树突状细胞的制备及其辅佐功能的实验研究
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中华医学研究杂志 2003年2月 第3卷 第2期
【摘要】 目的 探讨应用外周血体外扩增树突状细胞(DC)的方法及DC的辅佐功能。方法 分离人外周血单核细胞，应用GM-CSF，IL-4及TNF-α培养观察，并应用MTT法检测DCs在同种混合淋巴细胞反应(MLR)中激发同种T淋巴细胞增殖的能力。结果 经体外诱导扩增，可将外周血单核细胞定向诱导大量的具有典型DC形态的树突状细胞。混合淋巴细胞反应结果提示，只需少量DC，即可强烈激发同种T淋巴细胞增殖。结论 (1)用GM-CSF、IL-4及TNF-α能从人外周血诱导、扩增出DC;(2)DC具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。
关键词 树突状细胞 混合淋巴细胞反应 粒细胞-巨细胞集落刺激因子 白细胞介素-4 肿瘤坏死因子α
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)02-0099-02
Study on the preparation of dendritic cells(DC)and its assisted function of stimulating T lymphocyte
, 百拇医药
Xu Fu，Sun Jingli，Wang Xiliang，et al.
202th Hospital of PLA，Shenyang110003.
【Abstract】 Objective To investigate the method of preparation of dendritc cells(DCs)from peripheral blood mononuclear cells and the assisted function of DCs in mixed lymphocyte reaction(MLR).Methods Mononuclear cells were isolated from peripheral blood and were used to culture with cytokines including GM-CSF，IL-4and TNF-α.Harvested cells were detected for observation analysis by microscope.The proliferation ability of allogeneic T cells stimulated by DCs were observed by MTT method.Results Differentiation DCs from peripheral blood mononuclear cells have a typical morphology.In the MLR only a little number of dendritic cells can stimulate the proliferation of alˉlogeneic T cells efficiently.ConclutionDCs can be preparated from peripherad blood mononulcear cells by GM-CSF，IL-4and TNF-α，the DCs are potent stimulating function in MLR.
, 百拇医药
Key words dendritic cell mixed lymphocyte reaction monocyte granulocyte-macrophage colony stimulating factor interleukin-4 tumor necrosis factor-α
树突状细胞(DC)是体内最强的抗原递呈细胞，研究发现，DC在肿瘤免疫、抗感染免疫、移植免疫及自身免疫性疾病中发挥重要作用，正常人外周血中DC数量极少，这给DC的研究和应用带来极大困难。本实验探讨了应用人外周血单核细胞体外培养诱导扩增DC的方法及DC对淋巴细胞的刺激增殖作用。
1 材料和方法
1.1 材料 rhGM-CSF，北京医科大学免疫室;rhIL-4和TNF-α，PeproTech EC Ltd;MTT，Sigma公司;RPMI1640GIBˉCO公司;淋巴细胞分离液为Pharmacia产品;丝裂霉素日本产;胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);LC400型酶联免疫检测仪(法国产)。
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1.2 方法
1.2.1 DC的体外培养 采用朱学军等 [1] 报道的方法加以改进。常规分离健康志愿者外周血单核细胞，取抗凝外周血，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，离心2000r/min，25min，取中间层用Hanks液洗3遍，细胞计数，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调至细胞浓度为1×10 6 /ml，加入24孔板，每孔1ml，5%CO 2 、37℃孵箱培养3h，吸弃上清及悬浮细胞，贴壁的单核细胞，加入细胞培养液，同时加入rhIL-4(400U/ml)，rhGM-CSF，设不同浓度组:100ng/ml、200ng/ml、 400ng/ml，培养1周时半量换液，同时补充上述细胞因子，定期观察细胞生长情况，培养至10天加入TNF-α，继续培养，观察第21天时细胞数量达到最多，培养至28天，收获不同时期细胞14天、21天及28天，分别观察细胞形态，同时进行混合淋巴细胞反应。
1.2.2 同种混合淋巴细胞反应(MLR) 分离其他正常人外周血单个核细胞，同上方法培养3h，取上清及悬浮细胞，调至细胞数为10 6 /ml，以每孔1×10 5 细胞种于圆底96孔板中，DC先用丝裂霉素25μl/ml处理45min，Hanks洗4遍，用RPMI1640调至细胞浓度10 5 /ml，分成不同组，2×10 3 /孔、5×10 3 /孔、1×10 4 /孔加入效应细胞孔中，效靶比(DC:淋巴细胞)分别为10:1、20:1、50:1，阴性孔不加DC，每组设3个复孔，培养96h，加入MTT20μl(5mg/ml)，培养4h，吸去上清加入150μl二甲亚砜(DMSO)，振荡5min，使结晶充分溶解，用酶联免疫检测仪于570nm处，测OD值并记录结果，结果用3孔均值表示。
, 百拇医药
2 结果
2.1 DC生长观察 分离外周血单核细胞经GM-CSF和IL-4培养扩增，培养3天开始分裂增殖，开始出现少量体积大的细胞，细胞膜不规则，随着培养时间延长，数量越来越多，体积逐渐增大，形态不规则，并开始脱壁生长，第10天加入TNF-α后细胞进入对数增殖期，形成大量细胞集落，胞核呈不规则形态，表面有突起，集落中细胞体积逐渐增大，细胞体积可达淋巴细胞的数倍，培养到14天时大部分细胞脱壁，细胞形态与成熟DC基本相同(图1、图2，见封三)。21天以后细胞增殖迅速减慢，绝大部分为悬浮细胞，并开始出现细胞坏死溶解，所设不同组之间，细胞形态及数量差别不大，即GM-CSF在100、200、400ng/ml不同浓度之间形成DC的数量无明显差别。
2.2 同种混合淋巴细胞反应 混合淋巴细胞反应所测OD值结果见表1。表1 不同浓度DC在MLR中的刺激作用的比较注:经t检验， ˇ P<0.05; ˇˇ P<0.01结果提示:少量DC即可强烈激发T淋巴细胞的增殖，DC组与对照组比较，OD值均有显著差异，并随着DC浓度增加而刺激作用逐渐增强，即DC浓度与其刺激淋巴细胞增殖功能成正比。
, 百拇医药
3 讨论
DC是目前已知功能最强的专职抗原提呈细胞，并能在体内激活静止T淋巴细胞，从而激发初次免疫反应。有研究证明，在肿瘤患者体内存在肿瘤细胞逃避DC抗原提呈的机制。
近几年研究认为DC在肿瘤的发生及发展过程中起着重要的作用，肿瘤病人外周血DC功能减退[2] ，肿瘤病灶局部的DC数量及功能与肿瘤的复发和转移有关 [3] 。DC在体外扩增成功，为下一步DC在临床的应用打下良好的基础，其体外获得DC的方法有很多，实验表明，可通过骨 髓、脾、外周血及脐带血等分离培养获取DC。但应用于临床治疗要求简便易行，对病人损伤小，病人又容易接受的方法，通过外周血体外培养获取DC的方法具有上述特点，并且可在体外扩增达到临床所需要的数量级，因此，这种方法对于DC临床应用具有非常重要的意义。本实验结果提示，IL-4和GM-CSF用量在达到一定量后，增加浓度并不能使DC数量进一步增加。在DC培养过程中，一般在14～21天时数量迅速增加，分化成熟，具有典型的DC形态。因此我们认为在此期间收获的DC数量及功能为最佳。DC具有刺激淋巴细胞增殖的特性，少量DC即可刺激淋巴细胞增殖，表1提示加入DC组的OD值均明显高于对照组，提示DC具有明确的刺激淋巴细胞增殖的功能，并随着DC浓度增加而其刺激作用逐渐增大。
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DC在肿瘤治疗中的作用现已逐渐引起人们的重视，应用DC相关的肿瘤疫苗，在动物实验中已被证实有效，有些方案已用于临床，取得了一定的疗效 [4] ，但还存在DC疫苗特异性不高，持久性差等问题有待于进一步深入研究。
参考文献
1 朱学军，曹雪涛，于益芝，等.人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定.中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4(4):302-306.
2 Gabrilovich DI，Corak J，Ciernik IF，et al.Decreased antigen presentaˉtion by dendritic cells in patients with breast cancer.Clin Cancer Res，1997，13(3)，483-490.
3 Maehara Y，Tomisaki S，Oda S，et al.Lymph node metastasis and relaˉtion to tumor growth potential and local immune response in advanced gastric cancer.Int J Cancer，1997，74(2):224-228.
4 Lodge PA，Jones LA，Bader RA，et al.Dendritic cell-based imˉmunotherapy of prostate cancer:immune monitoring of aphaseⅡcliniˉcal trial.Cancer Res，2000，60(4):829-833.
(收稿日期:2002-10-13)
作者单位:110003沈阳解放军第202医院
(编辑何 蓓), http://www.100md.com(徐)
关键词 树突状细胞 混合淋巴细胞反应 粒细胞-巨细胞集落刺激因子 白细胞介素-4 肿瘤坏死因子α
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)02-0099-02
Study on the preparation of dendritic cells(DC)and its assisted function of stimulating T lymphocyte
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Xu Fu，Sun Jingli，Wang Xiliang，et al.
202th Hospital of PLA，Shenyang110003.
【Abstract】 Objective To investigate the method of preparation of dendritc cells(DCs)from peripheral blood mononuclear cells and the assisted function of DCs in mixed lymphocyte reaction(MLR).Methods Mononuclear cells were isolated from peripheral blood and were used to culture with cytokines including GM-CSF，IL-4and TNF-α.Harvested cells were detected for observation analysis by microscope.The proliferation ability of allogeneic T cells stimulated by DCs were observed by MTT method.Results Differentiation DCs from peripheral blood mononuclear cells have a typical morphology.In the MLR only a little number of dendritic cells can stimulate the proliferation of alˉlogeneic T cells efficiently.ConclutionDCs can be preparated from peripherad blood mononulcear cells by GM-CSF，IL-4and TNF-α，the DCs are potent stimulating function in MLR.
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Key words dendritic cell mixed lymphocyte reaction monocyte granulocyte-macrophage colony stimulating factor interleukin-4 tumor necrosis factor-α
树突状细胞(DC)是体内最强的抗原递呈细胞，研究发现，DC在肿瘤免疫、抗感染免疫、移植免疫及自身免疫性疾病中发挥重要作用，正常人外周血中DC数量极少，这给DC的研究和应用带来极大困难。本实验探讨了应用人外周血单核细胞体外培养诱导扩增DC的方法及DC对淋巴细胞的刺激增殖作用。
1 材料和方法
1.1 材料 rhGM-CSF，北京医科大学免疫室;rhIL-4和TNF-α，PeproTech EC Ltd;MTT，Sigma公司;RPMI1640GIBˉCO公司;淋巴细胞分离液为Pharmacia产品;丝裂霉素日本产;胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);LC400型酶联免疫检测仪(法国产)。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 DC的体外培养 采用朱学军等 [1] 报道的方法加以改进。常规分离健康志愿者外周血单核细胞，取抗凝外周血，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，离心2000r/min，25min，取中间层用Hanks液洗3遍，细胞计数，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调至细胞浓度为1×10 6 /ml，加入24孔板，每孔1ml，5%CO 2 、37℃孵箱培养3h，吸弃上清及悬浮细胞，贴壁的单核细胞，加入细胞培养液，同时加入rhIL-4(400U/ml)，rhGM-CSF，设不同浓度组:100ng/ml、200ng/ml、 400ng/ml，培养1周时半量换液，同时补充上述细胞因子，定期观察细胞生长情况，培养至10天加入TNF-α，继续培养，观察第21天时细胞数量达到最多，培养至28天，收获不同时期细胞14天、21天及28天，分别观察细胞形态，同时进行混合淋巴细胞反应。
1.2.2 同种混合淋巴细胞反应(MLR) 分离其他正常人外周血单个核细胞，同上方法培养3h，取上清及悬浮细胞，调至细胞数为10 6 /ml，以每孔1×10 5 细胞种于圆底96孔板中，DC先用丝裂霉素25μl/ml处理45min，Hanks洗4遍，用RPMI1640调至细胞浓度10 5 /ml，分成不同组，2×10 3 /孔、5×10 3 /孔、1×10 4 /孔加入效应细胞孔中，效靶比(DC:淋巴细胞)分别为10:1、20:1、50:1，阴性孔不加DC，每组设3个复孔，培养96h，加入MTT20μl(5mg/ml)，培养4h，吸去上清加入150μl二甲亚砜(DMSO)，振荡5min，使结晶充分溶解，用酶联免疫检测仪于570nm处，测OD值并记录结果，结果用3孔均值表示。
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2 结果
2.1 DC生长观察 分离外周血单核细胞经GM-CSF和IL-4培养扩增，培养3天开始分裂增殖，开始出现少量体积大的细胞，细胞膜不规则，随着培养时间延长，数量越来越多，体积逐渐增大，形态不规则，并开始脱壁生长，第10天加入TNF-α后细胞进入对数增殖期，形成大量细胞集落，胞核呈不规则形态，表面有突起，集落中细胞体积逐渐增大，细胞体积可达淋巴细胞的数倍，培养到14天时大部分细胞脱壁，细胞形态与成熟DC基本相同(图1、图2，见封三)。21天以后细胞增殖迅速减慢，绝大部分为悬浮细胞，并开始出现细胞坏死溶解，所设不同组之间，细胞形态及数量差别不大，即GM-CSF在100、200、400ng/ml不同浓度之间形成DC的数量无明显差别。
2.2 同种混合淋巴细胞反应 混合淋巴细胞反应所测OD值结果见表1。表1 不同浓度DC在MLR中的刺激作用的比较注:经t检验， ˇ P<0.05; ˇˇ P<0.01结果提示:少量DC即可强烈激发T淋巴细胞的增殖，DC组与对照组比较，OD值均有显著差异，并随着DC浓度增加而刺激作用逐渐增强，即DC浓度与其刺激淋巴细胞增殖功能成正比。
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3 讨论
DC是目前已知功能最强的专职抗原提呈细胞，并能在体内激活静止T淋巴细胞，从而激发初次免疫反应。有研究证明，在肿瘤患者体内存在肿瘤细胞逃避DC抗原提呈的机制。
近几年研究认为DC在肿瘤的发生及发展过程中起着重要的作用，肿瘤病人外周血DC功能减退[2] ，肿瘤病灶局部的DC数量及功能与肿瘤的复发和转移有关 [3] 。DC在体外扩增成功，为下一步DC在临床的应用打下良好的基础，其体外获得DC的方法有很多，实验表明，可通过骨 髓、脾、外周血及脐带血等分离培养获取DC。但应用于临床治疗要求简便易行，对病人损伤小，病人又容易接受的方法，通过外周血体外培养获取DC的方法具有上述特点，并且可在体外扩增达到临床所需要的数量级，因此，这种方法对于DC临床应用具有非常重要的意义。本实验结果提示，IL-4和GM-CSF用量在达到一定量后，增加浓度并不能使DC数量进一步增加。在DC培养过程中，一般在14～21天时数量迅速增加，分化成熟，具有典型的DC形态。因此我们认为在此期间收获的DC数量及功能为最佳。DC具有刺激淋巴细胞增殖的特性，少量DC即可刺激淋巴细胞增殖，表1提示加入DC组的OD值均明显高于对照组，提示DC具有明确的刺激淋巴细胞增殖的功能，并随着DC浓度增加而其刺激作用逐渐增大。
, http://www.100md.com
DC在肿瘤治疗中的作用现已逐渐引起人们的重视，应用DC相关的肿瘤疫苗，在动物实验中已被证实有效，有些方案已用于临床，取得了一定的疗效 [4] ，但还存在DC疫苗特异性不高，持久性差等问题有待于进一步深入研究。
参考文献
1 朱学军，曹雪涛，于益芝，等.人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定.中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4(4):302-306.
2 Gabrilovich DI，Corak J，Ciernik IF，et al.Decreased antigen presentaˉtion by dendritic cells in patients with breast cancer.Clin Cancer Res，1997，13(3)，483-490.
3 Maehara Y，Tomisaki S，Oda S，et al.Lymph node metastasis and relaˉtion to tumor growth potential and local immune response in advanced gastric cancer.Int J Cancer，1997，74(2):224-228.
4 Lodge PA，Jones LA，Bader RA，et al.Dendritic cell-based imˉmunotherapy of prostate cancer:immune monitoring of aphaseⅡcliniˉcal trial.Cancer Res，2000，60(4):829-833.
(收稿日期:2002-10-13)
作者单位:110003沈阳解放军第202医院
(编辑何 蓓), http://www.100md.com(徐)