mtP53稳定性与化疗敏感性关系
http://www.100md.com
中华医学研究杂志 2003年4月 第3卷 第4期
【摘要】 目的 观察反义HSP70RNA对MCF-7/Adr人乳腺癌细胞耐药性影响，探讨其与mtP53稳定性和肿瘤耐药间的关系。方法 利用DNA重组技术构建反义人HSP70真核表达质粒pX-A HSP70。用脂质体方法将重组质粒转染至MCF-7/Adr人乳腺癌细胞，PCR确定转染细胞中外源DNA存在后，Western Blot检测HSP70蛋白的抑制程度。MTT法检测了对细胞耐药性的影响，P53稳定性实验分析反义HSP70RNA对mtP53半衰期的改变。结果 经G418筛选获得稳定表达反义HSP70RNA的细胞株MAp70，HSP70蛋白表达下降42%，细胞耐药性下降33.9%，P53稳定性实验表明，其胞内mtP53含量下降，半衰期缩短了6h，稳定性明显下降，以上参数与空载体MAX细胞相比，差异均有显著性。结论 反义HSP70RNA能够明显降低乳腺癌细胞的耐药性，提示HSP70可能通过增强mtP53稳定性的途径而参与肿瘤细胞耐药。
关键词 HSP70 mtP53 反义RNA 乳腺癌 耐药性 稳定性
, http://www.100md.com
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)04-0292-03
Association between stability of mtP53protein and
chemosensitivity in human breast cancer cell line
Zhao Mei，Fan Yunxia，Zhang Xun，et al.
Department of Etiology and Carcinogenesis，Cancer Institute，
Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing100021.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To find out the relationship between HSP70，stabilityof mtP53protein and chemosenˉsitivity in human breast cancer cell line，and toexplore the mechanism of antitumor drug resistance.Methods The antisense HSP70retroviral recombinant plasmid was constructed using DNA recombination technique，and transfected into MCF-7/Adr cells by lipofectin method.After the existence offoreign DNA was confirmed by PCR，the protein level of HSP70was detected using Western Blot.The chemosensitivity of MAp70cell to Adriamycin was detected by MTT assay.The half-life of mutant P53was detected using P53stability assay.Results The transfectant cell strain stably expression antisense HSP70was obtained throughG418selection，The inhibition of protein level of HSP70was42%.Chemosensitivity of MAp70cell to Adr increased obviously.Furthermore，The instability of mutant P53protein increased significantly.Conclusion Antisense HSP70RNA declined the drugresistance of MCF-7/Adr significantˉly，it predicted that HSP70may play an important role in multidrug resistance through increasing the stability of mutant P53protein in tumor cells.
, 百拇医药
Key words heat shock protein70 mtp53 antisense RNA breast neoplasm multidrugresistance stability
HSP(Heat Shock Protein)家族主要成员HSP70在喉癌等许多肿瘤组织和细胞中表达增高，与肿瘤耐药性的产生等密切相关。HSP90β可与P-gp蛋白形成复合物，介导肿瘤细胞的耐药，但HSP70、HSP90等多个热休克蛋白分子形成蛋白折叠体(Foldsome)共同辅助蛋白成熟 [1] 。在多种肿瘤组织或细胞中HSP70家族、HSP90家族成员与mtP53之间形成异源复合物，使mtP53的稳定性增强。探讨HSP70与mtP53和肿瘤耐药之间的关系，寻找新的逆转肿瘤耐药的途径及相应机理，利用反义RNA和基因转移技术，将本室构建的反义HSP70真核表达重组质粒转染至MCF7/Adr耐药型乳腺癌细胞(mtP53)，旨在探讨反义HSP70RNA对乳腺癌细胞耐药性的影响及其机理。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 基因、载体、菌株、细胞株 反义HSP70重组质粒pXA HSP70，空载体pLXSN-neo，DH5。菌株均由本室保存，MCF-7/Adr乳腺癌细胞株(耐阿霉素，mtP53)，由本所药理室惠赠。
1.2 主要试剂 Lipofectin○ R Reagent、PRMI1640、G418、购自GIBCO公司。限制性内切酶等常用试剂购自华美生物公司。小鼠抗人P53抗体(DO-1)，羊抗人HSP70多克隆抗体(J-20)购自Santa Cruz公司。鼠抗人α-Tubulin单克隆抗体(DM1A)购自Neo Markers公司。HRP偶联兔抗羊IgG(H+L)和羊抗鼠IgG(H+L)抗体均购自Jackson公司。蛋白合成抑制剂(clyclohexmide，CHX)，低分子量标准蛋白质(94kDa-14kDa)购自Sigma公司。
1.3 引物 HSP70DNA引物序列为:上游:5′-ATC AGT ATA CGA TCC AGT GTT CCG TTT CC-3′，下游:5′-ATA TAA GCTTCC CAG GTC GAT GCC GACT-3′;pLXSN多克隆酶切位点两侧引物序列为:上游:5′-ATC CTC CCT TTA TCC AGC CCT CAC-3′，下游:5′-CCT CCA AAG CCT CCT CAC TAC-3′，由上海生工生物工程公司合成。
, http://www.100md.com
1.4 MCF-7/Adr细胞的基因转染 Lipofectin○ R Reagent介导将空载质粒pLXSN及重组质粒pX-AHSP70转染至人乳腺癌MCF-7/Adr细胞(方法按说明书进行)。经G418抗性筛选，挑取单细胞克隆，扩大培养。
1.5 PCR鉴定细胞克隆 各细胞克隆基因组DNA的提取参照文献 [2] 进行，PCR扩增体积为25μl，上下游引物浓度各为0.25μmol/L，循环条件为97℃预变性7min后，94℃变性40s，50℃复性40s，74℃延伸50s，30个循环，最后一次74℃延伸10min。
1.6 Western Bolt检测转染细胞中HSP70表达水平的变化 细胞总蛋白的提取参照文献 [3] 进行，40μg总蛋白行8%SDS-PAGE电泳后，按常规进行Western Blot分析，使用瑞典Pharmacia公司IMAGE MASTER VDS影像系统对特异性蛋白带进行灰度扫描，Image Master Software软件分析蛋白条带的强弱，以积分光密度表示。
, http://www.100md.com
1.7 MTT法检测转染细胞对阿霉素的耐药性 96孔培养板每孔加入100μl含1×10 4 细胞的细胞悬液，每个药物浓度设4复孔，重复3次，每排留一孔细胞不加药作空白对照。阿霉素作用24h、48h、72h不同时间后，换含MTT(0.5mg/ml)的100μl的RPMI1640，37℃孵育4h后弃去培养液，换含150μl的二甲基亚砜振荡显色15min，570nm处测定光吸收值。取复孔平均值，计算出相对存活率[细胞存活率%=(实验组光吸收值-单纯培养基组光吸收值)/对照组细胞光吸收值]，作图求出半致死剂量。
1.8 P53稳定性实验 参照文献 [4] 进行，细胞增殖至对数生长期满80%成时，每瓶换含CHX(80μg/ml)RPMI1640培养液5ml，分别于0～24h抽提细胞总蛋白，70μg总蛋白进行8%的SDS-PAGE电泳，Western Blot分析mtP53稳定性的改变。
1.9 统计学方法 所有数值均以X±s表示，两组之间比较用两个样本均数比较的t检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 转染细胞获得和PCR确证外源DNA存在 转染细胞经G418筛选2周后，获得单细胞克隆，分别命名为MAX和MAp70。提取细胞基因组DNA，PCR检测外源DNA的存在，结果见图1，用载体引物进行PCR扩增，MAX和MAp70可分别得到380bp和480bp的特异DNA条带;用HSP70上游引物与载体上游引物PCR扩增，MAp70细胞可得到400bp的特异DNA条带，而MAX细胞无特异DNA条带出现，表明上述细胞克隆中外源DNA的存在。
2.2 Western blot检测MAp70细胞中HSP70的表达水平 Western Blot结果见图2，积分扫描结果表明MAp70细胞中HSP70蛋白表达较之空载体MAX细胞下降48%(积分光密度值之比:168/325)，说明MAp70细胞中HSP70的表达已受到一定程度的抑制。(图1、图2见附页1)
2.3 MTT法检测MAp70细胞对阿霉素耐药性的改变 MTT法测定转染细胞MAX和MAp70对阿霉素的耐药性的改变见图3，由图3可见，加入阿霉素作用的24～48h内，MAp70细胞与对照MAX细胞相比，同一时间内，MAp70细胞对阿霉素的半致死剂量(IC 50 )显著下降(P<0.01)，说明反义HSP70RNA的存在使得MAp70细胞的耐药性显著降低。但随着阿霉素作用时间延长至72h，两者之间没有差 别。推测短时间和长时间内细胞死亡的途径不同，综合说明反义HSP70RNA对MCF-7/Adr细胞耐药性的影响有着时间剂量效应。
, http://www.100md.com
图3 MTT法检测转染细胞Adr的药敏性改变
2.4 mtP53稳定性的改变 Western bolt结果见图4和图5，在未加CHX的零时，MAp70细胞与MAX细胞相比，mtP53含量下降29.6%(积分光密度值之比101.6/143.6)，当CHX抑制新生的mtP53蛋白合成后，MAp70细胞中mtP53半衰期为12h，而空载体细胞mtP53半衰期为18h，MAp70细胞较之空载体MAX细胞提前了6h。
图4 Western blotting检测转染细胞中mtP53的稳定性(A)mtP53稳定性 (B)蛋白内参照α-tubulin 1:0h;2:6h;3:9h;4:12h;5:18h;6:24h
图5 mtP53稳定性曲线
3 讨论
热休克蛋白在肿瘤组织和细胞中普遍高表达，热休克蛋白70的高表达与MDR的高表达相呼应，Nihei等报道证实，在肿瘤组织和细胞中HSP70家族中HSP70与mtP53形成复合物，导致mtP53在胞质半衰期延长 [5] 。近年研究表明，P53突变与肿瘤耐药性密切相关 [6] ，mtP53过度表达对MDR-1基因可能具有诱导和增加效应，增加了肿瘤细胞耐药性。Yseyuo证实当恶性胶质瘤细胞中存在P53基因突变时，抗癌药化疗敏感性下降 [7] ，Chin等[8] 的研究证实将mtP53及ras基因导入抗药的NIH3T3细胞，发现mtP53及ras基因可明显激活MDR-1基因的促进因子。上述研究提示，HSP70、mtP53和肿瘤化疗抗性之间存在一定的内在联系。因而，我们设计了这一实验，选择了耐阿霉素且为mtP53表型的MCF-7/Adr乳腺癌细胞株为材料，利用反义RNA技术、MTT法和mtP53稳定性实验体外研究了下调HSP70蛋白的表达对乳腺癌细胞耐药性的改变及其机理。从本研究结果表明，HSP70蛋白含量下调，乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性明显下降。但HSP70究竟是直接参与了P-gp蛋白构象的成熟和细胞定位，还是通过影响上调MDR-1表达的反式作用因子，如mtP53等间接参与了肿瘤细胞耐药，尚无文献报道，从本研究的mtP53稳定性实验结果表明，下调HSP70表达，mtP53的不稳定性增强，半衰期缩短。推测反义HSP70通过下调mtP53的稳定性而使MCF-7/Adr乳腺癌细胞的耐药性下降。说明此两种蛋白在抗癌药耐药性产生过程中可能起了协同作用。综上所述，反义HSP70RNA逆转乳腺癌耐药性和增强mtP53不稳定性可能具有以下意义:(1)肿瘤细胞耐药与HSP70密切相关，对MDR-1的表达可能具有协同调节作用。(2)乳腺癌中HSP70高表达、MDR-1高表达和mtP53的存在可以作为乳腺癌化疗敏感性预测的指标。(3)HSP70、mtP53和P-gp三指标联合可作为临床医生选择化疗方案及判断预后的有用 参数。(4)为逆转肿瘤耐药的基因治疗提供了新的途径和实验研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Bertram J，Palfner K，Hiddemann W，et al.Increase of P-glycoprotein-mediated drug resistance by HSP90beta.Anticancer Drugs，1996，7:838-845.
2 Sambvook J，FvitSCh EF，Maniatis T.金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆实验指南.第二版.北京:科学出版社，1996，674-386.
3 Kim SH，Hur WY，Kang CD，et al.Involvement of heat Shock factor in regulating transcriptional activation of MDR-1gene in multidrug-reˉsistant cells.Cancer lett，1997，115:9-14.
, 百拇医药
4 Ogretmen B，Safa AR.Expression of the mutated P53tumor suppressor protein and its molecular and biochemical characterization in multidrug resistant MCF-7/Adr human breast cancer.Oncogene，1997，14:499-506.
5 Nihei T，Sato N，Takahashi S，et al.Demonstration of selective protein complexes of P53with73kDa heat shock cognate protein，but not with72kDa heat shock protein in human tumor cells.Cancer Lett，1993，73:181-189.
6 Dervite，I，Morel P，Fenaux P，et al.P53mutations are associated with resistance to chemotherapy and short survival in hematologic malignanˉcies.Blood，1994，84:3148-3153.
, 百拇医药
7 Ysyuo I，Fujimoto S，Tagawa M，et al.Association of P53gene mutation with decreased chemosensitivity in human malignant gliomas.In J Canˉcer，1996，69:236-241.
8 Chin KV，Ueda K，Pasran L，et al.Modulation of the activity of the proˉmoter of the human MDR-1gene by ras and P53.Science，1992，244:459-462.
基金项目:国家自然科学研究基金资助课题(编号:39770824)
作者单位:100021北京中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所病因与癌变研究室(通讯作者)
(收稿日期:2003-01-02)
(编辑秋 实), 百拇医药(赵玫)
关键词 HSP70 mtP53 反义RNA 乳腺癌 耐药性 稳定性
, http://www.100md.com
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)04-0292-03
Association between stability of mtP53protein and
chemosensitivity in human breast cancer cell line
Zhao Mei，Fan Yunxia，Zhang Xun，et al.
Department of Etiology and Carcinogenesis，Cancer Institute，
Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing100021.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To find out the relationship between HSP70，stabilityof mtP53protein and chemosenˉsitivity in human breast cancer cell line，and toexplore the mechanism of antitumor drug resistance.Methods The antisense HSP70retroviral recombinant plasmid was constructed using DNA recombination technique，and transfected into MCF-7/Adr cells by lipofectin method.After the existence offoreign DNA was confirmed by PCR，the protein level of HSP70was detected using Western Blot.The chemosensitivity of MAp70cell to Adriamycin was detected by MTT assay.The half-life of mutant P53was detected using P53stability assay.Results The transfectant cell strain stably expression antisense HSP70was obtained throughG418selection，The inhibition of protein level of HSP70was42%.Chemosensitivity of MAp70cell to Adr increased obviously.Furthermore，The instability of mutant P53protein increased significantly.Conclusion Antisense HSP70RNA declined the drugresistance of MCF-7/Adr significantˉly，it predicted that HSP70may play an important role in multidrug resistance through increasing the stability of mutant P53protein in tumor cells.
, 百拇医药
Key words heat shock protein70 mtp53 antisense RNA breast neoplasm multidrugresistance stability
HSP(Heat Shock Protein)家族主要成员HSP70在喉癌等许多肿瘤组织和细胞中表达增高，与肿瘤耐药性的产生等密切相关。HSP90β可与P-gp蛋白形成复合物，介导肿瘤细胞的耐药，但HSP70、HSP90等多个热休克蛋白分子形成蛋白折叠体(Foldsome)共同辅助蛋白成熟 [1] 。在多种肿瘤组织或细胞中HSP70家族、HSP90家族成员与mtP53之间形成异源复合物，使mtP53的稳定性增强。探讨HSP70与mtP53和肿瘤耐药之间的关系，寻找新的逆转肿瘤耐药的途径及相应机理，利用反义RNA和基因转移技术，将本室构建的反义HSP70真核表达重组质粒转染至MCF7/Adr耐药型乳腺癌细胞(mtP53)，旨在探讨反义HSP70RNA对乳腺癌细胞耐药性的影响及其机理。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 基因、载体、菌株、细胞株 反义HSP70重组质粒pXA HSP70，空载体pLXSN-neo，DH5。菌株均由本室保存，MCF-7/Adr乳腺癌细胞株(耐阿霉素，mtP53)，由本所药理室惠赠。
1.2 主要试剂 Lipofectin○ R Reagent、PRMI1640、G418、购自GIBCO公司。限制性内切酶等常用试剂购自华美生物公司。小鼠抗人P53抗体(DO-1)，羊抗人HSP70多克隆抗体(J-20)购自Santa Cruz公司。鼠抗人α-Tubulin单克隆抗体(DM1A)购自Neo Markers公司。HRP偶联兔抗羊IgG(H+L)和羊抗鼠IgG(H+L)抗体均购自Jackson公司。蛋白合成抑制剂(clyclohexmide，CHX)，低分子量标准蛋白质(94kDa-14kDa)购自Sigma公司。
1.3 引物 HSP70DNA引物序列为:上游:5′-ATC AGT ATA CGA TCC AGT GTT CCG TTT CC-3′，下游:5′-ATA TAA GCTTCC CAG GTC GAT GCC GACT-3′;pLXSN多克隆酶切位点两侧引物序列为:上游:5′-ATC CTC CCT TTA TCC AGC CCT CAC-3′，下游:5′-CCT CCA AAG CCT CCT CAC TAC-3′，由上海生工生物工程公司合成。
, http://www.100md.com
1.4 MCF-7/Adr细胞的基因转染 Lipofectin○ R Reagent介导将空载质粒pLXSN及重组质粒pX-AHSP70转染至人乳腺癌MCF-7/Adr细胞(方法按说明书进行)。经G418抗性筛选，挑取单细胞克隆，扩大培养。
1.5 PCR鉴定细胞克隆 各细胞克隆基因组DNA的提取参照文献 [2] 进行，PCR扩增体积为25μl，上下游引物浓度各为0.25μmol/L，循环条件为97℃预变性7min后，94℃变性40s，50℃复性40s，74℃延伸50s，30个循环，最后一次74℃延伸10min。
1.6 Western Bolt检测转染细胞中HSP70表达水平的变化 细胞总蛋白的提取参照文献 [3] 进行，40μg总蛋白行8%SDS-PAGE电泳后，按常规进行Western Blot分析，使用瑞典Pharmacia公司IMAGE MASTER VDS影像系统对特异性蛋白带进行灰度扫描，Image Master Software软件分析蛋白条带的强弱，以积分光密度表示。
, http://www.100md.com
1.7 MTT法检测转染细胞对阿霉素的耐药性 96孔培养板每孔加入100μl含1×10 4 细胞的细胞悬液，每个药物浓度设4复孔，重复3次，每排留一孔细胞不加药作空白对照。阿霉素作用24h、48h、72h不同时间后，换含MTT(0.5mg/ml)的100μl的RPMI1640，37℃孵育4h后弃去培养液，换含150μl的二甲基亚砜振荡显色15min，570nm处测定光吸收值。取复孔平均值，计算出相对存活率[细胞存活率%=(实验组光吸收值-单纯培养基组光吸收值)/对照组细胞光吸收值]，作图求出半致死剂量。
1.8 P53稳定性实验 参照文献 [4] 进行，细胞增殖至对数生长期满80%成时，每瓶换含CHX(80μg/ml)RPMI1640培养液5ml，分别于0～24h抽提细胞总蛋白，70μg总蛋白进行8%的SDS-PAGE电泳，Western Blot分析mtP53稳定性的改变。
1.9 统计学方法 所有数值均以X±s表示，两组之间比较用两个样本均数比较的t检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 转染细胞获得和PCR确证外源DNA存在 转染细胞经G418筛选2周后，获得单细胞克隆，分别命名为MAX和MAp70。提取细胞基因组DNA，PCR检测外源DNA的存在，结果见图1，用载体引物进行PCR扩增，MAX和MAp70可分别得到380bp和480bp的特异DNA条带;用HSP70上游引物与载体上游引物PCR扩增，MAp70细胞可得到400bp的特异DNA条带，而MAX细胞无特异DNA条带出现，表明上述细胞克隆中外源DNA的存在。
2.2 Western blot检测MAp70细胞中HSP70的表达水平 Western Blot结果见图2，积分扫描结果表明MAp70细胞中HSP70蛋白表达较之空载体MAX细胞下降48%(积分光密度值之比:168/325)，说明MAp70细胞中HSP70的表达已受到一定程度的抑制。(图1、图2见附页1)
2.3 MTT法检测MAp70细胞对阿霉素耐药性的改变 MTT法测定转染细胞MAX和MAp70对阿霉素的耐药性的改变见图3，由图3可见，加入阿霉素作用的24～48h内，MAp70细胞与对照MAX细胞相比，同一时间内，MAp70细胞对阿霉素的半致死剂量(IC 50 )显著下降(P<0.01)，说明反义HSP70RNA的存在使得MAp70细胞的耐药性显著降低。但随着阿霉素作用时间延长至72h，两者之间没有差 别。推测短时间和长时间内细胞死亡的途径不同，综合说明反义HSP70RNA对MCF-7/Adr细胞耐药性的影响有着时间剂量效应。
, http://www.100md.com
图3 MTT法检测转染细胞Adr的药敏性改变
2.4 mtP53稳定性的改变 Western bolt结果见图4和图5，在未加CHX的零时，MAp70细胞与MAX细胞相比，mtP53含量下降29.6%(积分光密度值之比101.6/143.6)，当CHX抑制新生的mtP53蛋白合成后，MAp70细胞中mtP53半衰期为12h，而空载体细胞mtP53半衰期为18h，MAp70细胞较之空载体MAX细胞提前了6h。
图4 Western blotting检测转染细胞中mtP53的稳定性(A)mtP53稳定性 (B)蛋白内参照α-tubulin 1:0h;2:6h;3:9h;4:12h;5:18h;6:24h
图5 mtP53稳定性曲线
3 讨论
热休克蛋白在肿瘤组织和细胞中普遍高表达，热休克蛋白70的高表达与MDR的高表达相呼应，Nihei等报道证实，在肿瘤组织和细胞中HSP70家族中HSP70与mtP53形成复合物，导致mtP53在胞质半衰期延长 [5] 。近年研究表明，P53突变与肿瘤耐药性密切相关 [6] ，mtP53过度表达对MDR-1基因可能具有诱导和增加效应，增加了肿瘤细胞耐药性。Yseyuo证实当恶性胶质瘤细胞中存在P53基因突变时，抗癌药化疗敏感性下降 [7] ，Chin等[8] 的研究证实将mtP53及ras基因导入抗药的NIH3T3细胞，发现mtP53及ras基因可明显激活MDR-1基因的促进因子。上述研究提示，HSP70、mtP53和肿瘤化疗抗性之间存在一定的内在联系。因而，我们设计了这一实验，选择了耐阿霉素且为mtP53表型的MCF-7/Adr乳腺癌细胞株为材料，利用反义RNA技术、MTT法和mtP53稳定性实验体外研究了下调HSP70蛋白的表达对乳腺癌细胞耐药性的改变及其机理。从本研究结果表明，HSP70蛋白含量下调，乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性明显下降。但HSP70究竟是直接参与了P-gp蛋白构象的成熟和细胞定位，还是通过影响上调MDR-1表达的反式作用因子，如mtP53等间接参与了肿瘤细胞耐药，尚无文献报道，从本研究的mtP53稳定性实验结果表明，下调HSP70表达，mtP53的不稳定性增强，半衰期缩短。推测反义HSP70通过下调mtP53的稳定性而使MCF-7/Adr乳腺癌细胞的耐药性下降。说明此两种蛋白在抗癌药耐药性产生过程中可能起了协同作用。综上所述，反义HSP70RNA逆转乳腺癌耐药性和增强mtP53不稳定性可能具有以下意义:(1)肿瘤细胞耐药与HSP70密切相关，对MDR-1的表达可能具有协同调节作用。(2)乳腺癌中HSP70高表达、MDR-1高表达和mtP53的存在可以作为乳腺癌化疗敏感性预测的指标。(3)HSP70、mtP53和P-gp三指标联合可作为临床医生选择化疗方案及判断预后的有用 参数。(4)为逆转肿瘤耐药的基因治疗提供了新的途径和实验研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Bertram J，Palfner K，Hiddemann W，et al.Increase of P-glycoprotein-mediated drug resistance by HSP90beta.Anticancer Drugs，1996，7:838-845.
2 Sambvook J，FvitSCh EF，Maniatis T.金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆实验指南.第二版.北京:科学出版社，1996，674-386.
3 Kim SH，Hur WY，Kang CD，et al.Involvement of heat Shock factor in regulating transcriptional activation of MDR-1gene in multidrug-reˉsistant cells.Cancer lett，1997，115:9-14.
, 百拇医药
4 Ogretmen B，Safa AR.Expression of the mutated P53tumor suppressor protein and its molecular and biochemical characterization in multidrug resistant MCF-7/Adr human breast cancer.Oncogene，1997，14:499-506.
5 Nihei T，Sato N，Takahashi S，et al.Demonstration of selective protein complexes of P53with73kDa heat shock cognate protein，but not with72kDa heat shock protein in human tumor cells.Cancer Lett，1993，73:181-189.
6 Dervite，I，Morel P，Fenaux P，et al.P53mutations are associated with resistance to chemotherapy and short survival in hematologic malignanˉcies.Blood，1994，84:3148-3153.
, 百拇医药
7 Ysyuo I，Fujimoto S，Tagawa M，et al.Association of P53gene mutation with decreased chemosensitivity in human malignant gliomas.In J Canˉcer，1996，69:236-241.
8 Chin KV，Ueda K，Pasran L，et al.Modulation of the activity of the proˉmoter of the human MDR-1gene by ras and P53.Science，1992，244:459-462.
基金项目:国家自然科学研究基金资助课题(编号:39770824)
作者单位:100021北京中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所病因与癌变研究室(通讯作者)
(收稿日期:2003-01-02)
(编辑秋 实), 百拇医药(赵玫)