骨髓细胞移植对梗死区心肌的血管再生作用
【摘要】 目的 研究骨髓细胞梗死心肌移植的血管再生作用。方法 骨髓细胞经局部注射移植入心肌梗死区域，1、2、4、8周后取心肌标本，应用免疫组织化学方法检测梗死区血管密度及bFGF表达。应用TTC染色法检测移植后4周梗死心肌面积。结果 骨髓细胞移植1、2、4、8周后梗死区血管密度高于对照组，且随移植观察时间的延长，血管密度逐渐增加。同时，移植1、2、4、8周后移植组梗死局部注射区间质细胞bFGF表达明显高于对照组。移植4周后梗死心肌面积明显小于对照组。结论 骨髓细胞梗死心肌移植具有血管再生作用，对梗死心肌起到积极作用。
关键词 骨髓细胞 细胞移植 心肌梗死 血管再生
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)18-2661-03
The vascular regeneration by implantation of the bone marrow
, 百拇医药
cells into infarct myocardium
Lin Feng，Liao Chongxian，Ye Yunbin，et al.
Department of Cardiovascular Surgery，Union Hospital，Fujian Medical University，Fuzhou350001.
【Abstract】 Objective To study the vascular regeneration by implantation of the bone marrow cells into inˉfarction myocardium.Methods Bone marrow cells were implanted into the acute myocardial infarct site via topical inˉjection.Specimens were harvested at first，2nd，4th，8th week after implantation for vascular density examination and the expression of bFGF by immunohistochemical analysis and the infarct size was observed at4th week after implantaˉtion.Results At first，2nd，4th，8th week after transplantation，the vascular density in the bonemarrow cell implant group，was significantly higher respectively than that in the control group(P<0.01).At the same time，the expression of bFGF for the mesenchymal cell in topical injection site of infarct in the implanted group，was significantly higher reˉspectively than that in infarct site in the control group(P<0.01).The infarct size was significantly smaller in the bone marrow cell implant group than that in the control group at4th week after transplantation.Conclusion The bone marrow cells，after being implanted into the acute infarct myocardium，showed vascular regeneration and play a positive effect on infarct myocardium.
, 百拇医药
Key words bone marrow cell cell implantation myocardial infarction angioregeneration
骨髓细胞中有多种能分化为血细胞生成细胞和内皮祖细胞的未成熟细胞。实验表明骨髓细胞有分化成为内皮细胞的能力 [1] 。本研究以近亲繁殖的F 344 大鼠为研究对象，经局部心肌注射将骨髓细胞移植入急性心肌梗死区域，研究骨髓细胞心肌内移植对梗死区心肌血管再生作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 近亲繁殖的F 344 大鼠60只，体重250～300g，鼠龄8～10周，由广州中山医科大学实验动物中心提供。动物随机分为骨髓细胞移植组和对照组。层流架饲养，自由进食。术后观察1、2、4、8周。
1.2 骨髓细胞的提取、纯化、及标记 正常F 344 大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)全身麻醉，无菌切取髂骨、股骨、胫骨，用PBS液冲洗骨髓腔，骨髓置于PBS液中，经200目不锈钢网过滤。应用红细胞溶解法(加入0.14mol/L的三氯化铵缓冲剂)去除红细胞。离心，去除上清液，沉淀细胞团用PBS漂洗3次。移植前，用Fujioka [1] 描述的方法，应用CFSE标记骨髓细胞，用PBS液调整细胞浓度为1×10 7 /20μl，用于细胞移植。
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1.3 F 344 大鼠急性心肌梗死模型建立及骨髓细胞移植 大鼠经戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔内注射麻醉生效后，颈部正中线切开皮肤，显露气管，18-GA套管针穿刺插入气管，连接呼吸机进行机械辅助呼吸，潮气量约1ml/100g，频率80次/min。经腹腔注射利多卡因，以预防心律失常。经左胸第5肋间进入胸腔，暴露心脏，于左心耳外方见左冠状动脉前降支(LAD)走行，用7-0无损伤缝线于LAD根部(左心耳下方)阻断5min，再开放5min，重复二次进行缺血预调后完全结扎。结扎后左室前壁部分心肌即时变苍白。心肌梗死模型即告建立。于梗死心肌内前后缘上、中、下各三个点分别注射骨髓细胞1×10 7 /20μl，对照组予以相同量(20μl)含0.01%CFSE的PBS液注射。
1.4 梗死心肌组织内微血管计算 梗死区心肌石蜡包埋的组织切片采用CD34免疫组化染色。
CD34定位于内皮细胞胞浆，显示棕黄色或棕褐色，微血管计数参照Bosari [2] 等报道的方法。每份标本均选3个低倍视野(200×)、计数每个低倍视野的微血管数，取3个低倍视野微血管数为该份标本的平均微血管密度(MMVC)。
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1.5 心肌梗死面积测量 移植后4周，开胸取出心脏，剪除双侧心房，右心室，沿左心室长轴由心尖到心底部做2mm厚切片，共切5片。冲洗后，置于1%TTC溶液(以0.2Mtriso HCl，pH=7.8为缓冲液)中，37℃水浴箱中热浴15min后，显示存活的心肌染成红色，坏死心肌为白色。用TJTY-400型多媒体彩色病理图文分析系统进行图像分析，该系统自动测量出每层的心肌梗死面积占总面积的百分比。每层梗死心肌的容积=每层面积×厚度(2mm)，将5张切片中每层梗死心肌容积相加即为整个心肌的梗死面积(%)。
1.6 心肌梗死区bFGF检测 采用免疫组化染色法。bFGF阳性细胞内有棕色颗粒。应用CMIAS图像分析系统检测 梗死区细胞bFGF表达的灰度值。灰度值的高低与表达量成反比。
1.7 统计学处理 应用统计软件包SAS进行统计学处理。各观察指标采用平均值±标准差(ˉx±s)。组间差别采用t检验，P<0.05为差异有显著性。
, 百拇医药
2 结果
2.1 梗死区心肌微血管数量(血管密度)检测 各个时段移植组梗死区血管密度明显高于对照组，且随着移植观察时间的延长，血管密度逐渐增加(表1，图1、2)。
2.2 心肌梗死面积测量 骨髓细胞移植组后4周与4周对照组比较移植组的心肌梗死面积(25.55±2.38)明显小于对照组(40.71±2.83)(P<0.01)。见表2。
表1 骨髓细胞移植组与对照组梗死心肌血管密度比较 (ˉx±s)
注:与相应对照组比较 ˇ P<0.01，与1周实验组比较 Δ P<0.01;与2周实验组比较 ▲P<0.01，与1、2周对照组比较， # P<0.05，与1、2周对照组比较 ˇ P<0.01， ◇ P<0.05
2.3 心肌梗死区bFGF表达 如表3所示，除对照组2周外，其他时段对照组和移植组梗死区心肌细胞bFGF表达高于正常区域心肌细胞(P<0.05)。对照组间质细胞bFGF表达明显低于心肌细胞(P<0.05)，骨髓细胞移植组梗死局部注射区间质细胞bFGF表达明显增强，与对照组相应部分、正常区域心肌细胞、梗死区域心肌细胞比较差异有非常显著性(P<0.01)。
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两组各时段之间比较差异无显著性。
图1 图2
表2 骨髓细胞移植组和对照组心肌梗死面积的比较
注:Ai/A%=心肌梗死面积占心肌面积百分比，与对照组相比较 ˇ P<0.01
表3 骨髓细胞移植组与对照组bFGF表达(灰度值)比较
Δ 注:与相应时段心肌细胞比较 Δ P<0.05，与对照组间质细胞比较， ˇ P<0.01，与正常心肌细胞比较 ▲ P<0.05
3 讨论
血管形成或血管再生是指原有的血管又产生新的血管。生理条件下，成熟器官的血管内皮细胞处于静止的非增殖状态，很少发生血管再生。任何刺激血管壁的内皮细胞的增殖和迁移的因子都能促进血管形成的进行 [3] 。已知多种生长因子能产生血管形成。VEGF在血管形成过程及促进内皮细胞的增殖，迁移中起重要作用 [4] 。bFGF也是一种最为有效的促血管生成生长因子 [5] 。
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血管再生的过程包括:血管周围细胞(如巨噬细胞)释放蛋白酶(如胶原酶、纤溶酶原激活物等)使血管基底膜发生降解;血管内皮细胞、平滑肌细胞及外膜细胞被激活。在周围细胞释放的细胞因子及生长因子的作用下，内皮细胞迁移、粘连、增殖;内皮细胞重新聚积连接，形成新的管腔，血管平滑的基底膜上，最终形成新生的小血管。
最近的研究表明血管的形成是由内皮祖细胞发生而来 [6] 。我们选择骨髓细胞作为产生血管形成的材料是因为骨髓细胞含有内皮祖细胞，在严重缺血病变中能参与血管形成，它们也能分泌各种生长因子如bFGF。Hamano等将骨髓细胞植入角膜及海绵体后都观察到血管形成的现象 [7] 。本实验应用大鼠急性心肌梗死模型，将骨髓细胞植入梗死心肌区域，通过免疫组织化学方法检测CD34表达，据此计算梗死区内血管密度，结果表明骨髓细胞移植组梗死区血管密度明显高于对照组，且随着移植观察时间的延长，血管密度逐渐增加。我们的实验表明骨髓细胞在大鼠急性心肌梗死模型中能有效地促进血管形成，可能机制是缺血环境使骨髓细胞中的内皮祖细胞分化为内皮细胞，以及骨髓细胞分泌某些细 胞因子。骨髓细胞移植是一种导致血管形成的简单方法，和其他血管形成的治疗方法，如使用人类重组蛋白，裸露的DNA质粒和病毒相比较，它具有无毒性无免疫排斥的优点，而且骨髓细胞梗死心肌移植还具有心肌再生作用(另文报道)，这些都是其他血管形成的治疗方法所不具备的。
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骨髓细胞梗死心肌移植促进梗死区血管形成，增加心肌侧支循环，使心肌梗死面积缩小，促进恢复左心室功能的。
参考文献
1 Fujioka H，Hunt PJ，Rozga J，et al.Carboxyfluorescein(CFSE)labelling ofhepatocytes for short-term localization following intraportal transˉplantation.Cell Transplantation，1994，3:397-404.
2 Bosaris T，Lee AK，Dekellei RA，et al.Microvessel quantitation and prognosis in invasive breast carcinoma.N Engl J Med，1991，324:1-8.
, 百拇医药
3 Ferrara N，Davis-Smyth T.The biology of vascular endothelial growth factor.Endocrine Rev，1997，18:4-12.
4 Bikfalvi A，Klein S，Pintucci G，et al.Biology roles of fibroblast growth factor-2.Endocrine Rev，1997，18:26-29.
5 Bussolino F，Ziche M，Wang J，M，et al.In vitro and in vivo activation of endothelial cells by the stimulating factors.J Clin Invest，1991，87:986-991.
6 Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science，1997，275:964-967.
, http://www.100md.com
7 Hamano K，Li TS，Kobayashi T，et al.Angiogenesis induced by the imˉplantation of self-bone marrow cells:A new material for therapeutic angiogenesis.J surg Res，1999，88:145-151.
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(C0210015)
作者单位:350001福州福建医科大学附属协和医院心外科，福建省胸心外科研究所(病理科)
福建省肿瘤医院干细胞移植中心
(编辑曲 全), http://www.100md.com(林 峰 廖崇先 叶韵斌 陈道中 郑宇辉 黄雪珊)
关键词 骨髓细胞 细胞移植 心肌梗死 血管再生
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)18-2661-03
The vascular regeneration by implantation of the bone marrow
, 百拇医药
cells into infarct myocardium
Lin Feng，Liao Chongxian，Ye Yunbin，et al.
Department of Cardiovascular Surgery，Union Hospital，Fujian Medical University，Fuzhou350001.
【Abstract】 Objective To study the vascular regeneration by implantation of the bone marrow cells into inˉfarction myocardium.Methods Bone marrow cells were implanted into the acute myocardial infarct site via topical inˉjection.Specimens were harvested at first，2nd，4th，8th week after implantation for vascular density examination and the expression of bFGF by immunohistochemical analysis and the infarct size was observed at4th week after implantaˉtion.Results At first，2nd，4th，8th week after transplantation，the vascular density in the bonemarrow cell implant group，was significantly higher respectively than that in the control group(P<0.01).At the same time，the expression of bFGF for the mesenchymal cell in topical injection site of infarct in the implanted group，was significantly higher reˉspectively than that in infarct site in the control group(P<0.01).The infarct size was significantly smaller in the bone marrow cell implant group than that in the control group at4th week after transplantation.Conclusion The bone marrow cells，after being implanted into the acute infarct myocardium，showed vascular regeneration and play a positive effect on infarct myocardium.
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Key words bone marrow cell cell implantation myocardial infarction angioregeneration
骨髓细胞中有多种能分化为血细胞生成细胞和内皮祖细胞的未成熟细胞。实验表明骨髓细胞有分化成为内皮细胞的能力 [1] 。本研究以近亲繁殖的F 344 大鼠为研究对象，经局部心肌注射将骨髓细胞移植入急性心肌梗死区域，研究骨髓细胞心肌内移植对梗死区心肌血管再生作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 近亲繁殖的F 344 大鼠60只，体重250～300g，鼠龄8～10周，由广州中山医科大学实验动物中心提供。动物随机分为骨髓细胞移植组和对照组。层流架饲养，自由进食。术后观察1、2、4、8周。
1.2 骨髓细胞的提取、纯化、及标记 正常F 344 大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)全身麻醉，无菌切取髂骨、股骨、胫骨，用PBS液冲洗骨髓腔，骨髓置于PBS液中，经200目不锈钢网过滤。应用红细胞溶解法(加入0.14mol/L的三氯化铵缓冲剂)去除红细胞。离心，去除上清液，沉淀细胞团用PBS漂洗3次。移植前，用Fujioka [1] 描述的方法，应用CFSE标记骨髓细胞，用PBS液调整细胞浓度为1×10 7 /20μl，用于细胞移植。
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1.3 F 344 大鼠急性心肌梗死模型建立及骨髓细胞移植 大鼠经戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔内注射麻醉生效后，颈部正中线切开皮肤，显露气管，18-GA套管针穿刺插入气管，连接呼吸机进行机械辅助呼吸，潮气量约1ml/100g，频率80次/min。经腹腔注射利多卡因，以预防心律失常。经左胸第5肋间进入胸腔，暴露心脏，于左心耳外方见左冠状动脉前降支(LAD)走行，用7-0无损伤缝线于LAD根部(左心耳下方)阻断5min，再开放5min，重复二次进行缺血预调后完全结扎。结扎后左室前壁部分心肌即时变苍白。心肌梗死模型即告建立。于梗死心肌内前后缘上、中、下各三个点分别注射骨髓细胞1×10 7 /20μl，对照组予以相同量(20μl)含0.01%CFSE的PBS液注射。
1.4 梗死心肌组织内微血管计算 梗死区心肌石蜡包埋的组织切片采用CD34免疫组化染色。
CD34定位于内皮细胞胞浆，显示棕黄色或棕褐色，微血管计数参照Bosari [2] 等报道的方法。每份标本均选3个低倍视野(200×)、计数每个低倍视野的微血管数，取3个低倍视野微血管数为该份标本的平均微血管密度(MMVC)。
, http://www.100md.com
1.5 心肌梗死面积测量 移植后4周，开胸取出心脏，剪除双侧心房，右心室，沿左心室长轴由心尖到心底部做2mm厚切片，共切5片。冲洗后，置于1%TTC溶液(以0.2Mtriso HCl，pH=7.8为缓冲液)中，37℃水浴箱中热浴15min后，显示存活的心肌染成红色，坏死心肌为白色。用TJTY-400型多媒体彩色病理图文分析系统进行图像分析，该系统自动测量出每层的心肌梗死面积占总面积的百分比。每层梗死心肌的容积=每层面积×厚度(2mm)，将5张切片中每层梗死心肌容积相加即为整个心肌的梗死面积(%)。
1.6 心肌梗死区bFGF检测 采用免疫组化染色法。bFGF阳性细胞内有棕色颗粒。应用CMIAS图像分析系统检测 梗死区细胞bFGF表达的灰度值。灰度值的高低与表达量成反比。
1.7 统计学处理 应用统计软件包SAS进行统计学处理。各观察指标采用平均值±标准差(ˉx±s)。组间差别采用t检验，P<0.05为差异有显著性。
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2 结果
2.1 梗死区心肌微血管数量(血管密度)检测 各个时段移植组梗死区血管密度明显高于对照组，且随着移植观察时间的延长，血管密度逐渐增加(表1，图1、2)。
2.2 心肌梗死面积测量 骨髓细胞移植组后4周与4周对照组比较移植组的心肌梗死面积(25.55±2.38)明显小于对照组(40.71±2.83)(P<0.01)。见表2。
表1 骨髓细胞移植组与对照组梗死心肌血管密度比较 (ˉx±s)
注:与相应对照组比较 ˇ P<0.01，与1周实验组比较 Δ P<0.01;与2周实验组比较 ▲P<0.01，与1、2周对照组比较， # P<0.05，与1、2周对照组比较 ˇ P<0.01， ◇ P<0.05
2.3 心肌梗死区bFGF表达 如表3所示，除对照组2周外，其他时段对照组和移植组梗死区心肌细胞bFGF表达高于正常区域心肌细胞(P<0.05)。对照组间质细胞bFGF表达明显低于心肌细胞(P<0.05)，骨髓细胞移植组梗死局部注射区间质细胞bFGF表达明显增强，与对照组相应部分、正常区域心肌细胞、梗死区域心肌细胞比较差异有非常显著性(P<0.01)。
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两组各时段之间比较差异无显著性。
图1 图2
表2 骨髓细胞移植组和对照组心肌梗死面积的比较
注:Ai/A%=心肌梗死面积占心肌面积百分比，与对照组相比较 ˇ P<0.01
表3 骨髓细胞移植组与对照组bFGF表达(灰度值)比较
Δ 注:与相应时段心肌细胞比较 Δ P<0.05，与对照组间质细胞比较， ˇ P<0.01，与正常心肌细胞比较 ▲ P<0.05
3 讨论
血管形成或血管再生是指原有的血管又产生新的血管。生理条件下，成熟器官的血管内皮细胞处于静止的非增殖状态，很少发生血管再生。任何刺激血管壁的内皮细胞的增殖和迁移的因子都能促进血管形成的进行 [3] 。已知多种生长因子能产生血管形成。VEGF在血管形成过程及促进内皮细胞的增殖，迁移中起重要作用 [4] 。bFGF也是一种最为有效的促血管生成生长因子 [5] 。
, http://www.100md.com
血管再生的过程包括:血管周围细胞(如巨噬细胞)释放蛋白酶(如胶原酶、纤溶酶原激活物等)使血管基底膜发生降解;血管内皮细胞、平滑肌细胞及外膜细胞被激活。在周围细胞释放的细胞因子及生长因子的作用下，内皮细胞迁移、粘连、增殖;内皮细胞重新聚积连接，形成新的管腔，血管平滑的基底膜上，最终形成新生的小血管。
最近的研究表明血管的形成是由内皮祖细胞发生而来 [6] 。我们选择骨髓细胞作为产生血管形成的材料是因为骨髓细胞含有内皮祖细胞，在严重缺血病变中能参与血管形成，它们也能分泌各种生长因子如bFGF。Hamano等将骨髓细胞植入角膜及海绵体后都观察到血管形成的现象 [7] 。本实验应用大鼠急性心肌梗死模型，将骨髓细胞植入梗死心肌区域，通过免疫组织化学方法检测CD34表达，据此计算梗死区内血管密度，结果表明骨髓细胞移植组梗死区血管密度明显高于对照组，且随着移植观察时间的延长，血管密度逐渐增加。我们的实验表明骨髓细胞在大鼠急性心肌梗死模型中能有效地促进血管形成，可能机制是缺血环境使骨髓细胞中的内皮祖细胞分化为内皮细胞，以及骨髓细胞分泌某些细 胞因子。骨髓细胞移植是一种导致血管形成的简单方法，和其他血管形成的治疗方法，如使用人类重组蛋白，裸露的DNA质粒和病毒相比较，它具有无毒性无免疫排斥的优点，而且骨髓细胞梗死心肌移植还具有心肌再生作用(另文报道)，这些都是其他血管形成的治疗方法所不具备的。
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骨髓细胞梗死心肌移植促进梗死区血管形成，增加心肌侧支循环，使心肌梗死面积缩小，促进恢复左心室功能的。
参考文献
1 Fujioka H，Hunt PJ，Rozga J，et al.Carboxyfluorescein(CFSE)labelling ofhepatocytes for short-term localization following intraportal transˉplantation.Cell Transplantation，1994，3:397-404.
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4 Bikfalvi A，Klein S，Pintucci G，et al.Biology roles of fibroblast growth factor-2.Endocrine Rev，1997，18:26-29.
5 Bussolino F，Ziche M，Wang J，M，et al.In vitro and in vivo activation of endothelial cells by the stimulating factors.J Clin Invest，1991，87:986-991.
6 Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science，1997，275:964-967.
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7 Hamano K，Li TS，Kobayashi T，et al.Angiogenesis induced by the imˉplantation of self-bone marrow cells:A new material for therapeutic angiogenesis.J surg Res，1999，88:145-151.
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(C0210015)
作者单位:350001福州福建医科大学附属协和医院心外科，福建省胸心外科研究所(病理科)
福建省肿瘤医院干细胞移植中心
(编辑曲 全), http://www.100md.com(林 峰 廖崇先 叶韵斌 陈道中 郑宇辉 黄雪珊)