肝癌基因治疗的现状与展望
【文献标识码】 A【文章编号】 1606-8106(2003)17-2594-02
随着近年来分子生物学技术的发展及人类基因谱的不断完善，人们对肝癌发病原因及发病机制又有了新的认识，即肝癌相关的癌基因的激活及抑癌基因的失活与突变是导致肝细胞癌变的根本原因。正常细胞增殖的调控信号大体上可分为两类 [1，2] :(1)促使细胞进入增殖期并阻止其发生分化的正信号。(2)抑制细胞进入增殖期并促进其发生分化的负信号。细胞内的癌基因与抑癌基因对细胞的增殖与分化起着正负调节作用。所以说，在分子水平上与肝癌相关癌基因与抑癌基因的变化是肝癌发生的根本原因。与此同时，人们提出了一个全新的概念:基因治疗，为肿瘤的治疗带来了新的希望。所谓肿瘤的基因治疗就是指以遗传学技术为基础，将克隆的正常基因序列导入该基因缺陷的患者体内，使导入的基因发挥作用而纠正基因缺陷，或设计出已经突变的癌基因的反义序列导入患者体内，阻止突变的癌基因发挥其效应 [3] 。肿瘤的基因治疗最终目的是通过不同途径杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长使肿瘤消退。所以，肿瘤的基因治疗是对肿瘤细胞恶变过程的逆转，对正常细胞并没有影响。狭义上说，肿瘤的基因治疗主要包括两个方面 [4，5] :(1)利用反义技术阻止癌基因的过度表达并使其逆转。(2)利用基因转染技术向肿瘤细胞中补充已缺失或突 变的抑癌基因。
, http://www.100md.com
1 肝癌基因治疗的研究现状
基于以上理论，人们开始利用基因治疗的方法治疗肝癌的探索性研究:1988年加州大学医学院将P53基因导入P53基因缺失的肝癌细胞，结果发现肝细胞的恶性表型发生了部分逆转，这是人类第一次利用单基因治疗肝脏恶性肿瘤，并显示出较好的效果 [6，7] 。1991年上海肿瘤研究所顾健人等利用N-ras反义基因治疗含人肝转移癌的裸鼠，结果发现N-ras反义基因能够抑制肝癌细胞中N-ras在mRNA水平上的表达，并阻碍肝癌细胞的生长。但是，这些利用单基因的基因治疗并没有彻底地抑制肝癌细胞的生长，也没有达到完全逆转肝癌细胞恶性表型的目的。由此可见，在由正常肝细胞转变成肝癌细胞的过程中可能存在多个环节，每一种单基因的变化只能作用于其中的某一个环节。所以利用单基因的基因治疗只能作用于肝细胞癌变过程中的某一阶段，并不能阻止肝细胞癌变的整个趋势。
为了提高肝癌的整体基因治疗水平，国内外学者 [8～10] 开始了针对肝癌相关基因的研究。最近，Barbacid小组率先鉴定出与肝癌相关的基因谱:N-ras、C-myc、c-ets、c-fos、IGF-Ⅱ、c-fms、P53、P16，同时指出N-ras、C-myc、P53、P16是与肝癌发生最密切的相关基因，它们在肝细胞癌变过程中发挥着各自不同的作用:C-myc癌基因的持续表达能促进肝细胞从再生性增殖向高度增殖的转变;N-ras异常能使肝细胞高度增殖发生腺瘤样变;P53、P16抑癌基因的缺失使肝细胞从腺瘤样变最终发生癌变。这就进一步证实了肝癌是一种多基因相关性疾病，各相关基因在肝癌发生的过程中起着各自不同的作用，使肝细胞逐渐发生增生、腺瘤样变及癌变。所以，针对个别癌基因或个别抑癌基因治疗肝癌只能缓解肝癌发生过程中的某一步骤，并不能达到根治肝癌的目的。
, 百拇医药
P53、P16基因对肝癌细胞的抑制作用有相同之处，同时也有自己各自的作用特点。P16基因片段远小于P53基因，仅为P53片段的1/2，转染效率高，操作方便;另一原因就是P53蛋白作用特异性差，作用广，而P16基因有专一的作用目标CDK4 [11] 。所以，人们一直在设想可以生产出一种模拟P16的药物以替代已缺失的P16基因，进而达到有效抑癌的目的。
反义寡核苷酸是一类经人工合成或构建的反义表达载体所表达的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸，通过碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接、加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细胞的生长、分化。反义寡脱氧核苷酸是最常用的反义核苷酸，其抑制靶基因的确切机制尚不完全清楚 [12，13] 。一般认为有特异性机制与非特异性机制两种。特异性机制是指反义寡脱氧核苷酸与靶序列结合后通过以下途径抑制靶基因的表达:(1)与DNA结合成三链结构或与单链DNA结合成双链结构以阻止靶基因的复制与转录;(2)与靶mRNA结合形成双链杂交体激活核酸酶H，裂解靶mRNA阻断蛋白的翻译;(3)与mRNA AP位点结合干扰其剪接、加工和运输以终止蛋白质的翻译;(4)占据酶结合位点，表达核酶，降解靶mRˉNA。非特异性机制是指非序列特异性药理学效应或与细胞蛋白间的反应，为许多双链核酸所共有。如双链RNA增加IFN的合成，激活两种IFN的诱导基因:2′，5′-寡腺苷酸合成酶和蛋白激酶P60。前者激活核酸内切酶降解靶mRˉNA，后者使真核细胞启始因子的亚单位磷酸化导致启动失败，从而抑制蛋白质的合成 [14] 。反义寡核苷酸在理论上有其特有的优点:设计容易、合成简单、样式多样、具有高度的靶异性(通过碱基互补原理)、具有强的局部性和针对性。以上这些优点都是常规药物无法比拟的，具有巨大的吸引力和研究价值 [15，16] 。
, http://www.100md.com
我们研究室自1996年也开始针对肝癌的基因治疗研究。即从肝癌相关基因着手，利用基因重组技术首次将P53、P16两个抑癌基因构建成一个载体，利用基因转染技术将抑癌基因P53、P16转染至包装细胞，最后成功地感染 了肝癌细胞;同时利用计算机针对癌基因N-ras、C-myc突变点5′翻译起始点的碱基序列设计出各自的反义序列并转入肝癌细胞，从而在多个主要发病环节上同时阻止了肝细胞增殖、腺瘤样变与癌变。结果表明，两个不同的抑癌基因可以在一个细胞中转录与表达;N-ras、C-myc反义寡核苷酸能明显抑制N-ras、C-myc蛋白产物的表达;联合基因治疗对肝癌细胞的生长显示出明显的抑制效果。这也为今后利用更多的相关基因联合治疗其他恶性肿瘤做了初步的尝试。
2 肝癌基因治疗的展望
当然，利用多基因治疗肝癌也存在着一些关键性的问题:逆转录病毒载体的安全性与靶细胞性还有待于进一步提高，影响了载体的广泛应用，这些载体表达率只能达到10%～40%，达不到临床应用的要求;将所有反义基因片段与抑癌基因片段构建成一个融合表达载体将是最理想的选择方式，但由于连接后的载体过大，这将会明显降低基因的转染率，反而会影响基因治疗的整体效果。这些问题就是我们下一步急需解决的关键问题。
, 百拇医药
参考文献
1 李岱宗，顾健人.人原发性肝癌的分子生物学研究.肿瘤，1999，11:123-126.
2 卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社，1998，130-133.
3 Sambrook EF.Molecular Cloning，2002，6:786-801.
4 Leonard GD.Isted.New York:Elsevier Science Publishing Co，Inc，2002，8，47-50.
5 Chomczynski P.Analytical biochem，2001，162:55-63.
6 Weichselbaum RR.Lancet，1997，349(2):10-12.
, http://www.100md.com
7 Barbacid T，Civin CI.J Clin Oncol，1999，14(8):2224-2233.
8 Buetow KH.Proc Natl Acad Sci USA，1999，86:3852-3861.
9 Fied JK.Soc.Med，1995，88(1):35.
10 Nakamura T，Pichel JG.Proc Natl Acad USA，1999，92:6142.
11 Koorey DJ，Mccaughan GM，Trent RJ，et al.Hum Mutat，2002，3(1):12.
12 Suzuki Y，Uematsu T，Mizuno A，et al.Virchows Arch，2001，424(5):453.
, http://www.100md.com
13 Rhyu MG，Pare WS，Jung Yj，et al.Gastroenterol，2001，106:1584.
14 Tamrua G，Macsawa C，Suzuki Y，et al.Cancer Res，2002，54(5):1149.
15 Nakatsuru S，Tanayisawa A，Ichit S，et al.Hum Mol Genet，2003，2(9):1463.
16 Ram JM，Nakatsura S，Miyoshi Y，et al.Hum Mol Genet，2003，2(9):1463.
作者单位:130021长春吉林大学第一医院普通外科
(编辑李年令), http://www.100md.com(王磊)
随着近年来分子生物学技术的发展及人类基因谱的不断完善，人们对肝癌发病原因及发病机制又有了新的认识，即肝癌相关的癌基因的激活及抑癌基因的失活与突变是导致肝细胞癌变的根本原因。正常细胞增殖的调控信号大体上可分为两类 [1，2] :(1)促使细胞进入增殖期并阻止其发生分化的正信号。(2)抑制细胞进入增殖期并促进其发生分化的负信号。细胞内的癌基因与抑癌基因对细胞的增殖与分化起着正负调节作用。所以说，在分子水平上与肝癌相关癌基因与抑癌基因的变化是肝癌发生的根本原因。与此同时，人们提出了一个全新的概念:基因治疗，为肿瘤的治疗带来了新的希望。所谓肿瘤的基因治疗就是指以遗传学技术为基础，将克隆的正常基因序列导入该基因缺陷的患者体内，使导入的基因发挥作用而纠正基因缺陷，或设计出已经突变的癌基因的反义序列导入患者体内，阻止突变的癌基因发挥其效应 [3] 。肿瘤的基因治疗最终目的是通过不同途径杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长使肿瘤消退。所以，肿瘤的基因治疗是对肿瘤细胞恶变过程的逆转，对正常细胞并没有影响。狭义上说，肿瘤的基因治疗主要包括两个方面 [4，5] :(1)利用反义技术阻止癌基因的过度表达并使其逆转。(2)利用基因转染技术向肿瘤细胞中补充已缺失或突 变的抑癌基因。
, http://www.100md.com
1 肝癌基因治疗的研究现状
基于以上理论，人们开始利用基因治疗的方法治疗肝癌的探索性研究:1988年加州大学医学院将P53基因导入P53基因缺失的肝癌细胞，结果发现肝细胞的恶性表型发生了部分逆转，这是人类第一次利用单基因治疗肝脏恶性肿瘤，并显示出较好的效果 [6，7] 。1991年上海肿瘤研究所顾健人等利用N-ras反义基因治疗含人肝转移癌的裸鼠，结果发现N-ras反义基因能够抑制肝癌细胞中N-ras在mRNA水平上的表达，并阻碍肝癌细胞的生长。但是，这些利用单基因的基因治疗并没有彻底地抑制肝癌细胞的生长，也没有达到完全逆转肝癌细胞恶性表型的目的。由此可见，在由正常肝细胞转变成肝癌细胞的过程中可能存在多个环节，每一种单基因的变化只能作用于其中的某一个环节。所以利用单基因的基因治疗只能作用于肝细胞癌变过程中的某一阶段，并不能阻止肝细胞癌变的整个趋势。
为了提高肝癌的整体基因治疗水平，国内外学者 [8～10] 开始了针对肝癌相关基因的研究。最近，Barbacid小组率先鉴定出与肝癌相关的基因谱:N-ras、C-myc、c-ets、c-fos、IGF-Ⅱ、c-fms、P53、P16，同时指出N-ras、C-myc、P53、P16是与肝癌发生最密切的相关基因，它们在肝细胞癌变过程中发挥着各自不同的作用:C-myc癌基因的持续表达能促进肝细胞从再生性增殖向高度增殖的转变;N-ras异常能使肝细胞高度增殖发生腺瘤样变;P53、P16抑癌基因的缺失使肝细胞从腺瘤样变最终发生癌变。这就进一步证实了肝癌是一种多基因相关性疾病，各相关基因在肝癌发生的过程中起着各自不同的作用，使肝细胞逐渐发生增生、腺瘤样变及癌变。所以，针对个别癌基因或个别抑癌基因治疗肝癌只能缓解肝癌发生过程中的某一步骤，并不能达到根治肝癌的目的。
, 百拇医药
P53、P16基因对肝癌细胞的抑制作用有相同之处，同时也有自己各自的作用特点。P16基因片段远小于P53基因，仅为P53片段的1/2，转染效率高，操作方便;另一原因就是P53蛋白作用特异性差，作用广，而P16基因有专一的作用目标CDK4 [11] 。所以，人们一直在设想可以生产出一种模拟P16的药物以替代已缺失的P16基因，进而达到有效抑癌的目的。
反义寡核苷酸是一类经人工合成或构建的反义表达载体所表达的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸，通过碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接、加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细胞的生长、分化。反义寡脱氧核苷酸是最常用的反义核苷酸，其抑制靶基因的确切机制尚不完全清楚 [12，13] 。一般认为有特异性机制与非特异性机制两种。特异性机制是指反义寡脱氧核苷酸与靶序列结合后通过以下途径抑制靶基因的表达:(1)与DNA结合成三链结构或与单链DNA结合成双链结构以阻止靶基因的复制与转录;(2)与靶mRNA结合形成双链杂交体激活核酸酶H，裂解靶mRNA阻断蛋白的翻译;(3)与mRNA AP位点结合干扰其剪接、加工和运输以终止蛋白质的翻译;(4)占据酶结合位点，表达核酶，降解靶mRˉNA。非特异性机制是指非序列特异性药理学效应或与细胞蛋白间的反应，为许多双链核酸所共有。如双链RNA增加IFN的合成，激活两种IFN的诱导基因:2′，5′-寡腺苷酸合成酶和蛋白激酶P60。前者激活核酸内切酶降解靶mRˉNA，后者使真核细胞启始因子的亚单位磷酸化导致启动失败，从而抑制蛋白质的合成 [14] 。反义寡核苷酸在理论上有其特有的优点:设计容易、合成简单、样式多样、具有高度的靶异性(通过碱基互补原理)、具有强的局部性和针对性。以上这些优点都是常规药物无法比拟的，具有巨大的吸引力和研究价值 [15，16] 。
, http://www.100md.com
我们研究室自1996年也开始针对肝癌的基因治疗研究。即从肝癌相关基因着手，利用基因重组技术首次将P53、P16两个抑癌基因构建成一个载体，利用基因转染技术将抑癌基因P53、P16转染至包装细胞，最后成功地感染 了肝癌细胞;同时利用计算机针对癌基因N-ras、C-myc突变点5′翻译起始点的碱基序列设计出各自的反义序列并转入肝癌细胞，从而在多个主要发病环节上同时阻止了肝细胞增殖、腺瘤样变与癌变。结果表明，两个不同的抑癌基因可以在一个细胞中转录与表达;N-ras、C-myc反义寡核苷酸能明显抑制N-ras、C-myc蛋白产物的表达;联合基因治疗对肝癌细胞的生长显示出明显的抑制效果。这也为今后利用更多的相关基因联合治疗其他恶性肿瘤做了初步的尝试。
2 肝癌基因治疗的展望
当然，利用多基因治疗肝癌也存在着一些关键性的问题:逆转录病毒载体的安全性与靶细胞性还有待于进一步提高，影响了载体的广泛应用，这些载体表达率只能达到10%～40%，达不到临床应用的要求;将所有反义基因片段与抑癌基因片段构建成一个融合表达载体将是最理想的选择方式，但由于连接后的载体过大，这将会明显降低基因的转染率，反而会影响基因治疗的整体效果。这些问题就是我们下一步急需解决的关键问题。
, 百拇医药
参考文献
1 李岱宗，顾健人.人原发性肝癌的分子生物学研究.肿瘤，1999，11:123-126.
2 卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社，1998，130-133.
3 Sambrook EF.Molecular Cloning，2002，6:786-801.
4 Leonard GD.Isted.New York:Elsevier Science Publishing Co，Inc，2002，8，47-50.
5 Chomczynski P.Analytical biochem，2001，162:55-63.
6 Weichselbaum RR.Lancet，1997，349(2):10-12.
, http://www.100md.com
7 Barbacid T，Civin CI.J Clin Oncol，1999，14(8):2224-2233.
8 Buetow KH.Proc Natl Acad Sci USA，1999，86:3852-3861.
9 Fied JK.Soc.Med，1995，88(1):35.
10 Nakamura T，Pichel JG.Proc Natl Acad USA，1999，92:6142.
11 Koorey DJ，Mccaughan GM，Trent RJ，et al.Hum Mutat，2002，3(1):12.
12 Suzuki Y，Uematsu T，Mizuno A，et al.Virchows Arch，2001，424(5):453.
, http://www.100md.com
13 Rhyu MG，Pare WS，Jung Yj，et al.Gastroenterol，2001，106:1584.
14 Tamrua G，Macsawa C，Suzuki Y，et al.Cancer Res，2002，54(5):1149.
15 Nakatsuru S，Tanayisawa A，Ichit S，et al.Hum Mol Genet，2003，2(9):1463.
16 Ram JM，Nakatsura S，Miyoshi Y，et al.Hum Mol Genet，2003，2(9):1463.
作者单位:130021长春吉林大学第一医院普通外科
(编辑李年令), http://www.100md.com(王磊)