成人胰岛分离纯化的实验研究
http://www.100md.com
中华医学研究杂志 2003年4月 第3卷 第4期
【摘要】 目的 探讨如何从单一成人胰腺获得尽可能多的胰岛。方法 将胶原酶通过胰管注入胰腺后，采用新Riˉcordi胰岛自动化分离系统进行胰岛分离，以及不连续密度梯度法纯化成人供体胰岛。应用体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验检测胰岛功能。结果 纯化后平均获得17，5600±51，550个胰岛细胞，纯度为88.4±7.26%，回收率为84.73±8.02%，染色观察胰岛细胞形态完好。体外葡萄糖刺激胰岛素及C肽分泌实验，低浓度葡萄糖刺激下与高浓度葡萄糖刺激下相比胰岛素与C肽分泌量差异具有显著性(P=0.007与0.000)。证明纯化后的胰岛功能良好。结论 采用Ricordi胰岛自动化分离系统进行胰岛分离，以及不连续密度梯度法从成人尸体供体胰腺中进行胰岛分离纯化，可获得较多数量的胰岛，且形态功能完好，适用于临床移值。
关键词 成人胰岛 分离 纯化
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)04-0298-03
, http://www.100md.com
Laboratory research on human islet isolation and purification
Zhang Xin，Gang Juzhong，Guan Delin，et al.
Beijing Chaoyang Hosiptal，Beijing100020.
【Abstract】 Objective To study the method of obtaining as many islets as possible from a single donor.Methods Adult human pancreata were distended by injecting collegenase solution via pancreas duct.Then Ricordi automated isolation method was used to isolate islets and discontinuous density gradient method was used to purify the islets.In vitro glucose stimulating insulin secretion testwas used to test the function of the islets.Results 175，600±51，550islets were obtained after purification，the average purity was88.4%±7.26%，recovery rate was84.73%±8.02%，when stained and examined under microscope，islets were intact.When stimulated in vitro by glucose stimulatˉing insulin secretion test，there were significant differences in insulin and C-pep secretion(P=0.0007and0.000).Conclusion When Ricordi automated islets isolation method was used to isolate islets followed by discontinuous denˉsity gradient method to purify them，a large number of islets could be recovered which is higher than that reproted in China.And the islets were morphologically intact with good function，which were suitable for clinical transplantation.
, 百拇医药
Key words human islets isolation purification
成人胰腺纤维组织多，连接紧密，如何从成人胰腺中获得充足数量的用以临床移植的胰岛一直是影响胰岛移植的一大难题 [1] 。1988年Ricordi研制胰岛自动化分离技术以来，胰岛分离技术大大提高了 [2，3] 。结合密度梯度法纯化后可获得200，000个以上的胰岛，纯度可达80%～95%。近年来以成人胰腺作为供体来源，进行同种异体胰岛移植治疗胰岛素依赖型糖尿病以及自体胰岛移植预防外科手术后糖尿病的临床实践已经在世界的几个中心广泛开展，但在国内还是空白。研究中参照Ricordi胰岛自动化分离方法并加以改进进行成人胰岛分离，并利用不连续密度梯度法对分离后胰岛进行纯化，以及一系列组织形态学和功能检测以获得满足临床需要的、具有一定纯度、充足数量的功能良好的胰岛。为临床进行同种异体胰岛-肾联合移植打下良好基础。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验材料
1.1.1 主要试剂 (1)胶原酶(Serva公司);(2)RPMI1640培养基(Sigma公司);(3)Dithizone(Sigma公司);(4)Ficoll(Type400DL，F9378，Sigma公司);(5)Eurocollin;(6)UW液; (7)新生牛血清;(8)免疫荧光法胰岛素检测试剂盒(Beckˉman，U.S.A)
1.1.2 主要实验仪器 (1)本院改进的Ricordi胰岛自动化分离设备;(2)水浴箱;(3)低温离心机(Beckman);(4)外科手术器械;(5)不锈钢筛网;(6)一次性离心管;(7)Eppendorff管;(8)注射器(20ml，50ml)等。
1.2 胰腺来源 健康成人志愿者的胰腺，供体年龄24～40岁，男性体重(kg)>身高-100。
1.3 方法
, 百拇医药
1.3.1 胰腺获取 采用多器官联合灌注后摘取法，三层无菌塑料袋，第一层内含低温UW液(University of Wisconsin Solution)，胰腺放在其中，其余两层内置入冰盐水。
1.3.2 扩充胰腺 (1)剪去胰腺外周的脂肪、包膜。(2)切开胰腺颈部，插入导管于体尾部。(3)称重。(4)通过插管注入胶原酶溶液(3～5ml/g胰腺)。(5)去血管、脂肪组织。(6)切胰腺约1cm厚。
1.3.3 胰岛的分离 (1)将经过胰管注入胶原酶的扩充的胰腺放入不锈钢容器的下层腔室中。剩余的胶原酶也注入下层腔室。打开蠕动泵，将RPMI1640泵入不锈钢容器中，进行RPMI1640从不锈钢容器下层→→筛网→容器上层→恒温水浴箱→蠕动泵→盛放RPMI1640容器→不锈钢容器的往复循环。调节蠕动泵的转速，并缓慢摇动蠕动泵，使不锈钢容器内的温度每分钟上升1℃，达到37℃，并维持在这一温度。加大振动幅度。5min后，每隔2min取样观察，当看到大量的完整胰岛出现后立即进行收集并用大量4℃RPMI1640进行循环，加快蠕动泵流速，进一步加快振动频率，来终止消化。(2)250ml离心管中预先加入10ml新生牛血清。(3)收获组织于离心管中，离心，1000rpm，2min，未离心的组织也要放于冰块中保存。(4)弃去上清，将沉淀集中于装有50ml UW液的250ml离心管中。
, 百拇医药
1.3.4 胰岛的纯化 (1)把UW液加满50ml离心管，混匀。(2)4℃冰浴中放置60min。(3)离心，1000rpm，2min。(4)弃去上清。(5)沉淀组织混悬于密度1.121的EuroFicoll液体中。(6)依次加入密度1.108，1.096，1.037的EuroFicoll液体。(7)4℃，2500rpm，10min。(8)取出1.096与1.037之间的组织。(9)加入4℃RPMI1640液，4℃，1000rpm，2min。(10)加入4℃RPMI1640液40ml，混匀后取出50μl计数。(11)作台盼兰和中性红染色检测活性。
1.3.5 功能测定 (1)挑出50个胰岛，置于1ml Eppendorf离心管中。(2)加入1ml50mg/dl的葡萄糖溶液。(3)37℃水浴孵育30min。(4)离心，1000rpm，2min。(5)取出上清置于1ml Eppendorf离心管中。(6)加入1ml500mg/dl的葡萄糖溶液。(7)37℃水浴孵育30min。(8)离心，1000rpm，2min。(9)取出上清置于1ml Eppendorf离心管中。(10)将上述收获样品置于-20℃冰箱中，待测胰岛素。(11)放免试剂盒荧光法检测胰岛素含量。
, 百拇医药
2 结果
见表1～3，图1～4。
2.1 一般项目 本组10例供体均为男性，平均年龄29.6岁(24～40岁)，胰腺热缺血时间为7.16±2.72min，冷缺血时间为3.75±2.99h，胰腺重量为75.87±30.68g。
2.2 胰岛细胞的分离 随着分离系统的升温和反应的进行，胰岛细胞逐步与外分泌细胞分离，最终获得形态完好的胰岛细胞(图1)。分离后获得的胰岛细胞数为209，800±70，507个胰岛细胞。
表1 胰岛分离结果
2.3 分离后胰岛细胞的纯化 利用不连续密度梯度法纯化后，获得的胰岛细胞纯度为88.4%±7.26%，数量为175， 600±51，550，IEQ值为161，800±55，571。回收率为84.73%±8.02%，胰岛细胞形态完好(图2～4)。
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表2 胰岛纯化结果
2.4 胰岛的功能活性检测
2.4.1 形态学检测 Dithizone染色观察，胰岛细胞形态完好(图1，图2)。
2.4.2 体外葡萄糖刺激胰岛素及C肽分泌实验 见表3，结果表明，低浓度葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量6674.30±4434.02μIU/ml，高浓度葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量16371.10±11528.12μIU/ml，两者相比差异具有显著性(P=0.007)。低浓度葡萄糖刺激下C肽分泌量141.99±57.37ng/ml，高浓度葡萄糖刺激下C肽分泌量248.91±39.93ng/ml(P=0.000)。胰岛素分泌指数>2倍，证明纯化后的胰岛功能良好。
表3 体外葡萄糖刺激胰岛素及C肽分泌实验结果(略)
3 讨论
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糖尿病是严重影响人民健康和生命的常见病。国外于70年代中期起试用胰岛移植治疗1型糖尿病，以及胰岛-肾联合移植治疗糖尿病终末期肾病，已取得显著效果。国内亦于80年代初开始胚胎胰岛移植及大鼠胰岛微囊化移植研究，但由于胚胎胰岛发育不成熟，胰岛对葡萄糖刺激反应不够敏感，未能广泛应用于临床。成人胰岛来源广泛，发育成熟，国外多倾向于以成人胰岛作为移植物 [4，5]，在1965年Moskalewski第一次使用胶原酶从几内亚猪中分离胰岛以及1977年Najarian进行第一例人类胰岛移植至今 [6] ，人们进行了大量的成人胰岛分离纯化的实验研究，但由于成人胰腺纤维组织多，连接紧密，所以适用于啮齿类的普通胶原酶消化法以及适用于胎儿胰腺的孵育法都不适用于成人胰腺。如何从成人胰腺中获得充足数量的用以临床移植的胰岛一直是影响同种异体胰岛移植的一大问题。
自从1988年Ricordi研制了胰岛自动化分离技术以来，胰岛分离技术大大提高了。密度梯度离心纯化胰岛方法问世后，胰岛纯度可达80%～95%，国外一些研究中心已能从一个供体胰腺中分离出足够的胰岛移植给一个受体。目前国际上已有几个研究中心成功的进行胰岛移植工作:(1)自体胰岛移值，目的在于预防或减轻外科手术后糖尿病的发生;(2)同种异体胰岛-肾联合移植治疗糖尿病终末期肾病，目的在于改善糖尿病患者糖代谢内稳定平衡，延长移植肾存活期，提高移植患者生活质量。目前国内尚未广泛开展。我们采用改进的Ricordi胰岛自动化分离系统，进行成人供体胰岛细胞的分离及纯化研究，单个胰腺分离后获得209，800±70，507个胰岛细胞，这一数字高于文献报道的国内各种方法分离后获得的胰岛细胞。在我们的研究中发现，胰腺获取过程中所选用的不同灌注液对胰岛细胞的分离有重要影响，如果使用UW液灌注，需要适当提高胶原酶溶液的浓度，原因可能是因为UW液中所含的胶体成分对胶原酶有抑制作用。在分离过程中，正确判断消化时间尤 为重要，时间过短，胰岛与外分泌细胞不能有效分离，密度上两者难以区分，难以进行有效纯化(见图3);时间过长，会出现较多形态不规则和小的胰岛(见图4)，使胰岛功能受损。
, 百拇医药
胰岛纯化的方法较多，较为普遍使用的是密度梯度法 [7] 。我们使用Euro-Ficoll作为纯化试剂，选用1.121，1.096，1.085，1.037四种密度梯度，纯化后获得175，600±51，550个胰岛细胞。回收率为84.73±8.02%。纯化过程中纯化试剂对胰岛细胞有不同程度的毒性作用，因此应尽量减少细胞与纯化试剂的接触时间。近年来，有些中心采用Cobe2991离心机，使用连续密度梯度进行纯化，缩短了纯化时间，保护了胰岛细胞，从而改善了胰岛功能 [8] 。
纯化后胰岛细胞的功能测定有三种方法，即组织学染色观察、体外葡萄糖刺激胰岛素释放实验、糖尿病动物模型移植。其中体外葡萄糖刺激胰岛素释放实验包括静止孵育法与灌流法。在我们的实验中，纯化后胰岛细胞在50mg/dl葡萄糖刺激下胰岛素与C肽的分泌量分别是6674.30±4434.02μIU/ml与141.99±57.37ng/ml，500mg/dl葡萄糖刺激下胰岛素与C肽的分泌量分别是16371.10±11528.12μIU/ml与248.91±39.93ng/ml，两者相比差异具有显著性(P值分别为0.007与0.000)。
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染色观察胰岛形态完整，胰岛素释放指数>2，说明获得的胰岛细胞具有良好的功能活性，满足临床移植的需要。
研究结果表明，利用改进的Ricordi胰岛自动化分离方法进行成人胰岛分离，并利用不连续密度梯度法对分离后的胰岛进行纯化，以及一系列组织形态学和功能检测能获得满足临床需要的、具有一定纯度、充足数量的功能良好的胰岛。为临床进行同种异体胰岛-肾联合移植打下良好基础。(本文图片见封三)
参考文献
1 Shapiro AM，Ryan EA.Diabetes Islet cell transplantation.Lancet，2001，358，21.
2 Camillo Rcordi，Andreas G.Human islet isolation and allotransplantation in22consecutive cases.Transplantation，1992，53(2):407-414.
, 百拇医药
3 Camillo Ricordi，Benigno J.Human islet separation.Pancreatic islet transplantation，1994，1.
4 AM James Shapiro，Jonathan R T.Islet transplantation in seven patients with type1diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosupˉpressive regimen.N Engl J Med，1991，325:1371-1372.
5 Norman M，Kneteman，Jonathan R T，et al.Cadaver pancreas recovery technique，impact on islet recovery and in vitro function.Transplantaˉtion，1994，58，1114-1119.
, 百拇医药
6 Danial Brandhorst，Heide Brandhorst，Bernhard J.Islet isolation from the pancreas of large mammals and humans:10Years of Experience.Exp Clin Endocrinol，1995，103:3-14.
7 Camillo Ricordi，Benigno J.Islet purification.Pancreatic islet transplanˉtation，1994，11:88-92.
8 H L R Rilo，J Phipps.Comparison of human islet number and viability obtained during purification on Euro-Collims-Ficoll gradients proˉcessed on a refrigerated or nonrefrigerated Cobe2991cell separator.Transplantation Proceedings，1999，26(6):3431-3433.
作者单位:100020北京朝阳医院泌尿外科
(收稿日期:2002-09-17)
(编辑小 川), 百拇医药(张鑫)
关键词 成人胰岛 分离 纯化
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)04-0298-03
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Laboratory research on human islet isolation and purification
Zhang Xin，Gang Juzhong，Guan Delin，et al.
Beijing Chaoyang Hosiptal，Beijing100020.
【Abstract】 Objective To study the method of obtaining as many islets as possible from a single donor.Methods Adult human pancreata were distended by injecting collegenase solution via pancreas duct.Then Ricordi automated isolation method was used to isolate islets and discontinuous density gradient method was used to purify the islets.In vitro glucose stimulating insulin secretion testwas used to test the function of the islets.Results 175，600±51，550islets were obtained after purification，the average purity was88.4%±7.26%，recovery rate was84.73%±8.02%，when stained and examined under microscope，islets were intact.When stimulated in vitro by glucose stimulatˉing insulin secretion test，there were significant differences in insulin and C-pep secretion(P=0.0007and0.000).Conclusion When Ricordi automated islets isolation method was used to isolate islets followed by discontinuous denˉsity gradient method to purify them，a large number of islets could be recovered which is higher than that reproted in China.And the islets were morphologically intact with good function，which were suitable for clinical transplantation.
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Key words human islets isolation purification
成人胰腺纤维组织多，连接紧密，如何从成人胰腺中获得充足数量的用以临床移植的胰岛一直是影响胰岛移植的一大难题 [1] 。1988年Ricordi研制胰岛自动化分离技术以来，胰岛分离技术大大提高了 [2，3] 。结合密度梯度法纯化后可获得200，000个以上的胰岛，纯度可达80%～95%。近年来以成人胰腺作为供体来源，进行同种异体胰岛移植治疗胰岛素依赖型糖尿病以及自体胰岛移植预防外科手术后糖尿病的临床实践已经在世界的几个中心广泛开展，但在国内还是空白。研究中参照Ricordi胰岛自动化分离方法并加以改进进行成人胰岛分离，并利用不连续密度梯度法对分离后胰岛进行纯化，以及一系列组织形态学和功能检测以获得满足临床需要的、具有一定纯度、充足数量的功能良好的胰岛。为临床进行同种异体胰岛-肾联合移植打下良好基础。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验材料
1.1.1 主要试剂 (1)胶原酶(Serva公司);(2)RPMI1640培养基(Sigma公司);(3)Dithizone(Sigma公司);(4)Ficoll(Type400DL，F9378，Sigma公司);(5)Eurocollin;(6)UW液; (7)新生牛血清;(8)免疫荧光法胰岛素检测试剂盒(Beckˉman，U.S.A)
1.1.2 主要实验仪器 (1)本院改进的Ricordi胰岛自动化分离设备;(2)水浴箱;(3)低温离心机(Beckman);(4)外科手术器械;(5)不锈钢筛网;(6)一次性离心管;(7)Eppendorff管;(8)注射器(20ml，50ml)等。
1.2 胰腺来源 健康成人志愿者的胰腺，供体年龄24～40岁，男性体重(kg)>身高-100。
1.3 方法
, 百拇医药
1.3.1 胰腺获取 采用多器官联合灌注后摘取法，三层无菌塑料袋，第一层内含低温UW液(University of Wisconsin Solution)，胰腺放在其中，其余两层内置入冰盐水。
1.3.2 扩充胰腺 (1)剪去胰腺外周的脂肪、包膜。(2)切开胰腺颈部，插入导管于体尾部。(3)称重。(4)通过插管注入胶原酶溶液(3～5ml/g胰腺)。(5)去血管、脂肪组织。(6)切胰腺约1cm厚。
1.3.3 胰岛的分离 (1)将经过胰管注入胶原酶的扩充的胰腺放入不锈钢容器的下层腔室中。剩余的胶原酶也注入下层腔室。打开蠕动泵，将RPMI1640泵入不锈钢容器中，进行RPMI1640从不锈钢容器下层→→筛网→容器上层→恒温水浴箱→蠕动泵→盛放RPMI1640容器→不锈钢容器的往复循环。调节蠕动泵的转速，并缓慢摇动蠕动泵，使不锈钢容器内的温度每分钟上升1℃，达到37℃，并维持在这一温度。加大振动幅度。5min后，每隔2min取样观察，当看到大量的完整胰岛出现后立即进行收集并用大量4℃RPMI1640进行循环，加快蠕动泵流速，进一步加快振动频率，来终止消化。(2)250ml离心管中预先加入10ml新生牛血清。(3)收获组织于离心管中，离心，1000rpm，2min，未离心的组织也要放于冰块中保存。(4)弃去上清，将沉淀集中于装有50ml UW液的250ml离心管中。
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1.3.4 胰岛的纯化 (1)把UW液加满50ml离心管，混匀。(2)4℃冰浴中放置60min。(3)离心，1000rpm，2min。(4)弃去上清。(5)沉淀组织混悬于密度1.121的EuroFicoll液体中。(6)依次加入密度1.108，1.096，1.037的EuroFicoll液体。(7)4℃，2500rpm，10min。(8)取出1.096与1.037之间的组织。(9)加入4℃RPMI1640液，4℃，1000rpm，2min。(10)加入4℃RPMI1640液40ml，混匀后取出50μl计数。(11)作台盼兰和中性红染色检测活性。
1.3.5 功能测定 (1)挑出50个胰岛，置于1ml Eppendorf离心管中。(2)加入1ml50mg/dl的葡萄糖溶液。(3)37℃水浴孵育30min。(4)离心，1000rpm，2min。(5)取出上清置于1ml Eppendorf离心管中。(6)加入1ml500mg/dl的葡萄糖溶液。(7)37℃水浴孵育30min。(8)离心，1000rpm，2min。(9)取出上清置于1ml Eppendorf离心管中。(10)将上述收获样品置于-20℃冰箱中，待测胰岛素。(11)放免试剂盒荧光法检测胰岛素含量。
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2 结果
见表1～3，图1～4。
2.1 一般项目 本组10例供体均为男性，平均年龄29.6岁(24～40岁)，胰腺热缺血时间为7.16±2.72min，冷缺血时间为3.75±2.99h，胰腺重量为75.87±30.68g。
2.2 胰岛细胞的分离 随着分离系统的升温和反应的进行，胰岛细胞逐步与外分泌细胞分离，最终获得形态完好的胰岛细胞(图1)。分离后获得的胰岛细胞数为209，800±70，507个胰岛细胞。
表1 胰岛分离结果
2.3 分离后胰岛细胞的纯化 利用不连续密度梯度法纯化后，获得的胰岛细胞纯度为88.4%±7.26%，数量为175， 600±51，550，IEQ值为161，800±55，571。回收率为84.73%±8.02%，胰岛细胞形态完好(图2～4)。
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表2 胰岛纯化结果
2.4 胰岛的功能活性检测
2.4.1 形态学检测 Dithizone染色观察，胰岛细胞形态完好(图1，图2)。
2.4.2 体外葡萄糖刺激胰岛素及C肽分泌实验 见表3，结果表明，低浓度葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量6674.30±4434.02μIU/ml，高浓度葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量16371.10±11528.12μIU/ml，两者相比差异具有显著性(P=0.007)。低浓度葡萄糖刺激下C肽分泌量141.99±57.37ng/ml，高浓度葡萄糖刺激下C肽分泌量248.91±39.93ng/ml(P=0.000)。胰岛素分泌指数>2倍，证明纯化后的胰岛功能良好。
表3 体外葡萄糖刺激胰岛素及C肽分泌实验结果(略)
3 讨论
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糖尿病是严重影响人民健康和生命的常见病。国外于70年代中期起试用胰岛移植治疗1型糖尿病，以及胰岛-肾联合移植治疗糖尿病终末期肾病，已取得显著效果。国内亦于80年代初开始胚胎胰岛移植及大鼠胰岛微囊化移植研究，但由于胚胎胰岛发育不成熟，胰岛对葡萄糖刺激反应不够敏感，未能广泛应用于临床。成人胰岛来源广泛，发育成熟，国外多倾向于以成人胰岛作为移植物 [4，5]，在1965年Moskalewski第一次使用胶原酶从几内亚猪中分离胰岛以及1977年Najarian进行第一例人类胰岛移植至今 [6] ，人们进行了大量的成人胰岛分离纯化的实验研究，但由于成人胰腺纤维组织多，连接紧密，所以适用于啮齿类的普通胶原酶消化法以及适用于胎儿胰腺的孵育法都不适用于成人胰腺。如何从成人胰腺中获得充足数量的用以临床移植的胰岛一直是影响同种异体胰岛移植的一大问题。
自从1988年Ricordi研制了胰岛自动化分离技术以来，胰岛分离技术大大提高了。密度梯度离心纯化胰岛方法问世后，胰岛纯度可达80%～95%，国外一些研究中心已能从一个供体胰腺中分离出足够的胰岛移植给一个受体。目前国际上已有几个研究中心成功的进行胰岛移植工作:(1)自体胰岛移值，目的在于预防或减轻外科手术后糖尿病的发生;(2)同种异体胰岛-肾联合移植治疗糖尿病终末期肾病，目的在于改善糖尿病患者糖代谢内稳定平衡，延长移植肾存活期，提高移植患者生活质量。目前国内尚未广泛开展。我们采用改进的Ricordi胰岛自动化分离系统，进行成人供体胰岛细胞的分离及纯化研究，单个胰腺分离后获得209，800±70，507个胰岛细胞，这一数字高于文献报道的国内各种方法分离后获得的胰岛细胞。在我们的研究中发现，胰腺获取过程中所选用的不同灌注液对胰岛细胞的分离有重要影响，如果使用UW液灌注，需要适当提高胶原酶溶液的浓度，原因可能是因为UW液中所含的胶体成分对胶原酶有抑制作用。在分离过程中，正确判断消化时间尤 为重要，时间过短，胰岛与外分泌细胞不能有效分离，密度上两者难以区分，难以进行有效纯化(见图3);时间过长，会出现较多形态不规则和小的胰岛(见图4)，使胰岛功能受损。
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胰岛纯化的方法较多，较为普遍使用的是密度梯度法 [7] 。我们使用Euro-Ficoll作为纯化试剂，选用1.121，1.096，1.085，1.037四种密度梯度，纯化后获得175，600±51，550个胰岛细胞。回收率为84.73±8.02%。纯化过程中纯化试剂对胰岛细胞有不同程度的毒性作用，因此应尽量减少细胞与纯化试剂的接触时间。近年来，有些中心采用Cobe2991离心机，使用连续密度梯度进行纯化，缩短了纯化时间，保护了胰岛细胞，从而改善了胰岛功能 [8] 。
纯化后胰岛细胞的功能测定有三种方法，即组织学染色观察、体外葡萄糖刺激胰岛素释放实验、糖尿病动物模型移植。其中体外葡萄糖刺激胰岛素释放实验包括静止孵育法与灌流法。在我们的实验中，纯化后胰岛细胞在50mg/dl葡萄糖刺激下胰岛素与C肽的分泌量分别是6674.30±4434.02μIU/ml与141.99±57.37ng/ml，500mg/dl葡萄糖刺激下胰岛素与C肽的分泌量分别是16371.10±11528.12μIU/ml与248.91±39.93ng/ml，两者相比差异具有显著性(P值分别为0.007与0.000)。
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染色观察胰岛形态完整，胰岛素释放指数>2，说明获得的胰岛细胞具有良好的功能活性，满足临床移植的需要。
研究结果表明，利用改进的Ricordi胰岛自动化分离方法进行成人胰岛分离，并利用不连续密度梯度法对分离后的胰岛进行纯化，以及一系列组织形态学和功能检测能获得满足临床需要的、具有一定纯度、充足数量的功能良好的胰岛。为临床进行同种异体胰岛-肾联合移植打下良好基础。(本文图片见封三)
参考文献
1 Shapiro AM，Ryan EA.Diabetes Islet cell transplantation.Lancet，2001，358，21.
2 Camillo Rcordi，Andreas G.Human islet isolation and allotransplantation in22consecutive cases.Transplantation，1992，53(2):407-414.
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3 Camillo Ricordi，Benigno J.Human islet separation.Pancreatic islet transplantation，1994，1.
4 AM James Shapiro，Jonathan R T.Islet transplantation in seven patients with type1diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosupˉpressive regimen.N Engl J Med，1991，325:1371-1372.
5 Norman M，Kneteman，Jonathan R T，et al.Cadaver pancreas recovery technique，impact on islet recovery and in vitro function.Transplantaˉtion，1994，58，1114-1119.
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6 Danial Brandhorst，Heide Brandhorst，Bernhard J.Islet isolation from the pancreas of large mammals and humans:10Years of Experience.Exp Clin Endocrinol，1995，103:3-14.
7 Camillo Ricordi，Benigno J.Islet purification.Pancreatic islet transplanˉtation，1994，11:88-92.
8 H L R Rilo，J Phipps.Comparison of human islet number and viability obtained during purification on Euro-Collims-Ficoll gradients proˉcessed on a refrigerated or nonrefrigerated Cobe2991cell separator.Transplantation Proceedings，1999，26(6):3431-3433.
作者单位:100020北京朝阳医院泌尿外科
(收稿日期:2002-09-17)
(编辑小 川), 百拇医药(张鑫)