卡介菌多糖核酸、胸腺肽影响正常和免疫抑制小鼠T淋巴细胞亚群的对比研究
【摘要】 目的 对比研究卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常和免疫抑制小鼠T淋巴细胞亚群影响作用的差异。方法 以流式细胞分析术连续检测了小鼠胸腺、脾脏、外周血单个核细胞CD +4 T、CD 8+ T细胞亚群在使用卡介菌多糖核酸或胸腺肽后的变化情况并计算CD +4 /CD +8 比值。结果 卡介菌多糖核酸和胸腺肽均可降低胸腺中CD +4 CD +8 T细胞亚群比例而同时提高小鼠三种组织中CD +4 T、CD +8 T比例，但胸腺肽导致的波动幅度稍大于BCG-PSN组。结论 胸腺肽的作用部位在胸腺，其促进性刺激作用较强;而卡介菌多糖核酸不仅能加速胸腺组织的分化成熟，还对外周CD +4 T亚群有一定的直接刺激作用，同时始终保持CD +4 /CD +8 比值于正常范围，因此卡介菌多糖核酸具有更好的安全性。
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关键词 卡介菌多糖核酸 胸
腺肽 T淋巴细胞 CD +4 CD +8 T CD +4 T CD +8 T
文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)01-0001-06
A comparing study on the effects of polysaccharide
nucleic acid of BCG and thymus peptide on T-lymphocyte subgroup
of normal and immunity inhibited mice
Deng Yunhua，Chen Yingling，Chen Xingping，et al.
, 百拇医药
Dept.of Dermatology of Tueng-Ji Hospital Affiliated to Tueng-Ji
Medical college of central china Science and Technology University，Wuhan430030.
【Abstract】 Objective To compare the effects of polysaccharide-nueleic acidof BCG and thymus peptide on normal and immunity inhibited T-lymphocyte subgroup of mice.Method CD +4 and CD +8 T-cyte subgroup of single nucleic cell in thymus，spleen and peripheral blood were detected with flow cytometry successively after application of polysaccharide nucleie acid of BCG and thymus peptide，and CD+4 /CD +8 ratio was also calculated.Result Polysacˉcharide-nucleic acid of BCGand thymus peptide both can decrease CD +4 and CD +8 T-cyte subgroup proportionin three tissues，at the same time increase CD +4 ，CD +8 T proportion.While thymus peptide induced fluctuation amplitude is rather larger than that of BCG-PSNgroup.Conclusion The acting location of thymus peptide is in thymus，its promoting stimulation is stronger，while polysaccharide-nucleic acid of BCG not only accelerates the differentiation mature，but also has some direct stimulation to peripheral CD +4 subgroup，meanwhile persistently maintains CD +4 /CD +8 ratio innormal range.So，polysaccharide-nucleic acid of BCG possesses more safety.
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Key words polysaccharide-nucleic acid thymus peptide T-lymphocyte CD +4 CD +8 T CD +4 T CD +8 T
卡介菌多糖核酸(斯奇康注射液)和胸腺肽是目前临床上常用的两种免疫调节剂，多应用于病毒感染性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤等的辅助治疗，临床观察均有一定的疗效。有研究表明 [1，2] 它们都具有促进T细胞增殖分化的作用，但具体机制至今仍不十分清楚。为比较二者对机体T淋巴细胞亚群的调节机制的差异，本实验采用流式细胞分析术连续观测了卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常和免疫抑制小鼠的胸腺、脾脏、外周血T淋巴细胞CD +4 T、CD +8 T亚群的影响并进行了对比分析。现将结果予以报告，以供参考。
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1 材料与方法
1.1 材料 卡介菌多糖核酸注射液(湖南斯奇康医药有限公司生产，0.5mg/ml·支;胸腺肽注射液(武汉梅山生物化学制药厂生产，4mg/ml·支;注射用环磷酰胺粉剂(江苏恒瑞医药股份有限公司生产，200mg/瓶);FITC-CD +4 单抗、 PE-CD +8a 单抗(美国PharMigen公司生产);Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产)。实验动物为健康昆明种小白鼠，4～5周龄，体重20±3g，同济医学院实验动物中心提供;流式细胞仪FACSort(美国Becton Dikinson公司生产)。
1.2 方法
1.2.1 分组与处理
1.2.1.1 免疫正常小鼠实验组 将健康昆明种小白鼠90 只，雌雄各半，随机分为卡介菌多糖核酸组(BCG-PSN组)、胸腺肽组(Th组)、正常对照组(NS组)。BCG-PSN组每次给以卡介菌多糖核酸注射液6.25mg/kg，Th组给以胸腺肽注射液50mg/kg，NS组给以生理盐水。用生理盐水调整各组药物浓度后均按0.5ml/只腹腔注射，隔日1次，连续用药，分别于第14、21、28、35、42天各组随机取雌雄小鼠各3只，经眼底动脉收集外周血并脱椎处死小鼠摘取其胸腺和脾脏。
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1.2.1.2 免疫抑制模型小鼠实验组 将60只健康雌性小鼠随机分为四组:正常对照组(NS组)、环磷酰胺组(Cy组)、卡介菌多糖核酸+环磷酰胺组(BCG-PSN+Cy组)、胸腺肽+环磷酰胺组(Th+Cy组)。各组分别给予生理盐水、环磷酰胺50mg/kg、卡介菌多糖核酸6.25mg/kg+环磷酰胺50mg/kg，胸腺肽50mg/kg+环磷酰胺50mg/kg。各组均用生理盐水调整为0.5ml/只。隔日腹腔注射1次，连用3次后停用环磷酰胺，第7天各组随机取小鼠5只进行第1次试验。继续隔日注射生理盐水、卡介菌多糖核酸和胸腺肽，第14天进行第2次试验;停用所有药物后于第21天进行第3次试验。
1.2.2 单个核细胞悬液的制备
1.2.2.1 外周血单个核细胞悬液的制备 采用常规Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离法获得外周血单个核细胞，用PBS液洗涤并调整细胞浓度为(1～1.5)×10 6 /ml。
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1.2.2.2 胸腺、脾脏组织单个核细胞悬液的制备 剥除小鼠胸腺、脾脏表面结缔组织被膜后在200目不锈钢网中轻轻揉搓，PBS液洗涤2次后加Tris-NH 4 Cl液裂解红细胞，再洗涤并调整细胞浓度为(1～1.5)×10 6 /ml。
1.2.3 单个核细胞的荧光染色与检测 取上述各组织单个核细胞悬液1ml加入FITC-CD +4单抗和PE-CD +8a 单抗各10μl，于4℃避光孵育1h后冷PBS液洗涤1次，经1%多聚 甲醛液固定后用流式细胞仪进行检测。
1.2.4 统计学处理 结果以均数±标准差(X±s)表示，采用SAS系统6.12进行Q检验，做均数之间的两两比较。
2 结果
2.1 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠胸腺T淋巴细胞亚群的影响 与NS组相比较，用药后BCG-PSN组CD +4 T细胞比例逐渐升高，第35、42天二组间差异有显著性(P<0.05);CD +8 T细胞亚群亦逐渐上升，第35天显著升高(P<0.05);但与第42天相比差异无显著性(P>0.05);双阳性CD +4 CD +8 T细胞比例逐步降低，从第28天开始二组间差异具有显著性(P<0.05);CD +4 /CD +8 比值一直无显著变化(P>0.05)。Th组CD +4 T亚群比例在第14天明显高于BCG-PSN组，但第21天恢复正常，随后逐渐升高。第35天后两组间差异有显著性(P<0.05)。CD +8 T细胞亚群于第14天明显高于BCG-PSN组，第21天回落至正常范围。但随后逐渐上升，第28天开始明显高于BCG-PSN组(P<0.05)，双阳性CD +4 CD +8 T细胞在第14天明显降低(P<0.05)，虽然在第21天有所回升，但随后又逐渐减少，其下降幅度明显低于BCG-PSN组，其中第14天、28和35天二组间差异有显著性。CD +4 /CD +8 比值均较BCG-PSN组和NS组偏低，其中以第28天最明显，差异有显著性(P<0.05)，见表1。
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表1 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠胸腺T细胞亚群的影响 (n=6) 注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Th组比较， Δ P<0.05
2.2 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响 同NS组比较，BCG-PSN组CD +4 T、CD +8 T细胞比例在早期变化不明显而第35天后显著升高(P<0.05)，CD +4/CD +8 比值一直无明显变化(P>0.05)。Th组早期CD +4 T、CD +8 T亚群虽一直较BCG-PSN组低，其差异无显著性，在第35天后才显著低于BCG-PSN组(P<0.05)，见表2。
2.3 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响 BCG-PSN组第14天CD +4 T、CD +8 T细胞亚 群较NS组有所下降，此后两亚群比例逐渐升高，第35天后显著高于NS组(P<0.05)。但CD +4 /CD +8 比值一直无显著性变化。Th组CD +4 T细胞比例逐渐升高，第35天、42天显著高于NS组(P<0.05)，但与BCG-PSN组差异有显著性。CD +8 T细胞亚群亦逐步升高，但其幅度较BCG-PSN组大，第35天后显著高于NS组和BCG-PSN组(P<0.05)。CD +4 /CD +8 比值逐步下降，第42天显著低于NS组和BCG-PSN组(P<0.05)，见表3。
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表2 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠脾脏T细胞亚群的影响 (n=6) 注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Th组比较， Δ P<0.05
表3 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠外周血T细胞亚群的影响 (n=6) 注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Th组比较 Δ P<0.05
2.4 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制模型小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响 使用环磷酰胺第7天Cy组CD +4 T、CD +4 /CD +8 水平较NS组明显下降，其差异有显著性(P<0.05)，而CD +8 水平较NS组差异无显著性。BCG-PSN+Cy组CD +4 T、CD +4 /CD +8 较NS组降低(P<0.05)，较Cy组 升高(P<0.05)，而CD+8 T无明显变化。Th+Cy组变化趋势与BCG-PSN+Cy组相似，但CD +4 T、CD +8 T、CD +4 /CD +8 均较低，且二组间CD +4 T亚群差异有显著性(P<0.05)。用药第14天BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 T、CD +8 T均明显低于NS组和高于Cy组(P<0.05)。第21天各组CD +4 T逐渐增高，BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组基本恢复正常，但较Cy组仍显著升高(P<0.05)，见表4。
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2.5 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制模型小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响 用药第7天BCG-PSN+Cy组CD +4 T明显升高，高于其余三组(P<0.05)，CD +8 T与Th+Cy组相近(P>0.05)，同时高于Cy组及NS组;CD +4 /CD +8 比值 稍高于Th+Cy组(P>0.05)，但明显高于NS组(P<0.05)，明显低于Cy组(P<0.05)。第14天BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 T、CD +8 T亚群与NS组比较均明显降低而和Cy组相近。第21天BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 T、CD +8 T、CD +4 /CD +8 均恢复正常，见表5。
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表4 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制小鼠外周血T细胞亚群的影响 (n=5)注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Cy组比较， Δ P<0.05，同Th+Cy组比较， # P<0.05
表5 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制小鼠脾脏T细胞亚群的影响 (n=5) 注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Cy组比较， Δ P<0.05，同Th+Cy组比较， # P<0.05
2.6 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制模型小鼠胸腺T淋巴细胞亚群的影响 用药第7天BCG-PSN+Cy组CD +4 T、CD +8 T细胞比例与Th+Cy组相近(P>0.05)。均明显高于NS组而低于Cy组(P<0.05)，CD +4 CD +8 双阳性T细胞均明显低于NS组(P<0.05)而高于Cy组(P<0.05)，CD +4 /CD +8 比值均低于NS组(P<0.05)。用药第14天BCG -PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4T、CD +8 T亚群均明显下降，但仍明显高于其它二组。CD +4 CD +8 T虽仍低于NS组，但较第7天明显回升且Th+Cy组的上升幅度较BCG-PSN+Cy组大(P<0.05)。BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 /CD +8 均低于NS组(P<0.05)。第21天BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 T、CD +8 T、CD +4 CD +8 T细胞比例与CD +4 /CD +8 比值恢复正常，二组间差异无显著性。见表6。
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表6 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制小鼠胸腺T细胞亚群的影响 (n=5) 注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Cy组比较， Δ P<0.05
3 讨论
本实验以环磷酰胺作为诱导剂，制作了免疫功能低下小鼠动物模型。对结果2.4Cy组第7、14和21天外周血检测结果分析发现其T淋巴细胞存在一个明显的变化，即CD +4 T亚群显著降低而CD +8 T亚群变化不明显，从而CD +4 /CD +8 比值下降且显著低于正常水平。此结果与以往研究一致 [3，4] ，说明本实验所诱导的免疫功能低下小鼠动物模型是成功的。
对结果2.4分析发现:免疫抑制小鼠在使用卡介菌多糖核酸的早期CD +4 T亚群虽发生紊乱，但其比例显著高于Cy组，而使用胸腺肽的早期CD +4 T细胞亚群显著低于BCG-PSN+Cy组和NS组而略高于Cy组。这表明卡介菌多糖核酸早期即可对抗环磷酰胺对CD +4 T细胞抑制而具有直接上调外周CD +4 T亚群的作用，而胸腺肽对外周CD +4 T细胞刺激作用不甚明显。
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分析结果2.6可见:尽管BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组早期CD +4 CD +8 T细胞比例明显低于NS组而高于Cy组，CD +4 T、CD +8 T细胞比例显著高于NS组而低于Cy组;随着用药时间的延长，胸腺组织CD +4 CD +8 T、CD +4 T及CD +8 T细胞比例逐渐恢复正常。其间Th+Cy组CD +4 CD+8 T细胞比例上升幅度显著高于BCG-PSN+Cy组。这显示卡介菌多糖核酸和胸腺肽均可在胸腺对抗环磷酰胺的免疫抑制作用并促使CD +4 CD +8 T细胞加速成熟为CD +4 T、CD +8 T细胞。在此过程中胸腺肽的作用强于卡介菌多糖核酸。
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对结果2.4BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组分别纵向比较分析可见:随着用药时间的延长，BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 T细胞比例均明显回升，但Th+Cy组上升幅度明显大于BCG-PSN+Cy组且伴CD +8 T细胞大比例上升。尽管此变化主要与中枢免疫器官胸腺改变相关，但从另一个侧面佐证胸腺肽对胸腺的刺激作用强于卡介菌多糖核 酸，且有CD +8 T亚群偏向性。
分析结果2.1发现:应用卡介菌多糖核酸后胸腺组织未成熟前体细胞CD +4 CD +8 T细胞亚群比例逐步降低，成熟CD +4 、CD +8 T细胞亚群的比例逐步升高，CD +4 /CD +8 比值一直保持无显著性变化;而使用胸腺肽后胸腺组织存在类似变化，但CD +4 CD +8 T细胞下降幅度明显大于BCG-PSN组，CD +4 T、CD +8 T细胞比例上升幅度大于BCG-PSN组，CD +4 /CD +8 比值低于NS组和BCG-PSN组，有时可出现显著差异。这些结果提示卡介菌多糖核酸和胸腺肽均能加快CD +4 CD +8 T细胞分化成熟为CD +4 T和CD +8 T细胞，但卡介菌多糖核酸的刺激作用较为缓和且有CD +4 T细胞偏向性;而胸腺肽的刺激作用较为强烈且有CD +8 T亚群偏向性，CD +4 /CD +8 比值低于正常。
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现代免疫学观点认为成熟T淋巴细胞依其表型不同而可分为CD +4 T细胞和CD +8 T细胞两亚类，根据功能不同CD +4 T细胞和CD +8 T细胞又可分为不同亚型。机体各免疫细胞，尤其T细胞亚群之间的相互制约、相互协调形成正常免疫应答，使机体既能清除抗原性物质又不损伤自身组织。若各亚群之间出现不平衡则可造成机体免疫紊乱 [5，6] 。外周血中T细胞亚群的数目和CD +4 /CD +8 比值测定是评估机体免疫调节平衡状态最有意义的参数之一 [7，8] 。本实验通过对不同免疫状况小鼠连续观察，从不同侧面证明:卡介菌多糖核酸和胸腺肽都对T淋巴细胞的发育成熟有促进性刺激作用，但胸腺肽的作用部位主要在胸腺，而卡介菌多糖核酸除胸腺外，还可对外周CD +4 T细胞亚群有一定的直接刺激作用。但由于作用强度和刺激T细胞亚群偏向性的不同，胸腺肽常导致胸腺和外周血CD +4 T、CD +8 T细胞比例出现较大幅度的波动;卡介菌多糖核酸则能始终保持CD +4 /CD +8 比值处于正常范围，因此在提高机体免疫功能的同时，卡介菌多糖核酸具有更好的安全性。
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参考文献
1 罗秋平，谭礼智，王慧.卡介菌多糖核酸和死卡介菌对环磷酰胺免疫抑制作用的影响.湖南医科大学学报，1996，21(4):281-284.
2 施红，顾惜春，朱玲，等.大剂量胸腺肽对恶性血液病化疗患者T细胞亚群的影响.临床血液学杂志，2000，13(3):112-113.
3 毕爱华，龚非力.医学免疫学，第二版.北京:人民军医出版社，1999，74-76.
4 Napolitano F.Conditioned inhibition of antibody response and CD 4 posiˉ tive cells.Physiol Behav，1998，64:395-340.
5 龙振洲.医学免疫学，第二版.北京:人民卫生出版社，1998，82-89.
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6 龚非力.医学免疫学，北京:科学出版社，2000，154-160.
7 MCMichael AJ，Fabre Jus.Monoclonal antibodies in clinical medicial.London:Academic press INC1td，1982，230-244.
8 Syrijala H，Surcel HM，Ilonen J.LowCD +4 /CD +8 lymphocyte radio in aˉcute myocardial infection.Clin Exp Immunol，1991，83:326-342.
(收稿日期:2002-08-29)
作者单位:430030华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科
(编辑张 璇), 百拇医药(邓云华 陈映玲 陈兴平 李永喜 周礼义)
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关键词 卡介菌多糖核酸 胸
腺肽 T淋巴细胞 CD +4 CD +8 T CD +4 T CD +8 T
文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)01-0001-06
A comparing study on the effects of polysaccharide
nucleic acid of BCG and thymus peptide on T-lymphocyte subgroup
of normal and immunity inhibited mice
Deng Yunhua，Chen Yingling，Chen Xingping，et al.
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Dept.of Dermatology of Tueng-Ji Hospital Affiliated to Tueng-Ji
Medical college of central china Science and Technology University，Wuhan430030.
【Abstract】 Objective To compare the effects of polysaccharide-nueleic acidof BCG and thymus peptide on normal and immunity inhibited T-lymphocyte subgroup of mice.Method CD +4 and CD +8 T-cyte subgroup of single nucleic cell in thymus，spleen and peripheral blood were detected with flow cytometry successively after application of polysaccharide nucleie acid of BCG and thymus peptide，and CD+4 /CD +8 ratio was also calculated.Result Polysacˉcharide-nucleic acid of BCGand thymus peptide both can decrease CD +4 and CD +8 T-cyte subgroup proportionin three tissues，at the same time increase CD +4 ，CD +8 T proportion.While thymus peptide induced fluctuation amplitude is rather larger than that of BCG-PSNgroup.Conclusion The acting location of thymus peptide is in thymus，its promoting stimulation is stronger，while polysaccharide-nucleic acid of BCG not only accelerates the differentiation mature，but also has some direct stimulation to peripheral CD +4 subgroup，meanwhile persistently maintains CD +4 /CD +8 ratio innormal range.So，polysaccharide-nucleic acid of BCG possesses more safety.
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Key words polysaccharide-nucleic acid thymus peptide T-lymphocyte CD +4 CD +8 T CD +4 T CD +8 T
卡介菌多糖核酸(斯奇康注射液)和胸腺肽是目前临床上常用的两种免疫调节剂，多应用于病毒感染性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤等的辅助治疗，临床观察均有一定的疗效。有研究表明 [1，2] 它们都具有促进T细胞增殖分化的作用，但具体机制至今仍不十分清楚。为比较二者对机体T淋巴细胞亚群的调节机制的差异，本实验采用流式细胞分析术连续观测了卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常和免疫抑制小鼠的胸腺、脾脏、外周血T淋巴细胞CD +4 T、CD +8 T亚群的影响并进行了对比分析。现将结果予以报告，以供参考。
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1 材料与方法
1.1 材料 卡介菌多糖核酸注射液(湖南斯奇康医药有限公司生产，0.5mg/ml·支;胸腺肽注射液(武汉梅山生物化学制药厂生产，4mg/ml·支;注射用环磷酰胺粉剂(江苏恒瑞医药股份有限公司生产，200mg/瓶);FITC-CD +4 单抗、 PE-CD +8a 单抗(美国PharMigen公司生产);Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产)。实验动物为健康昆明种小白鼠，4～5周龄，体重20±3g，同济医学院实验动物中心提供;流式细胞仪FACSort(美国Becton Dikinson公司生产)。
1.2 方法
1.2.1 分组与处理
1.2.1.1 免疫正常小鼠实验组 将健康昆明种小白鼠90 只，雌雄各半，随机分为卡介菌多糖核酸组(BCG-PSN组)、胸腺肽组(Th组)、正常对照组(NS组)。BCG-PSN组每次给以卡介菌多糖核酸注射液6.25mg/kg，Th组给以胸腺肽注射液50mg/kg，NS组给以生理盐水。用生理盐水调整各组药物浓度后均按0.5ml/只腹腔注射，隔日1次，连续用药，分别于第14、21、28、35、42天各组随机取雌雄小鼠各3只，经眼底动脉收集外周血并脱椎处死小鼠摘取其胸腺和脾脏。
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1.2.1.2 免疫抑制模型小鼠实验组 将60只健康雌性小鼠随机分为四组:正常对照组(NS组)、环磷酰胺组(Cy组)、卡介菌多糖核酸+环磷酰胺组(BCG-PSN+Cy组)、胸腺肽+环磷酰胺组(Th+Cy组)。各组分别给予生理盐水、环磷酰胺50mg/kg、卡介菌多糖核酸6.25mg/kg+环磷酰胺50mg/kg，胸腺肽50mg/kg+环磷酰胺50mg/kg。各组均用生理盐水调整为0.5ml/只。隔日腹腔注射1次，连用3次后停用环磷酰胺，第7天各组随机取小鼠5只进行第1次试验。继续隔日注射生理盐水、卡介菌多糖核酸和胸腺肽，第14天进行第2次试验;停用所有药物后于第21天进行第3次试验。
1.2.2 单个核细胞悬液的制备
1.2.2.1 外周血单个核细胞悬液的制备 采用常规Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离法获得外周血单个核细胞，用PBS液洗涤并调整细胞浓度为(1～1.5)×10 6 /ml。
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1.2.2.2 胸腺、脾脏组织单个核细胞悬液的制备 剥除小鼠胸腺、脾脏表面结缔组织被膜后在200目不锈钢网中轻轻揉搓，PBS液洗涤2次后加Tris-NH 4 Cl液裂解红细胞，再洗涤并调整细胞浓度为(1～1.5)×10 6 /ml。
1.2.3 单个核细胞的荧光染色与检测 取上述各组织单个核细胞悬液1ml加入FITC-CD +4单抗和PE-CD +8a 单抗各10μl，于4℃避光孵育1h后冷PBS液洗涤1次，经1%多聚 甲醛液固定后用流式细胞仪进行检测。
1.2.4 统计学处理 结果以均数±标准差(X±s)表示，采用SAS系统6.12进行Q检验，做均数之间的两两比较。
2 结果
2.1 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠胸腺T淋巴细胞亚群的影响 与NS组相比较，用药后BCG-PSN组CD +4 T细胞比例逐渐升高，第35、42天二组间差异有显著性(P<0.05);CD +8 T细胞亚群亦逐渐上升，第35天显著升高(P<0.05);但与第42天相比差异无显著性(P>0.05);双阳性CD +4 CD +8 T细胞比例逐步降低，从第28天开始二组间差异具有显著性(P<0.05);CD +4 /CD +8 比值一直无显著变化(P>0.05)。Th组CD +4 T亚群比例在第14天明显高于BCG-PSN组，但第21天恢复正常，随后逐渐升高。第35天后两组间差异有显著性(P<0.05)。CD +8 T细胞亚群于第14天明显高于BCG-PSN组，第21天回落至正常范围。但随后逐渐上升，第28天开始明显高于BCG-PSN组(P<0.05)，双阳性CD +4 CD +8 T细胞在第14天明显降低(P<0.05)，虽然在第21天有所回升，但随后又逐渐减少，其下降幅度明显低于BCG-PSN组，其中第14天、28和35天二组间差异有显著性。CD +4 /CD +8 比值均较BCG-PSN组和NS组偏低，其中以第28天最明显，差异有显著性(P<0.05)，见表1。
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表1 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠胸腺T细胞亚群的影响 (n=6) 注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Th组比较， Δ P<0.05
2.2 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响 同NS组比较，BCG-PSN组CD +4 T、CD +8 T细胞比例在早期变化不明显而第35天后显著升高(P<0.05)，CD +4/CD +8 比值一直无明显变化(P>0.05)。Th组早期CD +4 T、CD +8 T亚群虽一直较BCG-PSN组低，其差异无显著性，在第35天后才显著低于BCG-PSN组(P<0.05)，见表2。
2.3 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响 BCG-PSN组第14天CD +4 T、CD +8 T细胞亚 群较NS组有所下降，此后两亚群比例逐渐升高，第35天后显著高于NS组(P<0.05)。但CD +4 /CD +8 比值一直无显著性变化。Th组CD +4 T细胞比例逐渐升高，第35天、42天显著高于NS组(P<0.05)，但与BCG-PSN组差异有显著性。CD +8 T细胞亚群亦逐步升高，但其幅度较BCG-PSN组大，第35天后显著高于NS组和BCG-PSN组(P<0.05)。CD +4 /CD +8 比值逐步下降，第42天显著低于NS组和BCG-PSN组(P<0.05)，见表3。
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表2 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠脾脏T细胞亚群的影响 (n=6) 注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Th组比较， Δ P<0.05
表3 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对正常小鼠外周血T细胞亚群的影响 (n=6) 注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Th组比较 Δ P<0.05
2.4 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制模型小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响 使用环磷酰胺第7天Cy组CD +4 T、CD +4 /CD +8 水平较NS组明显下降，其差异有显著性(P<0.05)，而CD +8 水平较NS组差异无显著性。BCG-PSN+Cy组CD +4 T、CD +4 /CD +8 较NS组降低(P<0.05)，较Cy组 升高(P<0.05)，而CD+8 T无明显变化。Th+Cy组变化趋势与BCG-PSN+Cy组相似，但CD +4 T、CD +8 T、CD +4 /CD +8 均较低，且二组间CD +4 T亚群差异有显著性(P<0.05)。用药第14天BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 T、CD +8 T均明显低于NS组和高于Cy组(P<0.05)。第21天各组CD +4 T逐渐增高，BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组基本恢复正常，但较Cy组仍显著升高(P<0.05)，见表4。
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2.5 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制模型小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响 用药第7天BCG-PSN+Cy组CD +4 T明显升高，高于其余三组(P<0.05)，CD +8 T与Th+Cy组相近(P>0.05)，同时高于Cy组及NS组;CD +4 /CD +8 比值 稍高于Th+Cy组(P>0.05)，但明显高于NS组(P<0.05)，明显低于Cy组(P<0.05)。第14天BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 T、CD +8 T亚群与NS组比较均明显降低而和Cy组相近。第21天BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 T、CD +8 T、CD +4 /CD +8 均恢复正常，见表5。
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表4 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制小鼠外周血T细胞亚群的影响 (n=5)注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Cy组比较， Δ P<0.05，同Th+Cy组比较， # P<0.05
表5 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制小鼠脾脏T细胞亚群的影响 (n=5) 注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Cy组比较， Δ P<0.05，同Th+Cy组比较， # P<0.05
2.6 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制模型小鼠胸腺T淋巴细胞亚群的影响 用药第7天BCG-PSN+Cy组CD +4 T、CD +8 T细胞比例与Th+Cy组相近(P>0.05)。均明显高于NS组而低于Cy组(P<0.05)，CD +4 CD +8 双阳性T细胞均明显低于NS组(P<0.05)而高于Cy组(P<0.05)，CD +4 /CD +8 比值均低于NS组(P<0.05)。用药第14天BCG -PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4T、CD +8 T亚群均明显下降，但仍明显高于其它二组。CD +4 CD +8 T虽仍低于NS组，但较第7天明显回升且Th+Cy组的上升幅度较BCG-PSN+Cy组大(P<0.05)。BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 /CD +8 均低于NS组(P<0.05)。第21天BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 T、CD +8 T、CD +4 CD +8 T细胞比例与CD +4 /CD +8 比值恢复正常，二组间差异无显著性。见表6。
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表6 卡介菌多糖核酸和胸腺肽对免疫抑制小鼠胸腺T细胞亚群的影响 (n=5) 注:同NS组比较， ˇ P<0.05，同Cy组比较， Δ P<0.05
3 讨论
本实验以环磷酰胺作为诱导剂，制作了免疫功能低下小鼠动物模型。对结果2.4Cy组第7、14和21天外周血检测结果分析发现其T淋巴细胞存在一个明显的变化，即CD +4 T亚群显著降低而CD +8 T亚群变化不明显，从而CD +4 /CD +8 比值下降且显著低于正常水平。此结果与以往研究一致 [3，4] ，说明本实验所诱导的免疫功能低下小鼠动物模型是成功的。
对结果2.4分析发现:免疫抑制小鼠在使用卡介菌多糖核酸的早期CD +4 T亚群虽发生紊乱，但其比例显著高于Cy组，而使用胸腺肽的早期CD +4 T细胞亚群显著低于BCG-PSN+Cy组和NS组而略高于Cy组。这表明卡介菌多糖核酸早期即可对抗环磷酰胺对CD +4 T细胞抑制而具有直接上调外周CD +4 T亚群的作用，而胸腺肽对外周CD +4 T细胞刺激作用不甚明显。
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分析结果2.6可见:尽管BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组早期CD +4 CD +8 T细胞比例明显低于NS组而高于Cy组，CD +4 T、CD +8 T细胞比例显著高于NS组而低于Cy组;随着用药时间的延长，胸腺组织CD +4 CD +8 T、CD +4 T及CD +8 T细胞比例逐渐恢复正常。其间Th+Cy组CD +4 CD+8 T细胞比例上升幅度显著高于BCG-PSN+Cy组。这显示卡介菌多糖核酸和胸腺肽均可在胸腺对抗环磷酰胺的免疫抑制作用并促使CD +4 CD +8 T细胞加速成熟为CD +4 T、CD +8 T细胞。在此过程中胸腺肽的作用强于卡介菌多糖核酸。
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对结果2.4BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组分别纵向比较分析可见:随着用药时间的延长，BCG-PSN+Cy组和Th+Cy组CD +4 T细胞比例均明显回升，但Th+Cy组上升幅度明显大于BCG-PSN+Cy组且伴CD +8 T细胞大比例上升。尽管此变化主要与中枢免疫器官胸腺改变相关，但从另一个侧面佐证胸腺肽对胸腺的刺激作用强于卡介菌多糖核 酸，且有CD +8 T亚群偏向性。
分析结果2.1发现:应用卡介菌多糖核酸后胸腺组织未成熟前体细胞CD +4 CD +8 T细胞亚群比例逐步降低，成熟CD +4 、CD +8 T细胞亚群的比例逐步升高，CD +4 /CD +8 比值一直保持无显著性变化;而使用胸腺肽后胸腺组织存在类似变化，但CD +4 CD +8 T细胞下降幅度明显大于BCG-PSN组，CD +4 T、CD +8 T细胞比例上升幅度大于BCG-PSN组，CD +4 /CD +8 比值低于NS组和BCG-PSN组，有时可出现显著差异。这些结果提示卡介菌多糖核酸和胸腺肽均能加快CD +4 CD +8 T细胞分化成熟为CD +4 T和CD +8 T细胞，但卡介菌多糖核酸的刺激作用较为缓和且有CD +4 T细胞偏向性;而胸腺肽的刺激作用较为强烈且有CD +8 T亚群偏向性，CD +4 /CD +8 比值低于正常。
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现代免疫学观点认为成熟T淋巴细胞依其表型不同而可分为CD +4 T细胞和CD +8 T细胞两亚类，根据功能不同CD +4 T细胞和CD +8 T细胞又可分为不同亚型。机体各免疫细胞，尤其T细胞亚群之间的相互制约、相互协调形成正常免疫应答，使机体既能清除抗原性物质又不损伤自身组织。若各亚群之间出现不平衡则可造成机体免疫紊乱 [5，6] 。外周血中T细胞亚群的数目和CD +4 /CD +8 比值测定是评估机体免疫调节平衡状态最有意义的参数之一 [7，8] 。本实验通过对不同免疫状况小鼠连续观察，从不同侧面证明:卡介菌多糖核酸和胸腺肽都对T淋巴细胞的发育成熟有促进性刺激作用，但胸腺肽的作用部位主要在胸腺，而卡介菌多糖核酸除胸腺外，还可对外周CD +4 T细胞亚群有一定的直接刺激作用。但由于作用强度和刺激T细胞亚群偏向性的不同，胸腺肽常导致胸腺和外周血CD +4 T、CD +8 T细胞比例出现较大幅度的波动;卡介菌多糖核酸则能始终保持CD +4 /CD +8 比值处于正常范围，因此在提高机体免疫功能的同时，卡介菌多糖核酸具有更好的安全性。
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参考文献
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2 施红，顾惜春，朱玲，等.大剂量胸腺肽对恶性血液病化疗患者T细胞亚群的影响.临床血液学杂志，2000，13(3):112-113.
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(收稿日期:2002-08-29)
作者单位:430030华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科
(编辑张 璇), 百拇医药(邓云华 陈映玲 陈兴平 李永喜 周礼义)