿瘤中的表达 见表1。Ki-67和p53表达为核着色，而c-myc和WAF(p21ras)阳性反应主要表现为胞浆呈棕黄色颗粒状。Ki-67阳性标记细胞见于各种肿瘤，其中以食管癌LI最高(图4)，达40%以上;胃腺癌、结肠癌、肺鳞癌和乳腺癌次之(LI20%～40%)，而正常和增生性结肠粘膜上皮亦见Ki-67标记细胞，但少于10%。p53阳性细胞仅见于恶性肿瘤(图5)，其阳性细胞数量与Ki-67标记细胞相平行，而正常和增生性组织未见p53表达。c-myc和WAF在上皮性恶性肿瘤呈较广谱性表达，尤以胃肠道肿瘤、乳腺和肺癌阳性细胞数量和阳性强度为高(图6)，正常和增生性组织中呈阴性或弱阳性表达。
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表1 10种常见肿瘤细胞增殖相关抗原表达强度(略)
2.3 nm-23和E-cadherin在不同肿瘤中的表达 见表2。正常和癌旁组织两种基因均见表达，其中nm-23主要为胞浆型表达，亦见核着色;E-cadherin表达主要位于胞膜，偶见胞浆着色。在所检测的10种常见上皮性恶性肿瘤中，nm-23和E-cadherin表达水平在不同类型肿瘤中具有明显差异，即大多数高度侵袭性生长恶性肿瘤nm-23和E-cadherin表达明显减弱，约1/3肿瘤未见表达，而个别肿瘤表达增强(图7)。其中大多数食管癌、胃腺癌、结肠癌和胰腺癌等两者表达水平均明显减低或丧失(图8)。(图2～8 略)
表2 10种常见肿瘤细胞凋亡相关抗原表达强度
3 讨论
研究表明，调控细胞增生、死亡和分化的许多基因及其信号通路与肿瘤的发生发展有关 [6～8] 。基因芯片及基因表达谱分析等新技术使得一次分析数千种基因改变成为可能，进而发现了许多新的具有潜在重要意义的癌相关基因。但是，基因芯片等筛查技术只能一次检测一种肿瘤，而确定哪种肿瘤存在某一特定肿瘤基因的扩增常常需要大量繁杂单调的工作，因此迫切需要一种从处于疾病不同阶段或不同肿瘤患者的数百种标本中确立那些对于诊断、治疗和预后均具有重要意义的候选基因的方法。因此，TMA技术应运而生。为便于对多种不同肿瘤进行快速分子筛查，我们构建了由10种常见肿瘤和相应正常组织的198点阵列组织芯片，对于评价肿瘤细胞增殖与侵袭行为具有重要价值。
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免疫组化染色是通过检测增殖细胞相关抗原来判断细胞活性的方法，其中最常用的指标物是Ki-67 [9～11] 。该抗体只识别G 1 、G 2 、M和S期细胞，G 0 期细胞不表达该抗原。起初Ki-67只能在新鲜组织冰冻切片上工作，在一定程度上限制了其应用范围;后来发展起来的抗体MIB-1可与石蜡包埋组织反应，其应用范围大大拓宽，是目前判断细胞增殖状态最好的标记物之一。研究表明，Ki-67与细胞周期增殖相关蛋白之作用相一致，在肿瘤的转移与预后关系评估中具有重要意义 [12，13] 。LI与核分裂指数在某些肿瘤中亦具有密切相关性;本组病例结果显示，伴有广泛浸润和淋巴结转移的低分化癌之LI明显高于高分化肿瘤组，提示MIB-1标记在肿瘤生物学行为判断中的价值。但不同肿瘤类型及其在不同部位的表达的意义可能有所差异，在临床生物学行为的评估中应结合其它指标。组织芯片免疫细胞化学分析蛋白表达的技术已经成熟，但石蜡包埋组织芯片mRNA分析方法(原位杂交或FISH)尚有待于进一步完善。
研究表明 [14] ，在癌细胞和生长活跃的细胞中，p53蛋白表达量是正常细胞的5倍。p53基因突变产生的蛋白构型发生改变，使蛋白的稳定性增加，半衰期延长，再加上组织内的各种病毒蛋白、正常等位基因蛋白、SV40大T抗原和热休克蛋白，形成一寡聚蛋白复合物，导致p53蛋白稳定性进一步升高。临床研究工作中我们也发现，p53蛋白高表达与肿瘤的恶性程度和增殖活性呈正比，生长活跃、高侵袭性肿瘤往往伴有p53以及其它癌基因(如ras、c-myc等)蛋白表达增强。因此，细胞增殖相关癌基因和Ki-67合用，可以更精确的反映肿瘤细胞的生物学行为 [15，16] 。
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E-cadherin是一种钙依赖性细胞粘附分子，属于维持上皮单层性的蛋白家族。该基因位于16q24，在恶性肿瘤中常出现该区域等位基因缺失。一般认为，癌组织具有特征性细胞粘附丧失与E-cadherin蛋白功能破坏有关 [20，21] 。免疫组化检测E-cadherin功能状态具有不管其失活机制如何(等位基因丢失、突变或高甲基化)均可进行的优点，比任何单一基因分析方法获取信息更多，因此可用于临床标本的检测。本组10种肿瘤具有不同程度的E-cadherin丢失，特别是高恶性程度者更为明显，结合nm23等指标，对于判断肿瘤的侵袭行为具有重要参考价值。
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(收稿日期:2003-03-13) (编辑 小川), 百拇医药(郑燕华)