TRAIL诱导凋亡的途径及其在肉瘤治疗中的研究进展
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)06-0526-03
TRAIL是TNF家族的成员，是近年来发现的凋亡分子之一。它能选择性杀伤肿瘤细胞而对大多数正常细胞没有明显毒性，因此在肿瘤治疗中有巨大的潜力。本文就TRAIL及其受体的结构和功能、凋亡诱导途径以及TRAIL在肉瘤治疗中的研究进展作一综述。
凋亡(apoptosis)是一种细胞自杀机制，它可以使复细胞动物在组织中控制细胞数量并清除威胁到动物生存的个别细胞。这种细胞表面拥有特殊传感器，称死亡受体(death receptor，DR)。死亡受体与其相应的配体结合，能够检测到死亡信号，从而快速启动细胞内的凋亡装置 [1] 。目前已知的配体/受体系统主要有三个:FasL/Fas、TNF/TNFR及TRAIL/TRAILR。其中TRAIL/TRAILR是近年颇受瞩目的一种凋亡诱导系统。
1 TRAIL及其受体
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1.1 TRAIL分子 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)，或称凋亡素2配体(Apo2ligand，Apo2L)是肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor，TNF)家族的成员。1995年Wiley [2] 等搜索了与TNF家族同源的EST(expressed sequence tag)，首次发现并克隆了这个具有开放阅读框架的全长cDNA(1769bp)。TRAIL基因定位于3号染色体长臂2区6带(3q26)，与其他已知的TNF家族成员不相邻。人TRAIL由281个氨基酸组成，分子量32.5kD，等电点7.63。它是一种Ⅱ型膜蛋白，其胞外C端区域与FasL和TNFα的同源性分别为28%及23%，它们有相似的受体识别和触发(triggering)机制。TRAIL还有寡聚化的倾向，可形成二聚体和三聚体，并通过与细胞表面的受体特异性结合而发挥作用，其最显著的特征就是能够选择性杀伤肿瘤细胞而对大多数正常细胞没有明显毒性。
1.2 TRAIL受体 由于TRAIL是TNF配体家族的成员并具有明显诱导凋亡的能力。因此，人们最初假设TRAIL是与包含死亡域(death domain，DD)的TNFR(TNF receptor)相互结合而发挥作用的。死亡域是在死亡受体中发现的一个约含60～80个氨基酸的胞内区，它是传递死亡信号必不可少的结构。但出乎人们的意料，TRAIL并不与当时已知的TNˉFR1、Fas(factor associated suicide)及DR3(death receptor3)相连接 [1，3] 。这说明TRAIL可能与TNFR家族未知的其他成员相互作用。为了寻找这种未知成员，人们搜索了与TNFR同源的EST数据库并于1997年定义了第一个TRAIL受体—DR4，或称TRAILR1/Apo2 [4] ，可是发现这个受体所产生的一系列问题远比它所能解决的要多。因为自从1995年TRAIL被发现之时，人们就一直在研究为什么肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡如此敏感，而正常组织却几乎没有反应。最初，有人认为这是由于肿瘤细胞表达TRAILR而正常细胞则缺乏这种受体，但是在对正常和肿瘤细胞进行检测时却发现它们都表达相似量的DR4，所以人们只好继续搜索数据库来寻找其它的TRAILR。同年，Ashkenazi’s [5] 和Dixit’s [6] 两组研究人员都提取了另一种TRAILR序列—DR5，亦称TRAILR2或TRICK2(TRAIL receptor induce of cell killing2)。但令人沮丧的是，DR5在正常和肿瘤细胞中亦都有表达。很快，研究者们又发现了两种TRAIL受体—DCR1(death decoy receptor1)和DCR2(death decoyreceptor2)。DCR1包含TRAIL细胞外连接区以及一段能将受体锚定于细胞膜上的氨基酸，但缺乏可以激活细胞死亡通路的胞内区域，即死亡域 [6，7] 。DCR2也能与TRAIL相连接，可是它的死亡域不完整，呈截断(Truncated)状态，又称TRUNDD(TRAIL Receptor with a truncated death domain) [8，9] 。此外，TRAIL还有一种特殊的受体—护骨素(0steoprotegerin，0PG)。它是一种分泌蛋白 [10] 。
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DR4，DR5，DCR1，DCR2基因都聚集于染色体8P21-22处 [11，12] ，这证明它们可能有共同的祖先。其中DR4和DR5都包含功能性死亡域，能传递凋亡信号，并诱导细胞发生凋亡[4～6，12～14] 。而DCR1和DCR2由于缺乏死亡域或死亡域不完整，不能诱导凋亡发生，所以被称为“诱骗”受体(decoy receptor) [5～9，15] 。0PG可与TRAIL连接，并通过干扰TRAIL与死亡受体的结合来抑制凋亡 [10] 。
2 TRAIL与细胞凋亡
凋亡，或称程序性细胞死亡，它能通过激活细胞内部自杀程序而清除机体不需要的细胞，是多细胞生物生长和维持稳态的重要环节。细胞凋亡功能抑制将导致一些人类疾病的发生，包括肿瘤，神经变性性疾病及获得性免疫缺陷综合征等 [16，17] 。TNF配体家族的某些细胞因子及其同源受体相结合，可启动凋亡程序。已知TNFR1及Fas是细胞凋亡的经典触发器 [17～19] 。TRAIL与FasL相似，可在不同来源的转化细胞系中快速诱导凋亡。但与FasL主要表达于免疫细胞不同，TRAIL在人体许多正常组织中都可检测到，包括脾、肺、前列腺等 [2] 。这证明通常情况下，TRAIL对人体组织不应有毒性。
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2.1 TRAIL诱导凋亡的途径 TRAIL诱导凋亡的途径还没有完全清楚。目前大多数人认为TRAIL是通过活化细胞内的FADD-caspase途径而引发细胞发生凋亡的 [20] 。FADD(Fas-associated death domain)是共区的细胞内转接器，能被死亡受体所募集以启动凋亡装置 [3，21，22] 。TRAIL的死亡受体与FADD都具有传递凋亡信号所必需的死亡域。因此，死亡受体可与具有相同结构的转接器分子结合，启动casˉpase级联反应，并最终导致凋亡。
但是，对于TRAIL依靠FADD传递凋亡信号的说法仍然存在争议。在一些研究中，发现FADD与DR4和DR5相关，缺乏FADD会抑制TRAIL诱导的凋亡 [13，23] 。而且，FADD缺陷的Jurkat细胞对TRAIL诱导的凋亡不敏感 [20，24] 。但在另一些研究中，则有相反的结果。他们发现缺乏FADD不会抑制TRAIL诱导的凋亡 [4，6] ，来自FADD缺陷大鼠的细胞仍然对TRAIL敏感 [25] 。因此可以推测FADD可能只是在某些肿瘤中发挥作用。
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FADD除具有死亡域外，还有另一个特征性的结构-死亡效应域(death effector domain，DED)，DED共存于caspase-8、caspase-9等分子中。Caspase，即半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteiny1aspartate specific protease)，又称ICE(Interleukin-1β-converting enzyme)，它广泛存在于细胞中，主要以前酶形式合成，是在凋亡过程中必不可少的酶类。Caspase家族成员之间能够相互作用，在上游分子，主要是caspase-8(也称FLICE，FADD-like，ICE protease)的作用下释放活化片段，以级联激活的方式活化至下游的分子，如caspase-3，后者的底物是一种DNAse，能够引起染色体的降解，细胞凋亡 [26～31] 。
2.2 TRAIL选择性杀伤肿瘤细胞的机制 TRAIL可诱导多种转化细胞和细胞发生凋亡，但对大多数正常组织却没有毒性。这种特性使TRAIL成为肿瘤治疗中一种很有前途的药物。但其机制如何，却仍不清楚。目前比较流行的说法有两种:一是诱骗受体的保护作用，二是FLIP(FLICE-inˉhibitory protein)的抑制作用。
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诱骗受体DCR1和DCR2能与TRAIL结合，但不能传递凋亡信号，因此认为正常细胞可能是由于诱骗受体与DR4和DR5竞争性结合TRAIL而使其免遭TRAIL的杀伤作用 [1，32] 。但最近人们却发现在许多情况下TRAIL受体的表达模式与TRAIL介导的凋亡之间并无关联 [33～35]。有的研究者发现经TRAIL治疗后，TRAIL的死亡和诱骗受体有不同的亚细胞位点并在细胞内进行重新分布 [36，37] ，这证明存在其他机制决定了细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。
在TRAIL诱导凋亡的过程中可能还有前凋亡(pro-apoptotic)和抗凋亡(anti-apoptotic)因子的作用。Griffith等 [38] 发现对TRAIL不敏感的黑色素瘤表达了相对高水平的凋亡抑制因子—FLIP，这是一种能阻断caspase-8和caspase-10前凋亡活性的细胞内蛋白。而在对TRAIL敏感的细胞系中，FLIP的表达水平则很低或缺失。目前许多研究显示高水平的FLIP能抑制TRAIL诱导的凋亡并与细胞对TRAIL的易感性密切相关 [20，38～39] 。但是也是相反的结果 [33，40] 。
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此外，还有一些其他的机制可能参与了保护正常细胞免遭TRAIL的杀伤作用，例如凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptoˉsis，IAP)及核转录因子NF-KB(nuclear factor-Kappa B)等。
3 TRAIL在肉瘤治疗中的研究进展
肉瘤是间叶组织来源的恶性肿瘤，它具有发病年龄早、恶性度高的特点。目前对于各种肉瘤的治疗主要依赖于手术、化疗和放疗相结合的方案。但即使进行大剂量的化疗和放疗，瘤细胞也不一定会被杀死。因此尽管人们在研究肉瘤的治疗方面有了很大进展，但其5年生存率依然非常低。此外，瘤细胞对化疗药物的敏感性差以及化疗药物毒性的非特异性也一直是困扰临床医生的主要问题。TRAIL的发现似乎给人们带来了新的希望。因为TRAIL可以选择性杀伤瘤细胞而无明显的系统毒性，因此人们认为TRAIL将成为治疗肿瘤的一种很有潜力的药物。体内和体外的各种试验也相继证实了这种推测。Petak等 [41] 研究了对Fas诱导的凋亡不敏感的七个横纹肌肉瘤细胞系，发现其中大部分都对TRAIL高度敏感。在对尤文氏肉瘤的研究中也有 类似的结果，TRAIL在大部分(80%～90%)的尤文氏肉瘤来源的细胞系中都可诱导细胞发生凋亡 [33，42～44] 。Clayer等 [45] 联合应用TRAIL与化疗药物使凋亡的纤维肉瘤细胞显著增加。最近，Evdokiou等[46] 又发现化疗药物可以增强骨肉瘤细胞对TRAIL的敏感性。这可能是由于在两个信号传导通路间(死亡受体和细胞毒性药物通路)存在一定水平的交叉反应。治疗肿瘤前用TRAIL预处理将增强瘤细胞对化疗药物的敏感性，反之亦然。
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此外，在大约所有肿瘤的一半以上，肿瘤细胞产生耐药性都是部分的源于P53抑癌基因的突变。P53的关键作用是当DNA被药物或X线损伤后，它能够激活细胞内在的自杀程序，突变P53则丧失了这种作用。而由于TRAIL能够不依赖P53而发挥其诱导凋亡的作用 [47] ，因此它在肿瘤的治疗中的作用受到了广泛的关注。
然而，最近人们却对应用TRAIL治疗肿瘤产生了新的忧虑。因为有人发现TRAIL与正常人肝细胞共同培养时，能够诱导肝细胞发生凋亡 [48] 。这提示我们若将TRAIL作为临床试验的系统药物可能会产生肝脏毒性。因此，目前的资料显示要将TRAIL应用于肿瘤的治疗必须十分小心，需要等待进一步的研究结果。
4 结语
关于肉瘤的治疗一直没有理想的药物。TRAIL具有选择性杀伤瘤细胞的特性，因此是一种颇有潜力的治疗药物。但是TRAIL也可能引起损伤性的系统毒性(如对肝细胞的毒性)，因此在临床试验中的应用一定要非常小心。虽然如此，但若能想办法调整TRAIL诱导凋亡的过程，使其靶向攻击瘤细胞则可达到治疗的目的，而这些都需要对TRAIL作进一步的深入的研究。
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(收稿日期:2003-03-02) (编辑 何蓓), 百拇医药(孙洁)
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1.1 TRAIL分子 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)，或称凋亡素2配体(Apo2ligand，Apo2L)是肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor，TNF)家族的成员。1995年Wiley [2] 等搜索了与TNF家族同源的EST(expressed sequence tag)，首次发现并克隆了这个具有开放阅读框架的全长cDNA(1769bp)。TRAIL基因定位于3号染色体长臂2区6带(3q26)，与其他已知的TNF家族成员不相邻。人TRAIL由281个氨基酸组成，分子量32.5kD，等电点7.63。它是一种Ⅱ型膜蛋白，其胞外C端区域与FasL和TNFα的同源性分别为28%及23%，它们有相似的受体识别和触发(triggering)机制。TRAIL还有寡聚化的倾向，可形成二聚体和三聚体，并通过与细胞表面的受体特异性结合而发挥作用，其最显著的特征就是能够选择性杀伤肿瘤细胞而对大多数正常细胞没有明显毒性。
1.2 TRAIL受体 由于TRAIL是TNF配体家族的成员并具有明显诱导凋亡的能力。因此，人们最初假设TRAIL是与包含死亡域(death domain，DD)的TNFR(TNF receptor)相互结合而发挥作用的。死亡域是在死亡受体中发现的一个约含60～80个氨基酸的胞内区，它是传递死亡信号必不可少的结构。但出乎人们的意料，TRAIL并不与当时已知的TNˉFR1、Fas(factor associated suicide)及DR3(death receptor3)相连接 [1，3] 。这说明TRAIL可能与TNFR家族未知的其他成员相互作用。为了寻找这种未知成员，人们搜索了与TNFR同源的EST数据库并于1997年定义了第一个TRAIL受体—DR4，或称TRAILR1/Apo2 [4] ，可是发现这个受体所产生的一系列问题远比它所能解决的要多。因为自从1995年TRAIL被发现之时，人们就一直在研究为什么肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡如此敏感，而正常组织却几乎没有反应。最初，有人认为这是由于肿瘤细胞表达TRAILR而正常细胞则缺乏这种受体，但是在对正常和肿瘤细胞进行检测时却发现它们都表达相似量的DR4，所以人们只好继续搜索数据库来寻找其它的TRAILR。同年，Ashkenazi’s [5] 和Dixit’s [6] 两组研究人员都提取了另一种TRAILR序列—DR5，亦称TRAILR2或TRICK2(TRAIL receptor induce of cell killing2)。但令人沮丧的是，DR5在正常和肿瘤细胞中亦都有表达。很快，研究者们又发现了两种TRAIL受体—DCR1(death decoy receptor1)和DCR2(death decoyreceptor2)。DCR1包含TRAIL细胞外连接区以及一段能将受体锚定于细胞膜上的氨基酸，但缺乏可以激活细胞死亡通路的胞内区域，即死亡域 [6，7] 。DCR2也能与TRAIL相连接，可是它的死亡域不完整，呈截断(Truncated)状态，又称TRUNDD(TRAIL Receptor with a truncated death domain) [8，9] 。此外，TRAIL还有一种特殊的受体—护骨素(0steoprotegerin，0PG)。它是一种分泌蛋白 [10] 。
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DR4，DR5，DCR1，DCR2基因都聚集于染色体8P21-22处 [11，12] ，这证明它们可能有共同的祖先。其中DR4和DR5都包含功能性死亡域，能传递凋亡信号，并诱导细胞发生凋亡[4～6，12～14] 。而DCR1和DCR2由于缺乏死亡域或死亡域不完整，不能诱导凋亡发生，所以被称为“诱骗”受体(decoy receptor) [5～9，15] 。0PG可与TRAIL连接，并通过干扰TRAIL与死亡受体的结合来抑制凋亡 [10] 。
2 TRAIL与细胞凋亡
凋亡，或称程序性细胞死亡，它能通过激活细胞内部自杀程序而清除机体不需要的细胞，是多细胞生物生长和维持稳态的重要环节。细胞凋亡功能抑制将导致一些人类疾病的发生，包括肿瘤，神经变性性疾病及获得性免疫缺陷综合征等 [16，17] 。TNF配体家族的某些细胞因子及其同源受体相结合，可启动凋亡程序。已知TNFR1及Fas是细胞凋亡的经典触发器 [17～19] 。TRAIL与FasL相似，可在不同来源的转化细胞系中快速诱导凋亡。但与FasL主要表达于免疫细胞不同，TRAIL在人体许多正常组织中都可检测到，包括脾、肺、前列腺等 [2] 。这证明通常情况下，TRAIL对人体组织不应有毒性。
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2.1 TRAIL诱导凋亡的途径 TRAIL诱导凋亡的途径还没有完全清楚。目前大多数人认为TRAIL是通过活化细胞内的FADD-caspase途径而引发细胞发生凋亡的 [20] 。FADD(Fas-associated death domain)是共区的细胞内转接器，能被死亡受体所募集以启动凋亡装置 [3，21，22] 。TRAIL的死亡受体与FADD都具有传递凋亡信号所必需的死亡域。因此，死亡受体可与具有相同结构的转接器分子结合，启动casˉpase级联反应，并最终导致凋亡。
但是，对于TRAIL依靠FADD传递凋亡信号的说法仍然存在争议。在一些研究中，发现FADD与DR4和DR5相关，缺乏FADD会抑制TRAIL诱导的凋亡 [13，23] 。而且，FADD缺陷的Jurkat细胞对TRAIL诱导的凋亡不敏感 [20，24] 。但在另一些研究中，则有相反的结果。他们发现缺乏FADD不会抑制TRAIL诱导的凋亡 [4，6] ，来自FADD缺陷大鼠的细胞仍然对TRAIL敏感 [25] 。因此可以推测FADD可能只是在某些肿瘤中发挥作用。
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FADD除具有死亡域外，还有另一个特征性的结构-死亡效应域(death effector domain，DED)，DED共存于caspase-8、caspase-9等分子中。Caspase，即半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteiny1aspartate specific protease)，又称ICE(Interleukin-1β-converting enzyme)，它广泛存在于细胞中，主要以前酶形式合成，是在凋亡过程中必不可少的酶类。Caspase家族成员之间能够相互作用，在上游分子，主要是caspase-8(也称FLICE，FADD-like，ICE protease)的作用下释放活化片段，以级联激活的方式活化至下游的分子，如caspase-3，后者的底物是一种DNAse，能够引起染色体的降解，细胞凋亡 [26～31] 。
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诱骗受体DCR1和DCR2能与TRAIL结合，但不能传递凋亡信号，因此认为正常细胞可能是由于诱骗受体与DR4和DR5竞争性结合TRAIL而使其免遭TRAIL的杀伤作用 [1，32] 。但最近人们却发现在许多情况下TRAIL受体的表达模式与TRAIL介导的凋亡之间并无关联 [33～35]。有的研究者发现经TRAIL治疗后，TRAIL的死亡和诱骗受体有不同的亚细胞位点并在细胞内进行重新分布 [36，37] ，这证明存在其他机制决定了细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。
在TRAIL诱导凋亡的过程中可能还有前凋亡(pro-apoptotic)和抗凋亡(anti-apoptotic)因子的作用。Griffith等 [38] 发现对TRAIL不敏感的黑色素瘤表达了相对高水平的凋亡抑制因子—FLIP，这是一种能阻断caspase-8和caspase-10前凋亡活性的细胞内蛋白。而在对TRAIL敏感的细胞系中，FLIP的表达水平则很低或缺失。目前许多研究显示高水平的FLIP能抑制TRAIL诱导的凋亡并与细胞对TRAIL的易感性密切相关 [20，38～39] 。但是也是相反的结果 [33，40] 。
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此外，还有一些其他的机制可能参与了保护正常细胞免遭TRAIL的杀伤作用，例如凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptoˉsis，IAP)及核转录因子NF-KB(nuclear factor-Kappa B)等。
3 TRAIL在肉瘤治疗中的研究进展
肉瘤是间叶组织来源的恶性肿瘤，它具有发病年龄早、恶性度高的特点。目前对于各种肉瘤的治疗主要依赖于手术、化疗和放疗相结合的方案。但即使进行大剂量的化疗和放疗，瘤细胞也不一定会被杀死。因此尽管人们在研究肉瘤的治疗方面有了很大进展，但其5年生存率依然非常低。此外，瘤细胞对化疗药物的敏感性差以及化疗药物毒性的非特异性也一直是困扰临床医生的主要问题。TRAIL的发现似乎给人们带来了新的希望。因为TRAIL可以选择性杀伤瘤细胞而无明显的系统毒性，因此人们认为TRAIL将成为治疗肿瘤的一种很有潜力的药物。体内和体外的各种试验也相继证实了这种推测。Petak等 [41] 研究了对Fas诱导的凋亡不敏感的七个横纹肌肉瘤细胞系，发现其中大部分都对TRAIL高度敏感。在对尤文氏肉瘤的研究中也有 类似的结果，TRAIL在大部分(80%～90%)的尤文氏肉瘤来源的细胞系中都可诱导细胞发生凋亡 [33，42～44] 。Clayer等 [45] 联合应用TRAIL与化疗药物使凋亡的纤维肉瘤细胞显著增加。最近，Evdokiou等[46] 又发现化疗药物可以增强骨肉瘤细胞对TRAIL的敏感性。这可能是由于在两个信号传导通路间(死亡受体和细胞毒性药物通路)存在一定水平的交叉反应。治疗肿瘤前用TRAIL预处理将增强瘤细胞对化疗药物的敏感性，反之亦然。
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此外，在大约所有肿瘤的一半以上，肿瘤细胞产生耐药性都是部分的源于P53抑癌基因的突变。P53的关键作用是当DNA被药物或X线损伤后，它能够激活细胞内在的自杀程序，突变P53则丧失了这种作用。而由于TRAIL能够不依赖P53而发挥其诱导凋亡的作用 [47] ，因此它在肿瘤的治疗中的作用受到了广泛的关注。
然而，最近人们却对应用TRAIL治疗肿瘤产生了新的忧虑。因为有人发现TRAIL与正常人肝细胞共同培养时，能够诱导肝细胞发生凋亡 [48] 。这提示我们若将TRAIL作为临床试验的系统药物可能会产生肝脏毒性。因此，目前的资料显示要将TRAIL应用于肿瘤的治疗必须十分小心，需要等待进一步的研究结果。
4 结语
关于肉瘤的治疗一直没有理想的药物。TRAIL具有选择性杀伤瘤细胞的特性，因此是一种颇有潜力的治疗药物。但是TRAIL也可能引起损伤性的系统毒性(如对肝细胞的毒性)，因此在临床试验中的应用一定要非常小心。虽然如此，但若能想办法调整TRAIL诱导凋亡的过程，使其靶向攻击瘤细胞则可达到治疗的目的，而这些都需要对TRAIL作进一步的深入的研究。
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(收稿日期:2003-03-02) (编辑 何蓓), 百拇医药(孙洁)