胆管癌端粒酶活性研究
【摘要】 目的 探讨胆管癌组织中端粒酶活性表达及其临床病理学意义。方法 采用以PCR为基础的TRAP-ELISA法检测了30例胆管癌及23例癌旁组织端粒酶活性，另取8例正常胆管壁组织作为对照。结果 30例胆管癌组织中，有22例端粒酶表达阳性，阳性率73.3%。23例癌旁组织中，有3例端粒酶表达阳性，阳性率13.0%，8例对照组中端粒酶表达均阴性，它们的端粒酶活性值分别为0.51，0.15和0.08(P<0.001)。此外，淋巴结转移组端粒酶活性值0.67±0.35，高于非转移组0.42±0.26，P<0.05;Ⅲ、Ⅳ期肿瘤的端粒酶活性值0.66±0.33，明显高于Ⅰ、Ⅱ期肿瘤0.37±0.24，P<0.01。低分化组的端粒酶活性值0.68±0.33，高于中、高分化组0.46±0.30，但无统计学差异(P>0.05)。肿瘤所处部位不同有不同的端粒酶活性表达(上段、中段、下段分别为0.49、0.65和0.42)，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 端粒酶的活化在胆管癌的发生发展中起重要作用，胆管癌的端粒酶活性检测可作为其诊断的有力辅助手段。
, 百拇医药
关键词 端粒酶 胆管癌 聚合酶链反应 酶联免疫吸附测定
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)07-0595-03
Telomerase acitivity in bile duct carcinoma
Bian Yongsheng，Liu Jinzhong，Hao Jianjun，et al.
The First Hospital of Baoding City Baoding071000
【Abstract】 Objective To investigate the telomerase activity and significance of clinicopathology in bile duct carcinoma.Methods The telomerase acitivity of30cases of bile duct carcinoma and23cases of adjacent tissues were detected using telomeric repeat amplificantion protocal enzyme linked immunosorbent assay based on PCR(TRAP～ELISA assay).Simultaneously，8normal bile duct tissues were used as controls.Results Twenty-two of30bile duct carcinoma and three of23adjacent tissue specimens were postive for telomerase activity with a postive rate of73.3%and13.0%，all of8controls was negative.The mean value of telomerase activity was0.51，0.15，and0.08，respecˉtively(P<0.001).The telomerase activity value in the cases with lymph node metastases(0.67±0.35)was higher than that without0.42±0.26(P<0.05).A statistically significant difference was found in telomerase activity value in carcinomas stageⅢandⅣ(0.66±0.33)compared with stageⅠandⅡ(0.37±0.24)(P<0.01).The valus of telomerase activity in poor differentiation carcinoma(0.68±0.33)was higher than that in moderate and high grading carcinoma(0.46±0.30)，however the difference was not statistical significance(P>0.05).Although，according to different location of tumors，the telomerase activity value was difference(the upper segment of bile duct was:0.49，middle:0.65，low:0.42，respectively)，yet there was no statistical significance(P>0.05).Conclusion Telomerase activity plays an important role in bile duct carcinoma progression.The detection of a telomerase activity may serve as a powerful additional tool for the diagnosis of bile duct carcinomas.
, 百拇医药
Key words telomerase bile duct carcinoma polymerase chain reaction enzyme-linked immunosorbent asˉsay
近年来的大量研究发现，大多数恶性肿瘤的细胞中存在着端粒酶的活性，而良性肿瘤和正常组织呈低表达和无活性。胆管癌是严重威胁人类健康的一种恶性疾病，发病率有逐年增加的趋势，且早期诊断困难。有关端粒酶活性在胆管癌中的表达尚未见报道。我们采用以PCR为基础的TRAP-ELISA法对胆管癌组织及癌旁组织进行端粒酶活性定量检测，从而探讨其作为诊断指标的可行性及其临床病理学意义。
1 资料与方法
1.1 器械、仪器及试剂
1.1.1 器械 取材用刀、剪以3%戊二醛浸泡0.5h，无菌蒸馏水冲洗，1‰DEPC水浸泡12h，所用镊、钳及研钵200℃烘烤8h，37℃温箱过夜。检测用Eppendorf管及移液器吸头高温高压消毒并DEPC水处理后，37℃温箱过夜。
, 百拇医药
1.1.2 仪器 扩增用的PCR热循环仪为美国PE公司产品，型号480。酶标仪为芬兰产，Anthos Labtec2010型。
1.1.3 试剂 端粒酶检测采用Telomerase PCR-ELISA试剂盒(购自Roche-Boehringer Mannheim公司)。阳性对照为试剂盒提供的293癌细胞株，阴性对照为加热85℃10min的癌细胞株或不加任何提取物的细胞裂解液。
1.2 取材 共30例胆管癌组织(其中23例为切除标本，7例为术中活检标本)和23例癌旁组织(距肿瘤1cm)及8例正常胆管壁组织。其中男17例，女13例。年龄44～74岁，平均年龄57.47岁。上段胆管癌15例，中段8例，下段7例。手术切除组织离体后，立即取材，剪取0.5cm 3 组织及癌旁组织，盐水纱布清除血污，装入预处理的Eppendorf管内并投入冰壶，在0.5h内转至-80℃冰箱备用端粒酶检测。另一部分4%甲醛固定，用于常规病理检查。所有病例均经病理证实。临床分期采用国际抗癌协会UICC标准。
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1.3 方法
1.3.1 端粒酶的提取 取100mg左右标本，在冰浴下剪碎，在研钵中加少许液氮迅速研磨成粉末状，加200μl裂解液研磨成匀浆，再转移至Eppendorf管中，继续在冰上孵育30min，然后15000×g，4℃离心20min，取上清液备用，同时双缩脲法测定蛋白含量。
1.3.2 PCR扩增 取上清液2～5μl(蛋白含量50μg)，加PCR循环混合液25μl(含引物、dNTP和Taq酶等，其中引物为biotin标记)，用DEPC水补至终体积50μl，混匀，加50μl灭菌液体石蜡，低速短时离心，然后在PCR扩增仪上进行引物的延伸及扩增反应:循环1:25℃，30min;循环2:94℃，5min;循环3-32:94℃，30s，50℃，30s，72℃，90s;循环33:72℃，10min。
1.3.3 杂交和ELISA 取PCR循环产物5μl，加入变性液20μl，室温放置10min，加杂交液225μl混匀(杂交探针已DIG 标记)。取杂交后混合液100μl，加入MTP板内(已包被biotin抗体)，用自粘箔纸覆盖，37℃、300rpm振摇2h，倒去杂交混合液，然后洗板3次，加入抗DIG-POD抗体，室温、300rpm振摇30min，倒去反应液，洗板5次，加入四甲基联苯胺100μl进行显色反应，并在室温下300rpm振摇15min，加入终止液100μl终止显色，在30min内用酶标仪读取吸光度A值(450nm为检测波长，690nm为参考波长)。
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1.4 结果判定 每组实验均设阳性对照和阴性对照，阴性对照A应<0.25，阳性对照A值应>1.5，标本A值减去阴性对照A值>0.2视为阳性，△A视为定量分析时端粒酶的活性水平。
1.5 统计学方法 资料采用t检验和多重比较的q检验及LSD法。
2 结果
本实验共检测了胆管癌标本30例，癌旁组织23例及8例正常胆管壁组织。经检测瘤体端粒酶阳性者22例，阳性率73.3%，0.2<△A<0.5之间者9例，0.5<△A<1.0者10例，△A>1.0者3例。癌旁组织端粒酶阳性者3例，阳性率13%，而正常对照组全部为阴性，见表1。
表1 癌组织、癌旁组织和正常对照端粒酶活性比较略
端粒酶活性与胆管癌的临床病理因素关系见表2。端粒酶活性在淋巴结转移组的表达高于非转移组，在肿瘤临床分期上，Ⅲ、Ⅳ期肿瘤的端粒酶活性值明显高于Ⅰ、Ⅱ期 肿瘤。在肿瘤分化程度上，虽然低分化组端粒酶活性高于中、高分化组，但差异无统计学意义，端粒酶活性在胆管癌的所在部位表达略有不同，其差异无统计学意义。
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表2 胆管癌端粒酶活性与临床病理因素关系的比较略
3 讨论
近几年来研究发现，人类绝大多数正常体细胞无端粒酶活性，而大多数肿瘤细胞却表达端粒酶活性(69%～95%)，在癌旁组织中呈低表达(2%～33%)。因此认为端 粒酶的激活是恶性肿瘤发生学上的一个共同途径，而端粒酶则是各种肿瘤细胞的一个共同标志物。本实验中胆管癌组织端粒酶的阳性率为73.3%，而癌旁组织为13.0%，正常组织全部为阴性，其端粒酶活性水平均值差异明显，统计学有显著意义(P<0.001)。我们的检测结果与Niiyama H [1] 报道的活检胆管癌标本的端粒酶阳性率相近(75%)。3例癌旁组织端粒酶值呈低弱表达，结合病理学检查分析:其中1例胆管切缘组织检出癌细胞，说明局部已有癌浸润。1例胆管残端为增生性胆管炎，呈重度异型性增生，实际为癌前病变。有报道关于癌前病变其端粒酶可呈低弱的表达[2] 。另1例端粒酶阳性的原因可能是:(1)残缘组织伴炎症，有一定程度的炎性淋巴细胞浸润，因为淋巴细胞可呈弱的端粒酶活性表达 [3] 。(2)切缘组织可能含有微转移灶或位于所谓“癌化区”范围，处于亚临床癌变阶段，因而在组织学上尚无异常表现。无论如何，胆管癌有明显的沿胆管壁浸润及周围组织侵犯的倾向，这说明分子生物学检查比细胞学检查更具有预测性。足以提示我们将对此3例病人加强术后跟踪随访，其预后有待进一步证实。
, 百拇医药
端粒酶活性与肿瘤临床病理因素的关系尚无明确结论 [4，5] ，许多研究结果均不一致。本文检测结果:胆管癌的癌肿所在部位上段、中段及下段的端粒酶活性表达值不同，其差异无统计学意义。在肿瘤分化程度上，虽然低分化组的端粒酶活性值高于中、高分化组，但无统计学意义，我们认为端粒酶的激活可能是肿瘤发生的早期事件。淋巴结转移组的端粒酶活性水平高于非转移组，有统计学意义，这提示胆管癌术后可能复发及预后不良，我们有必要对这组病人加强随访，观察其预后情况。在病理分期上，晚期癌的表达值明显高于早期癌，有显著差异，提示端粒酶表达水平的 高低与肿瘤细胞侵袭，肿瘤进展和转移潜能相关，反映恶性肿瘤的发展程度。关于肿瘤的临床病理因素与端粒酶活性表达的结果多不一致，可能是采用的定性实验和定量实验方法不同所致，这方面尚需进一步深入研究。
总之，我们的初步研究结果显示在大部分胆管癌中均能检测到端粒酶的活性，而在癌旁组织其活性呈弱表达，正常组织则不表达。胆管癌的端粒酶活性与肿瘤的淋巴结转移、病理分期有关，这提示端粒酶的活性检测有助于胆管癌的临床诊断，其有可能成为估测预后的指标之一。
, 百拇医药
参考文献
1 Niiyama H，Mizumoto K，KusumotoM，et al.Activition of telomerase and its diagnostic application in biopsy specimens from biliary tract neoˉplasms.Cancer，1999，85:2138-2143.
2 Yashima K，Litzky LA，Kaiser L，et al.Telomerase expression in respiraˉtory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinoma.Cancer Res，1997，350:2373-2379.
3 Counter CM，Gupta J，Harley CB，et al.Telomerase activity in normal leukocyte and in hematologic malignancies.Blood，1995，85:2315-2320.
, http://www.100md.com
4 Cheng PY，Yuen PW，Nicholls JM，et al.Telomerase activation in naˉsopharyngeal carcinoma.Br J Cancer，1998，77:456-460.
5 Ahn MJ，Noh YH，Lee YS，et al.Telomerase activity and its clinicoˉpathological significance in gastric cancer.Eur J Cancer，1997，33:1309-313.
作者单位:1 071000河北省保定市第一医院
2 河北医科大学分子生物学实验室
(收稿日期:2003-03-01)
(编辑 何蓓), 百拇医药(卞永生 刘进忠 郝建军 宋惠茹 王宏力 杜行严)
, 百拇医药
关键词 端粒酶 胆管癌 聚合酶链反应 酶联免疫吸附测定
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)07-0595-03
Telomerase acitivity in bile duct carcinoma
Bian Yongsheng，Liu Jinzhong，Hao Jianjun，et al.
The First Hospital of Baoding City Baoding071000
【Abstract】 Objective To investigate the telomerase activity and significance of clinicopathology in bile duct carcinoma.Methods The telomerase acitivity of30cases of bile duct carcinoma and23cases of adjacent tissues were detected using telomeric repeat amplificantion protocal enzyme linked immunosorbent assay based on PCR(TRAP～ELISA assay).Simultaneously，8normal bile duct tissues were used as controls.Results Twenty-two of30bile duct carcinoma and three of23adjacent tissue specimens were postive for telomerase activity with a postive rate of73.3%and13.0%，all of8controls was negative.The mean value of telomerase activity was0.51，0.15，and0.08，respecˉtively(P<0.001).The telomerase activity value in the cases with lymph node metastases(0.67±0.35)was higher than that without0.42±0.26(P<0.05).A statistically significant difference was found in telomerase activity value in carcinomas stageⅢandⅣ(0.66±0.33)compared with stageⅠandⅡ(0.37±0.24)(P<0.01).The valus of telomerase activity in poor differentiation carcinoma(0.68±0.33)was higher than that in moderate and high grading carcinoma(0.46±0.30)，however the difference was not statistical significance(P>0.05).Although，according to different location of tumors，the telomerase activity value was difference(the upper segment of bile duct was:0.49，middle:0.65，low:0.42，respectively)，yet there was no statistical significance(P>0.05).Conclusion Telomerase activity plays an important role in bile duct carcinoma progression.The detection of a telomerase activity may serve as a powerful additional tool for the diagnosis of bile duct carcinomas.
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Key words telomerase bile duct carcinoma polymerase chain reaction enzyme-linked immunosorbent asˉsay
近年来的大量研究发现，大多数恶性肿瘤的细胞中存在着端粒酶的活性，而良性肿瘤和正常组织呈低表达和无活性。胆管癌是严重威胁人类健康的一种恶性疾病，发病率有逐年增加的趋势，且早期诊断困难。有关端粒酶活性在胆管癌中的表达尚未见报道。我们采用以PCR为基础的TRAP-ELISA法对胆管癌组织及癌旁组织进行端粒酶活性定量检测，从而探讨其作为诊断指标的可行性及其临床病理学意义。
1 资料与方法
1.1 器械、仪器及试剂
1.1.1 器械 取材用刀、剪以3%戊二醛浸泡0.5h，无菌蒸馏水冲洗，1‰DEPC水浸泡12h，所用镊、钳及研钵200℃烘烤8h，37℃温箱过夜。检测用Eppendorf管及移液器吸头高温高压消毒并DEPC水处理后，37℃温箱过夜。
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1.1.2 仪器 扩增用的PCR热循环仪为美国PE公司产品，型号480。酶标仪为芬兰产，Anthos Labtec2010型。
1.1.3 试剂 端粒酶检测采用Telomerase PCR-ELISA试剂盒(购自Roche-Boehringer Mannheim公司)。阳性对照为试剂盒提供的293癌细胞株，阴性对照为加热85℃10min的癌细胞株或不加任何提取物的细胞裂解液。
1.2 取材 共30例胆管癌组织(其中23例为切除标本，7例为术中活检标本)和23例癌旁组织(距肿瘤1cm)及8例正常胆管壁组织。其中男17例，女13例。年龄44～74岁，平均年龄57.47岁。上段胆管癌15例，中段8例，下段7例。手术切除组织离体后，立即取材，剪取0.5cm 3 组织及癌旁组织，盐水纱布清除血污，装入预处理的Eppendorf管内并投入冰壶，在0.5h内转至-80℃冰箱备用端粒酶检测。另一部分4%甲醛固定，用于常规病理检查。所有病例均经病理证实。临床分期采用国际抗癌协会UICC标准。
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1.3 方法
1.3.1 端粒酶的提取 取100mg左右标本，在冰浴下剪碎，在研钵中加少许液氮迅速研磨成粉末状，加200μl裂解液研磨成匀浆，再转移至Eppendorf管中，继续在冰上孵育30min，然后15000×g，4℃离心20min，取上清液备用，同时双缩脲法测定蛋白含量。
1.3.2 PCR扩增 取上清液2～5μl(蛋白含量50μg)，加PCR循环混合液25μl(含引物、dNTP和Taq酶等，其中引物为biotin标记)，用DEPC水补至终体积50μl，混匀，加50μl灭菌液体石蜡，低速短时离心，然后在PCR扩增仪上进行引物的延伸及扩增反应:循环1:25℃，30min;循环2:94℃，5min;循环3-32:94℃，30s，50℃，30s，72℃，90s;循环33:72℃，10min。
1.3.3 杂交和ELISA 取PCR循环产物5μl，加入变性液20μl，室温放置10min，加杂交液225μl混匀(杂交探针已DIG 标记)。取杂交后混合液100μl，加入MTP板内(已包被biotin抗体)，用自粘箔纸覆盖，37℃、300rpm振摇2h，倒去杂交混合液，然后洗板3次，加入抗DIG-POD抗体，室温、300rpm振摇30min，倒去反应液，洗板5次，加入四甲基联苯胺100μl进行显色反应，并在室温下300rpm振摇15min，加入终止液100μl终止显色，在30min内用酶标仪读取吸光度A值(450nm为检测波长，690nm为参考波长)。
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1.4 结果判定 每组实验均设阳性对照和阴性对照，阴性对照A应<0.25，阳性对照A值应>1.5，标本A值减去阴性对照A值>0.2视为阳性，△A视为定量分析时端粒酶的活性水平。
1.5 统计学方法 资料采用t检验和多重比较的q检验及LSD法。
2 结果
本实验共检测了胆管癌标本30例，癌旁组织23例及8例正常胆管壁组织。经检测瘤体端粒酶阳性者22例，阳性率73.3%，0.2<△A<0.5之间者9例，0.5<△A<1.0者10例，△A>1.0者3例。癌旁组织端粒酶阳性者3例，阳性率13%，而正常对照组全部为阴性，见表1。
表1 癌组织、癌旁组织和正常对照端粒酶活性比较略
端粒酶活性与胆管癌的临床病理因素关系见表2。端粒酶活性在淋巴结转移组的表达高于非转移组，在肿瘤临床分期上，Ⅲ、Ⅳ期肿瘤的端粒酶活性值明显高于Ⅰ、Ⅱ期 肿瘤。在肿瘤分化程度上，虽然低分化组端粒酶活性高于中、高分化组，但差异无统计学意义，端粒酶活性在胆管癌的所在部位表达略有不同，其差异无统计学意义。
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表2 胆管癌端粒酶活性与临床病理因素关系的比较略
3 讨论
近几年来研究发现，人类绝大多数正常体细胞无端粒酶活性，而大多数肿瘤细胞却表达端粒酶活性(69%～95%)，在癌旁组织中呈低表达(2%～33%)。因此认为端 粒酶的激活是恶性肿瘤发生学上的一个共同途径，而端粒酶则是各种肿瘤细胞的一个共同标志物。本实验中胆管癌组织端粒酶的阳性率为73.3%，而癌旁组织为13.0%，正常组织全部为阴性，其端粒酶活性水平均值差异明显，统计学有显著意义(P<0.001)。我们的检测结果与Niiyama H [1] 报道的活检胆管癌标本的端粒酶阳性率相近(75%)。3例癌旁组织端粒酶值呈低弱表达，结合病理学检查分析:其中1例胆管切缘组织检出癌细胞，说明局部已有癌浸润。1例胆管残端为增生性胆管炎，呈重度异型性增生，实际为癌前病变。有报道关于癌前病变其端粒酶可呈低弱的表达[2] 。另1例端粒酶阳性的原因可能是:(1)残缘组织伴炎症，有一定程度的炎性淋巴细胞浸润，因为淋巴细胞可呈弱的端粒酶活性表达 [3] 。(2)切缘组织可能含有微转移灶或位于所谓“癌化区”范围，处于亚临床癌变阶段，因而在组织学上尚无异常表现。无论如何，胆管癌有明显的沿胆管壁浸润及周围组织侵犯的倾向，这说明分子生物学检查比细胞学检查更具有预测性。足以提示我们将对此3例病人加强术后跟踪随访，其预后有待进一步证实。
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端粒酶活性与肿瘤临床病理因素的关系尚无明确结论 [4，5] ，许多研究结果均不一致。本文检测结果:胆管癌的癌肿所在部位上段、中段及下段的端粒酶活性表达值不同，其差异无统计学意义。在肿瘤分化程度上，虽然低分化组的端粒酶活性值高于中、高分化组，但无统计学意义，我们认为端粒酶的激活可能是肿瘤发生的早期事件。淋巴结转移组的端粒酶活性水平高于非转移组，有统计学意义，这提示胆管癌术后可能复发及预后不良，我们有必要对这组病人加强随访，观察其预后情况。在病理分期上，晚期癌的表达值明显高于早期癌，有显著差异，提示端粒酶表达水平的 高低与肿瘤细胞侵袭，肿瘤进展和转移潜能相关，反映恶性肿瘤的发展程度。关于肿瘤的临床病理因素与端粒酶活性表达的结果多不一致，可能是采用的定性实验和定量实验方法不同所致，这方面尚需进一步深入研究。
总之，我们的初步研究结果显示在大部分胆管癌中均能检测到端粒酶的活性，而在癌旁组织其活性呈弱表达，正常组织则不表达。胆管癌的端粒酶活性与肿瘤的淋巴结转移、病理分期有关，这提示端粒酶的活性检测有助于胆管癌的临床诊断，其有可能成为估测预后的指标之一。
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参考文献
1 Niiyama H，Mizumoto K，KusumotoM，et al.Activition of telomerase and its diagnostic application in biopsy specimens from biliary tract neoˉplasms.Cancer，1999，85:2138-2143.
2 Yashima K，Litzky LA，Kaiser L，et al.Telomerase expression in respiraˉtory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinoma.Cancer Res，1997，350:2373-2379.
3 Counter CM，Gupta J，Harley CB，et al.Telomerase activity in normal leukocyte and in hematologic malignancies.Blood，1995，85:2315-2320.
, http://www.100md.com
4 Cheng PY，Yuen PW，Nicholls JM，et al.Telomerase activation in naˉsopharyngeal carcinoma.Br J Cancer，1998，77:456-460.
5 Ahn MJ，Noh YH，Lee YS，et al.Telomerase activity and its clinicoˉpathological significance in gastric cancer.Eur J Cancer，1997，33:1309-313.
作者单位:1 071000河北省保定市第一医院
2 河北医科大学分子生物学实验室
(收稿日期:2003-03-01)
(编辑 何蓓), 百拇医药(卞永生 刘进忠 郝建军 宋惠茹 王宏力 杜行严)