流式细胞术检测白血病细胞过氧化物酶及其临床应用
【文献标识码】 B 【文章编号】 1680-077X(2003)03-0246-02
过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)是一种定位于中性粒细胞嗜苯氨蓝颗粒及细胞膜上的含铁血红素样物质 [1] ，其检测常应用于急性白血病类型的鉴别，常用的检测MPO方法是细胞化学染色法(过氧化物酶法)。近几年，随着单克隆及标记技术的发展，出现了流式细胞术(Flow Cytomeˉtry，FCM)检测MPO新技术，本文用FCM检测白血病的MPO并与细胞化学染色法进行对比，评价FCM检测MPO在白血病诊断中的意义。
1 材料和方法
1.1 对象 1999～2002年期间进入本院进行骨髓检查确诊为急性白血病病人，共52例，年龄7～76岁。其中:急性淋巴细胞白血病(ALL)14例，急性髓细胞白血病(AML)35例(M 1 型2例，M 2 型8例，M 3 型4例，M 4 型14例，M 5 型6例，M 6 型1例)，急性双表型白血病3例。
, 百拇医药
1.2 试剂 过氧化氢、联苯胺为上海试剂厂产品，穿透液、CD 45 PC 5 抗体及MPO为Couter-Immunotech公司产品。
1.3 仪器 FACSVantage流式细胞仪为BD公司产品。
1.4 细胞化学染色法 按全国检验操作规程(第二版) [2] 进行，结果判断采用双盲法，阳性细胞数超过3%判为阳性结果。
1.5 FCM样本处理 将骨髓或外周血样品、固定液及CD 45 PC 5 抗体各100μl混合，室温避光孵育5min，PBS洗涤2次，离心，吸去上清液;加100μl穿透液，室温避光孵育5min，加100μl MPO抗体，室温避光孵育15min;PBS洗涤2次，离心，吸去上清液，加200μl IPBS，待上机检测。
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1.6 FCM上机检测 FACSVantage流式细胞仪氩离子激光器，激光波长488nm，在CD 45 PC 5 对侧向散射光(SSC)散点图中，用门(gate)圈出特定细胞群体，分析MPO标志物的表达量，收集测定细胞2000个，表达量超过10%为阳性结果。
2 结果
2.1 两种方法检测白血病患者的MPO结果 14例ALL患者的标本，细胞化学染色和FCM检测结果均为阴性。35例AML患者的标本，细胞化学染色结果为30例阳性，阳性率85.7%，FCM检测结果33例阳性，阳性率94.3%。3例急性双表型白血病患者的标本，细胞化学染色结果2例为阳性，FCM检测结果均阳性。见表1。
表1 两种方法检测白血病患者的MPO结果略
2.2 两种方法检测52例白血病患者的MPO结果比较 52 例急性白血病患者的标本，经细胞化学染色和FCM二种方法检测MPO，阳性率分别为61.5%和69.2%，二者阳性符合率差异无显著性(X 2 =2.25，X 20.05.1 =3.84，P>0.05)，见表2。
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表2 两种方法检测MPO的阳性符合率比较略
3 讨论
CD 45 为人类共同的白细胞抗原标记之一，它的表达与 否及强弱高低，与细胞的成熟程度有关，原始和幼稚细胞在向成熟阶段分化过程中，CD 45 表达的荧光强度递增。流式细胞仪利用其特有的SSC和CD 45 两个参数可鉴别至少4个细胞群体:淋巴细胞群体、单核细胞群体、粒细胞群体、原始或幼稚细胞群体;流式细胞仪还可任意圈出其中一个群体进行细胞的免疫表达分析，因此可对骨髓或外周血中特定的细胞群体(所要求的)的MPO表达量进行检测。细胞化学法是用光学显微镜观察结果，在未用瑞氏染料复染时，由于细胞结构模糊，对于特定细胞的辨认，则存在一定的难度，可出现错误，而用瑞氏染料复染，由于MPO是定位于细胞膜和细胞浆颗粒中，当细胞浆中颗粒较细或较少时(显色弱时)，紫色易掩盖MPO显色，造成假阴性，而且在区分MPO呈色强度记分时，也会出现难度。
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由于MPO在淋巴细胞中不表达，而在粒细胞和单核细胞中表达或弱表达，使其在白血病的FAB分型中对急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病的鉴定/分型具有很大的意义，在一般的淋系和髓系细胞群体鉴别时，细胞化学法MPO阳性表达细胞超过3%，则定为髓系细胞，反之，则为淋巴系细胞 [3] 。我们的结果表明:细胞化学法呈阳性的病例数与FCM检测结果差异无显著性。2例M 1 型及2例M 5 型患者的标本细胞化学法结果为阴性，可能是因为髓系低分化细胞群体(原始粒细胞及单核细胞)浆中的颗粒较细，在光学显微镜下观察呈色不明显，被确定为阴性。3例急性双表型白血病中细胞化学法呈阴性1例，其形态学表现为ALL，抗原标志物主要与ALL相关，部分与AML相关，因此浆中颗粒较少且较细，而被定为阴性。对于1例M 6 ，患者处于红血期，红细胞极度增生，阳性比例相对降低，细胞化学法观察的例数有限，因此被判定为阴性，但FCM检测的细胞数多，因此结果呈阳性，并且与形态学和免疫学诊断相符。在特异性方面，FCM检测ALL的结果与细胞化学法完全一致(14例均为阴性)，本文曾多次用FCM法检测淋巴系细胞，未发现假阳性，这与Musto等报道 [4，5] 相符。
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在骨髓形态学诊断中，对核/浆比例较大、染色质情况辨别困难的低分化原始细胞，由于细胞化学检测MPO呈阴性，难以分型，结果只能定为急性原始细胞型白血病，FCM的应用提高了MPO检测的阳性率，从而可能解决这个困扰我们多年的问题;同时也表明不仅髓细胞白血病MPO呈阳性，而且双表型白血病MPO表达也呈阳性。在急性白血病的分型诊断中，如果形态学不典型，应进一步寻找其他诊断/分型依据，特别是采用FCM法检测细胞标志，如MPO。
参考文献
1 Lanza F.Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency.J Mol Med，1998，76:676-681.
2 叶应抚，王毓三.全国检验操作规程，第二版.南京:东南大学出版社，1998，75-76.
3 Bennett JM，Catovsky D，Daniel MT，et al.Proposals for the classification of acute leukaemias.Br J Haematol，1976，33:451-458.
, 百拇医药
4 Musto P，Cascavilla N，Melillo L，et al.Clinical usefulness of immunocyˉtochemical detection of myeloperoxidase in undifferentiated and bipheˉnotypic acute leukemias.Haematologica，1991，76:434-436.
5 Buccheri V，Shetty V，Yoshida R，et al.The role and antimyeloperoxˉidase antibody in the diagnosis and classification of acute leukaemia.Br J Haematol，1992，80:62-68.
作者单位:1 528000广东省佛山市第二人民医院
2 广东省广州市第一人民医院
(收稿日期:2002-11-17)
(编辑 梅燕), 百拇医药(张小青)
过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)是一种定位于中性粒细胞嗜苯氨蓝颗粒及细胞膜上的含铁血红素样物质 [1] ，其检测常应用于急性白血病类型的鉴别，常用的检测MPO方法是细胞化学染色法(过氧化物酶法)。近几年，随着单克隆及标记技术的发展，出现了流式细胞术(Flow Cytomeˉtry，FCM)检测MPO新技术，本文用FCM检测白血病的MPO并与细胞化学染色法进行对比，评价FCM检测MPO在白血病诊断中的意义。
1 材料和方法
1.1 对象 1999～2002年期间进入本院进行骨髓检查确诊为急性白血病病人，共52例，年龄7～76岁。其中:急性淋巴细胞白血病(ALL)14例，急性髓细胞白血病(AML)35例(M 1 型2例，M 2 型8例，M 3 型4例，M 4 型14例，M 5 型6例，M 6 型1例)，急性双表型白血病3例。
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1.2 试剂 过氧化氢、联苯胺为上海试剂厂产品，穿透液、CD 45 PC 5 抗体及MPO为Couter-Immunotech公司产品。
1.3 仪器 FACSVantage流式细胞仪为BD公司产品。
1.4 细胞化学染色法 按全国检验操作规程(第二版) [2] 进行，结果判断采用双盲法，阳性细胞数超过3%判为阳性结果。
1.5 FCM样本处理 将骨髓或外周血样品、固定液及CD 45 PC 5 抗体各100μl混合，室温避光孵育5min，PBS洗涤2次，离心，吸去上清液;加100μl穿透液，室温避光孵育5min，加100μl MPO抗体，室温避光孵育15min;PBS洗涤2次，离心，吸去上清液，加200μl IPBS，待上机检测。
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1.6 FCM上机检测 FACSVantage流式细胞仪氩离子激光器，激光波长488nm，在CD 45 PC 5 对侧向散射光(SSC)散点图中，用门(gate)圈出特定细胞群体，分析MPO标志物的表达量，收集测定细胞2000个，表达量超过10%为阳性结果。
2 结果
2.1 两种方法检测白血病患者的MPO结果 14例ALL患者的标本，细胞化学染色和FCM检测结果均为阴性。35例AML患者的标本，细胞化学染色结果为30例阳性，阳性率85.7%，FCM检测结果33例阳性，阳性率94.3%。3例急性双表型白血病患者的标本，细胞化学染色结果2例为阳性，FCM检测结果均阳性。见表1。
表1 两种方法检测白血病患者的MPO结果略
2.2 两种方法检测52例白血病患者的MPO结果比较 52 例急性白血病患者的标本，经细胞化学染色和FCM二种方法检测MPO，阳性率分别为61.5%和69.2%，二者阳性符合率差异无显著性(X 2 =2.25，X 20.05.1 =3.84，P>0.05)，见表2。
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表2 两种方法检测MPO的阳性符合率比较略
3 讨论
CD 45 为人类共同的白细胞抗原标记之一，它的表达与 否及强弱高低，与细胞的成熟程度有关，原始和幼稚细胞在向成熟阶段分化过程中，CD 45 表达的荧光强度递增。流式细胞仪利用其特有的SSC和CD 45 两个参数可鉴别至少4个细胞群体:淋巴细胞群体、单核细胞群体、粒细胞群体、原始或幼稚细胞群体;流式细胞仪还可任意圈出其中一个群体进行细胞的免疫表达分析，因此可对骨髓或外周血中特定的细胞群体(所要求的)的MPO表达量进行检测。细胞化学法是用光学显微镜观察结果，在未用瑞氏染料复染时，由于细胞结构模糊，对于特定细胞的辨认，则存在一定的难度，可出现错误，而用瑞氏染料复染，由于MPO是定位于细胞膜和细胞浆颗粒中，当细胞浆中颗粒较细或较少时(显色弱时)，紫色易掩盖MPO显色，造成假阴性，而且在区分MPO呈色强度记分时，也会出现难度。
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由于MPO在淋巴细胞中不表达，而在粒细胞和单核细胞中表达或弱表达，使其在白血病的FAB分型中对急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病的鉴定/分型具有很大的意义，在一般的淋系和髓系细胞群体鉴别时，细胞化学法MPO阳性表达细胞超过3%，则定为髓系细胞，反之，则为淋巴系细胞 [3] 。我们的结果表明:细胞化学法呈阳性的病例数与FCM检测结果差异无显著性。2例M 1 型及2例M 5 型患者的标本细胞化学法结果为阴性，可能是因为髓系低分化细胞群体(原始粒细胞及单核细胞)浆中的颗粒较细，在光学显微镜下观察呈色不明显，被确定为阴性。3例急性双表型白血病中细胞化学法呈阴性1例，其形态学表现为ALL，抗原标志物主要与ALL相关，部分与AML相关，因此浆中颗粒较少且较细，而被定为阴性。对于1例M 6 ，患者处于红血期，红细胞极度增生，阳性比例相对降低，细胞化学法观察的例数有限，因此被判定为阴性，但FCM检测的细胞数多，因此结果呈阳性，并且与形态学和免疫学诊断相符。在特异性方面，FCM检测ALL的结果与细胞化学法完全一致(14例均为阴性)，本文曾多次用FCM法检测淋巴系细胞，未发现假阳性，这与Musto等报道 [4，5] 相符。
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在骨髓形态学诊断中，对核/浆比例较大、染色质情况辨别困难的低分化原始细胞，由于细胞化学检测MPO呈阴性，难以分型，结果只能定为急性原始细胞型白血病，FCM的应用提高了MPO检测的阳性率，从而可能解决这个困扰我们多年的问题;同时也表明不仅髓细胞白血病MPO呈阳性，而且双表型白血病MPO表达也呈阳性。在急性白血病的分型诊断中，如果形态学不典型，应进一步寻找其他诊断/分型依据，特别是采用FCM法检测细胞标志，如MPO。
参考文献
1 Lanza F.Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency.J Mol Med，1998，76:676-681.
2 叶应抚，王毓三.全国检验操作规程，第二版.南京:东南大学出版社，1998，75-76.
3 Bennett JM，Catovsky D，Daniel MT，et al.Proposals for the classification of acute leukaemias.Br J Haematol，1976，33:451-458.
, 百拇医药
4 Musto P，Cascavilla N，Melillo L，et al.Clinical usefulness of immunocyˉtochemical detection of myeloperoxidase in undifferentiated and bipheˉnotypic acute leukemias.Haematologica，1991，76:434-436.
5 Buccheri V，Shetty V，Yoshida R，et al.The role and antimyeloperoxˉidase antibody in the diagnosis and classification of acute leukaemia.Br J Haematol，1992，80:62-68.
作者单位:1 528000广东省佛山市第二人民医院
2 广东省广州市第一人民医院
(收稿日期:2002-11-17)
(编辑 梅燕), 百拇医药(张小青)