恶性肿瘤患者自体CIK细胞免疫治疗后生物学活性测定
【摘要】 目的 探讨恶性肿瘤患者细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)治疗前后单个核细胞(PBMC)的NK活性。方法 cs-3000采集患者外周血，用淋巴细胞分离液分离患者末梢血单个核细胞(PBMC)，用含有IFN-γ、IL-2和CD3单抗的培养液进行培养扩增，于培养的第十一天和第十二天回输给病人，并检测CIK细胞治疗前后患者的外周血单个核细胞的NK活性。比较治疗前后的疗效参数。结果 肿瘤患者输注CIK细胞一疗程后，其PBMC的NK杀伤活性由61%升高到83%，平均升高22%(P<0.01)。结论 用自身CIK细胞过继性回输治疗能明显提高肿瘤患者PBMC杀伤癌细胞的生物活性。
关键词 肿瘤 过继性 免疫治疗 细胞因子诱导的杀伤细胞 NK活性
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)07-0607-02
Immunotherapy used with antologous cytokine-induced killer
, 百拇医药
cells for malignant tumor and the biological activities determination
Yang Kun，Nie Jun，Hua Xiangfeng
Liaoning Provincial People’s Hospital，Shenyang110016.
【Abstract】 Objective Cytokine-induced killer(CIK)cells have the characte
ristics of rapid proliferation，high efficiency and broad specturm in killing of
tumor cells.However，there was few report about its clinical application on treatment for cancer patients.The objective of this paper is to study the effect of
, 百拇医药
adoptive immunotherapy with CIk cells on the tumor in vivo and in vitro.Methods
Peripheral blood mononucelar cells in the patients with advanced malignant tumor were separated by fractionation on Ficoll-Hypaque gradient then cultured in the medium containing IFN-γ，IL-2，and CD3MCAb，the CIk cells were transfused to back to the patients after11days and12days.The nature killing CIK cells and peripheral blood mononuclear cells of patients were examined by comparing the effective parameters.Results After one course treatment，NK activities of PBMC rose from61%to83%，average rose22%(P<0.01).Conclusion It can advance tumors patient’sbiological activities of PBMC and cellular immue function by transfusion of autologous CIK cells and improve the patients without side effects.
, 百拇医药
Key words tumor adoptive immunotherapy cytokine-induced killer cells NK activities
CIK细胞(cytokine-induced killer)是人外周血单个核细胞经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞。因兼具T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤活性等特点，是一代抗肿瘤细胞生物治疗的首选方案 [1] 。本文旨在探讨CIK细胞免疫治疗、生物学活性及CIK细胞治疗前后患者的外周血单个核细胞的NK活性的变化。
1 资料与方法
1.1 一般资料 我们选择18例病人，男12例，女6例，年龄23～62岁，中位年龄47岁;18例中，乳腺癌5例，结肠癌6例，肺癌4例，肝癌3例。
1.2 方法 CIK细胞的制备:cs-3000单采外周血单个核细胞(PBMC)，PBS洗涤3次后，将细胞置于10%AB血清的RPMI1640中，细胞浓度为1×10 6 /ml，第一天培养加入IFN-γ1000U/ml，24h后加入抗CD3单抗100ng/ml，人重组IL-12α100U/ml，人重组IL-2300U/ml，每3天更换培养液补加IL-2，浓度同前。培养11～12天后，台盼蓝计数，回收CIK细胞回输给病人，并给予小剂量IL-2。
, http://www.100md.com
1.3 肿瘤患者(CIK)治疗前后PBMC的NK活性测定 18 例恶性肿瘤患者均为病理证实的术后住院病人。18例患 者均在CIK培养的第十一天和第十二天回输CIK细胞，为1个疗程。患者于CIK开始输注前一天和输注最后一次当天分别采集静脉血5ml注入含肝素的无菌试管中，常规分离出单个核细胞1×10 7 /ml作为效应细胞备用。K562细胞系作为靶细胞培养于10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，选生长良好的细胞，调细胞浓度为1×10 6 /ml。外周血单个核细胞的NK活性检测法参照孙卫民的方法 [2] :具体方法为取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml K562细胞悬液，在37℃5%CO 2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24h。每孔加0.1ml效应细胞悬液，效靶比10:1，继续培养4h，让效应细胞发挥杀伤效应。实验中设立只有靶细胞的无杀伤对照和只有效应细胞的阴性对照，每种处理设3个复孔。4h后用含2%小牛血清的RPMI1640培养液洗涤各孔3次。每孔加0.1ml含2%小牛血清的RPMI1640培养液和10μl5ml/ml的MTT染液，继续培养3h后，用PBS洗涤2次，每孔加0.1ml含0.04mol/L HCl的异丙醇，室温30min，溶解形成结晶。在570nm波长处，用酶联检测仪检测各孔的光吸收值(OD)。杀伤活性(%)=(OD实验孔-OD阴性对照)/OD无杀伤对照×100。
, 百拇医药
1.4 正常人PBMC的NK活性测定 从血站得到正常人血18份按上述方法测正常人PBMC的NK活性。
1.5 统计学方法 实验结果以ˉx±s表示，用t检验比较各组间均数差异的显著性。
2 结果
2.1 正常人PBMC的NK杀伤活性 平均为86%。
2.2 肿瘤患者(CIK)治疗前后PBMC的NK活性测定 18 例肿瘤患者一个疗程CIK细胞治疗前后PBMC的NK活性见表1。
表1 肿瘤患者CIK细胞治疗前后自身PBMC的NK活性比较 (略)
表中显示18例肿瘤患者中14例患者CIK细胞治疗前的自身PBMC的NK活性在70%以下，平均NK活性(61%)明显低于正常人(86%，P<0.01)，一疗程CIK细胞治疗后，自身PBMC的NK活性都有不同程度升高，平均NK活性(83%)，升高程度22%(P<0.01)。
, 百拇医药
2.3 其他相关检测结果 经CIK细胞治疗后6例CEA增高的患者5例降低，3例AFP增高的患者2例降低。
2.4 临床一般情况 输注CIK过程中仅1例病人出现寒战、高热，对症治疗后体温很快恢复，未见其他副作用。99%的病人，食欲增加，睡眠改善，体力增强。
3 讨论
T淋巴细胞是细胞免疫的主要效应细胞。机体的免疫调节是通过T淋巴细胞亚群(TLS)实现的，NK细胞是机体抗肿瘤防御功能的主要免疫细胞，具有广谱的杀伤肿瘤细胞功能[3，4] 。因此，TLS和NK细胞的测定是目前国际上公认的评价机体抗肿瘤免疫的重要指标 [5] 。大量的研究资料表明恶性肿瘤患者存在不同程度的免疫机能受损CD3 + 、CD4 +、CD8 + 和NK细胞活性降低。我们用自身CIK细胞过继性输注治疗18例肿瘤患者。结果显示:大大提高了患者PBMC的NK活性。患者经过一疗程CIK细胞治疗后PBMC的NK活性从治疗前的61%升高到83%，平均升高22%(P<0.01)。以上数据说明CIK细胞输注治疗后能有效地提高其机体的对肿瘤细胞的杀伤能力。
, 百拇医药
总之，CIK细胞用于临床治疗病人，安全性好，副作用极少，能有效地提高肿瘤患者机体杀伤肿瘤细胞的能力。
参考文献
1 于津浦，任秀宝，张澎，等.恶性实体瘤患者自体CK细胞的体外大量扩增与生物学指标检测.中国肿瘤生物治疗杂志，2001，8(3):215-216.
2 孙卫民，王慧琴.细胞因子研究方法学.北京:人民卫生出版社，2000，108-109.
3 Finke J，Frrone S，Fuey A，et al.where have all the T cells gone?Mechanisms of immune evasion by trmors.Immune Today，1999，20(4):158-160.
4 Lowdess Mw，Lafmb L，Hoyle C，et al.Non-MHC-restricted cytotoxic cells:Their roles in the control and treatment of leukaemias.Brj of Haem，2001，114:11-24.
5 Margolin KA，Negrin RS，Forman SJ，et al.cellular immunotherapy and autologus transplantation for hematologic malignancy.Immunol Rev，1997，157:231-240.
作者单位:110016辽宁省人民医院中心实验室
(收稿日期:2003-03-09)
(编辑 于少伟), 百拇医药(杨琨 聂军 花向峰)
关键词 肿瘤 过继性 免疫治疗 细胞因子诱导的杀伤细胞 NK活性
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)07-0607-02
Immunotherapy used with antologous cytokine-induced killer
, 百拇医药
cells for malignant tumor and the biological activities determination
Yang Kun，Nie Jun，Hua Xiangfeng
Liaoning Provincial People’s Hospital，Shenyang110016.
【Abstract】 Objective Cytokine-induced killer(CIK)cells have the characte
ristics of rapid proliferation，high efficiency and broad specturm in killing of
tumor cells.However，there was few report about its clinical application on treatment for cancer patients.The objective of this paper is to study the effect of
, 百拇医药
adoptive immunotherapy with CIk cells on the tumor in vivo and in vitro.Methods
Peripheral blood mononucelar cells in the patients with advanced malignant tumor were separated by fractionation on Ficoll-Hypaque gradient then cultured in the medium containing IFN-γ，IL-2，and CD3MCAb，the CIk cells were transfused to back to the patients after11days and12days.The nature killing CIK cells and peripheral blood mononuclear cells of patients were examined by comparing the effective parameters.Results After one course treatment，NK activities of PBMC rose from61%to83%，average rose22%(P<0.01).Conclusion It can advance tumors patient’sbiological activities of PBMC and cellular immue function by transfusion of autologous CIK cells and improve the patients without side effects.
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Key words tumor adoptive immunotherapy cytokine-induced killer cells NK activities
CIK细胞(cytokine-induced killer)是人外周血单个核细胞经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞。因兼具T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤活性等特点，是一代抗肿瘤细胞生物治疗的首选方案 [1] 。本文旨在探讨CIK细胞免疫治疗、生物学活性及CIK细胞治疗前后患者的外周血单个核细胞的NK活性的变化。
1 资料与方法
1.1 一般资料 我们选择18例病人，男12例，女6例，年龄23～62岁，中位年龄47岁;18例中，乳腺癌5例，结肠癌6例，肺癌4例，肝癌3例。
1.2 方法 CIK细胞的制备:cs-3000单采外周血单个核细胞(PBMC)，PBS洗涤3次后，将细胞置于10%AB血清的RPMI1640中，细胞浓度为1×10 6 /ml，第一天培养加入IFN-γ1000U/ml，24h后加入抗CD3单抗100ng/ml，人重组IL-12α100U/ml，人重组IL-2300U/ml，每3天更换培养液补加IL-2，浓度同前。培养11～12天后，台盼蓝计数，回收CIK细胞回输给病人，并给予小剂量IL-2。
, http://www.100md.com
1.3 肿瘤患者(CIK)治疗前后PBMC的NK活性测定 18 例恶性肿瘤患者均为病理证实的术后住院病人。18例患 者均在CIK培养的第十一天和第十二天回输CIK细胞，为1个疗程。患者于CIK开始输注前一天和输注最后一次当天分别采集静脉血5ml注入含肝素的无菌试管中，常规分离出单个核细胞1×10 7 /ml作为效应细胞备用。K562细胞系作为靶细胞培养于10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，选生长良好的细胞，调细胞浓度为1×10 6 /ml。外周血单个核细胞的NK活性检测法参照孙卫民的方法 [2] :具体方法为取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml K562细胞悬液，在37℃5%CO 2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24h。每孔加0.1ml效应细胞悬液，效靶比10:1，继续培养4h，让效应细胞发挥杀伤效应。实验中设立只有靶细胞的无杀伤对照和只有效应细胞的阴性对照，每种处理设3个复孔。4h后用含2%小牛血清的RPMI1640培养液洗涤各孔3次。每孔加0.1ml含2%小牛血清的RPMI1640培养液和10μl5ml/ml的MTT染液，继续培养3h后，用PBS洗涤2次，每孔加0.1ml含0.04mol/L HCl的异丙醇，室温30min，溶解形成结晶。在570nm波长处，用酶联检测仪检测各孔的光吸收值(OD)。杀伤活性(%)=(OD实验孔-OD阴性对照)/OD无杀伤对照×100。
, 百拇医药
1.4 正常人PBMC的NK活性测定 从血站得到正常人血18份按上述方法测正常人PBMC的NK活性。
1.5 统计学方法 实验结果以ˉx±s表示，用t检验比较各组间均数差异的显著性。
2 结果
2.1 正常人PBMC的NK杀伤活性 平均为86%。
2.2 肿瘤患者(CIK)治疗前后PBMC的NK活性测定 18 例肿瘤患者一个疗程CIK细胞治疗前后PBMC的NK活性见表1。
表1 肿瘤患者CIK细胞治疗前后自身PBMC的NK活性比较 (略)
表中显示18例肿瘤患者中14例患者CIK细胞治疗前的自身PBMC的NK活性在70%以下，平均NK活性(61%)明显低于正常人(86%，P<0.01)，一疗程CIK细胞治疗后，自身PBMC的NK活性都有不同程度升高，平均NK活性(83%)，升高程度22%(P<0.01)。
, 百拇医药
2.3 其他相关检测结果 经CIK细胞治疗后6例CEA增高的患者5例降低，3例AFP增高的患者2例降低。
2.4 临床一般情况 输注CIK过程中仅1例病人出现寒战、高热，对症治疗后体温很快恢复，未见其他副作用。99%的病人，食欲增加，睡眠改善，体力增强。
3 讨论
T淋巴细胞是细胞免疫的主要效应细胞。机体的免疫调节是通过T淋巴细胞亚群(TLS)实现的，NK细胞是机体抗肿瘤防御功能的主要免疫细胞，具有广谱的杀伤肿瘤细胞功能[3，4] 。因此，TLS和NK细胞的测定是目前国际上公认的评价机体抗肿瘤免疫的重要指标 [5] 。大量的研究资料表明恶性肿瘤患者存在不同程度的免疫机能受损CD3 + 、CD4 +、CD8 + 和NK细胞活性降低。我们用自身CIK细胞过继性输注治疗18例肿瘤患者。结果显示:大大提高了患者PBMC的NK活性。患者经过一疗程CIK细胞治疗后PBMC的NK活性从治疗前的61%升高到83%，平均升高22%(P<0.01)。以上数据说明CIK细胞输注治疗后能有效地提高其机体的对肿瘤细胞的杀伤能力。
, 百拇医药
总之，CIK细胞用于临床治疗病人，安全性好，副作用极少，能有效地提高肿瘤患者机体杀伤肿瘤细胞的能力。
参考文献
1 于津浦，任秀宝，张澎，等.恶性实体瘤患者自体CK细胞的体外大量扩增与生物学指标检测.中国肿瘤生物治疗杂志，2001，8(3):215-216.
2 孙卫民，王慧琴.细胞因子研究方法学.北京:人民卫生出版社，2000，108-109.
3 Finke J，Frrone S，Fuey A，et al.where have all the T cells gone?Mechanisms of immune evasion by trmors.Immune Today，1999，20(4):158-160.
4 Lowdess Mw，Lafmb L，Hoyle C，et al.Non-MHC-restricted cytotoxic cells:Their roles in the control and treatment of leukaemias.Brj of Haem，2001，114:11-24.
5 Margolin KA，Negrin RS，Forman SJ，et al.cellular immunotherapy and autologus transplantation for hematologic malignancy.Immunol Rev，1997，157:231-240.
作者单位:110016辽宁省人民医院中心实验室
(收稿日期:2003-03-09)
(编辑 于少伟), 百拇医药(杨琨 聂军 花向峰)