IL-2和IL-12对PBL粘附分子表达的影响及其抗肿瘤作用
【摘要】 目的 了解IL-2和IL-12对正常人外周血淋巴细胞(PBL)粘附分子(adhesion molecules，AM)表达的影响并明确AM在杀伤细胞抗肿瘤中的作用。方法 免疫荧光标记，流式细胞仪分析IL-12和IL-2活化前后PBL AM表达的改变，乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测抗AM单克隆抗体(MAb)封闭前后，IL-2和IL-12激活的杀伤细胞(IL-2AK和IL-12AK)对肝细胞癌杀伤活性的变化。结果 IL-2和IL-12均不同程度地促进多种AM的表达，各AM单抗封闭后IL-2AK与IL-12AK杀伤活性都下降。杀伤细胞表面AM位点封闭对杀伤活性的影响高于靶细胞表面AM位点封闭。结论 IL-2和IL-12上调PBL多种AM的表达，粘附分子直接参与了对靶细胞的杀伤。杀伤活性与AM的表达程度一致，也与肿瘤细胞表面AM的种类相关。
关键词 IL-2 IL-12 粘附分子 杀伤细胞 细胞毒性
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)18-2666-03
, 百拇医药
The effects of IL-2and IL-12on the expression of adhesion
molecules and the role of them in killing tumor cells
Li Xianxing，Li Li，Fu Zhiren，et al.
Department of General Surgery and the Center of Clinical
Immunology of PLA，Second Military Medical University，Shanghai200003.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of IL-2and IL-12in the expression of AM on PBL and to clarify the role of AM in IL-2AK and IL-12AK in killing tumors cells.Methods Immunofluorescence labelling and FACS were used to examine the expression of AM on the PBL before and after activated by IL-2and IL-12.The anti-tumor activity that IL-2AK and IL-12AK to kill the hepatocellular carcinoma cell line was detected beˉfore and after the anti-AM monoclonal antibodies(MAbs)blocking the IL-2AK and IL-12AK.Results Both the IL-2and IL-12promotedmost of the AM expression on PBL in different degrees.The anti-tumor activity of IL-2AK and IL-12AK showed significantly decreased after blocked by anti-AM mAbs.Conclusion IL-2and IL-12promoted the expression of many kind of AM on PBL.AM directly took part in the killing activity of IL-2AK and IL-12AK to kill tumor cells.But the effects was varied depending on the type of the AM expressed on AK and tumor cells.
, 百拇医药
Key words IL-2 IL-12 adhesion molecules killing cells cytotoxicity
粘附分子在淋巴细胞杀伤肿瘤中的作用早已受到关注，已证实AM在肿瘤杀伤中介导了淋巴细胞与肿瘤细胞的结合，研究认为AM可能参与了对肿瘤杀伤的信号传导 [1] ，某些AM起着触发作用，能够诱导杀伤细胞杀伤靶细胞。本实验的目的是通过分析两种杀伤活性最显著的刺激因子IL-2和IL-12对正常人PBL中CD2、CD29、CD49b、CD49d、CD44等AM表达的影响，以及抗AM单抗分别封闭IL-2AK和IL-12AK和肿瘤细胞表面AM抗原位点后IL-2AK和IL-12AK抗肿瘤活性的改变，进而明确AM在杀伤肿瘤中的作用，及其作用程度和影响因素。
1 材料与方法
1.1 标本与试剂 血标本取自献血员外周静脉，肝素抗凝。组织培养基(TCM)RPMI1640和DMEM(GIBCO，美国)1:1混合，加10%小牛血清rhIL-2(英路因，沈阳三生药业有限公司)rhIL-12(英国Genetic Institute Inc.Laurie Lee Lischer惠赠)生物活性6.0×10 6 U/ml，特异性活性4.5×10 6 /ml。
, 百拇医药
1.2 Mabs 小鼠抗人IgG，异硫氰荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)直接或间接标记。CD44-FITC、CD54、CD56、CD69(美国PharMingen公司)。CD2、CD29、CD49b、CD49d、CD50(美国BECKMAN-COULTER公司)。
1.3 肿瘤细胞传代 肝癌细胞系SMMC7721由本院实验科传代、维持对数生长。
1.4 PBL分离和杀伤细胞诱生 淋巴细胞分离液常规法分离PBL。TCM中加入不同刺激因子，0组:仅TCM;A、B组先加PHA1μg/ml，孵育24h，分别加IL-21000U/ml(A组);IL-1220U/ml(B组)。再培养72h，分别收集。TCM洗2遍，去除可溶性细胞因子影响。
1.5 AM标记及检测 直接法和间接法标记按文献 [4] 标记和流式细胞仪分析。
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1.6 细胞毒活性及AM的影响检测 如上准备杀伤细胞和靶细胞。未加任何抗体的杀伤细胞为正常对照。AM对细胞毒活性影响检测分为AM单抗封闭杀伤细胞表面AM位点和封闭靶细胞表面AM位点两部分。杀伤细胞2×10 6 /0.5ml/管和靶细胞2×10 6 /1.2ml/管，逐管加入饱和量相应AM单抗，同型配对非免疫小鼠IgG为实验对照，4℃冰浴15min，PBS洗，调整杀伤细胞2×10 6 /ml，靶细胞1×10 5 /ml。效靶细胞20:1混合，置24孔培养板，2ml/孔，37℃5%CO
2 孵育5h。LDH释放法检测，方法及结果计算参照文献 [3] 。
1.7 统计学分析 每实验组(n=5)间比较用单因素方差分析。
2 结果
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2.1 IL-2和IL-12作用下AM表达的改变 正常人PBL高表达CD2、CD29、CD44、CD49d、CD50。CD49b、CD54和CD56水平较低，基本不表达CD69，见表1。IL-2和IL-12对AM表现为普遍的表达诱导和上调，IL-2作用更明显，IL-12却下调。
表1 IL-12和IL-2活化的PBL中AM的表达
注:高于正常组 ˇ P<0.05;显著高于正常组 ˇˇ P<0.001，显著低于正常组 ˇˇˇ P<0.001 CD50表达，对CD2和CD56的促表达作用较IL-2显著。CD2等AM在IL-2和IL-12作用下，不仅阳性细胞百分比提高，细胞膜表面平均荧光强度也明显增加，特别是CD2和CD69，总体平均荧光强度右移，并可见双峰。
2.2 AM在细胞毒活性中的作用 AM抗体封闭后IL-2AK和IL-12AK杀伤活性显著降低(P<0.001)，CD2、CD29、CD44、CD49b、CD49d和CD54的作用明显。不同的AM在IL-2AK和IL-12AK的杀伤活性中的作用不同(图1)。CD2、CD29和CD49d在IL-2AK的杀伤中作用明显，CD44、CD49b和CD56在IL-12AK中的作用明显，CD50作用较弱，CD56对IL-2AK的影响较小。同时对胃癌和大肠癌细胞系MKN28和SW1116进行的相同实验也得到类似的结果。重复三次检测肿瘤细胞AM表达(图2)，和AM单抗封闭肿瘤细胞表面位点后细胞毒活性的改变，结果AM在IL-2AK和IL-12AK杀伤肿瘤中的作用与肿瘤细胞表面AM的表达有关。
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图1 LDH释放法检测AM单抗封闭前后IL-2AK和IL-12AK对人肝细胞癌细胞系SMMC7721杀伤活性(%，ˉx±s)
图2 AM在SMMC7721细胞表面的表达以及抗AM单抗封闭肿瘤细胞表面位点后IL-2AK与IL-12AK杀伤活性的改变(%，ˉx±s)
3 讨论
3.1 IL-12与IL-2在PBL AM表达中的作用 本文证实IL-2对多种AM的表达均有较强促进作用。IL-12对AM的表达则表现为上调和下调两种效应，上调CD29、CD49d、CD54、CD44和CD56的表达，对CD49b的表达无影响，下调CD50的表达。因为没有进行不同时间的表达检测，不能除外时间影响因素，可能CD50的表达更早或晚。IL-2的促表达效应高于IL-12(P<0.05)。结合杀伤活性检测 [3] 可以说明AM的表达与淋巴细胞的杀伤活性直接相关。有报道认为，淋巴细胞通过表面AM与肿瘤细胞表面相应配体识别和结合参与对靶细胞的接触，粘附和移动抑制，以及粘附解除。LAK和NK活性增加与细胞间粘附分子的表达或功能增强相关 [1] 。
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但目前还不清楚AM介导细胞凝集主要是通过分子构型变化，还是通过其数量的增加实现的，该实验证实细胞表面分子的增加在其中起着重要作用。IL-2和IL-12显著促进了AM表达，形态学观察证实AK细胞与粘附最密切的形态学特征是细胞聚集和形态改变，这种效应在IL-2的作用下最显著，培养48h后淋巴细胞的聚集和增殖形成肉眼可见的白色颗粒，这一现象与IL-2对AM的促表达作用结果一致，这种粘附就是由AM直接介导的。推测与IL-2较高的溶细胞活性的产生有关，也与其对血管内皮的损伤有关。
3.2 粘附分子在AK细胞杀伤肿瘤中的作用 NK与靶细胞的结合是细胞毒活性所必需的，而结合的实现依赖于细胞表面AM与靶细胞上相应配体的结合。AM抗原位点封闭后IL-2AK与IL-12AK杀伤活性的下降是AM直接参与杀伤细胞对肿瘤的杀伤的最好证明。并表明杀伤活性的改变与AM的类型直接相关，不同的AM在淋巴细胞对靶细胞的杀伤中起着不同作用。当然也受刺激因子的影响，也与AM在肿瘤细胞表面的表达情况有关。CD2、CD44、CD49b、d、CD54和CD69都在杀伤肿瘤中起着非常重要的作用。CD2、CD29、CD44、CD49和CD50是在IL-2和IL-12作用下达到最高表达的分子，但相应抗体封闭后杀伤抑制率却不尽相同。CD69参与AK对靶细胞的杀伤，这一点尚未见报道。而在细胞表面高表达的CD50在AK对肿瘤杀伤中的作用并不如预期的高，可能与CD50主要参与免疫应答的诱导，即在免疫反应的早期起作用有关，也与实验所用单抗的特性有关。实验还通过形态观察和HE染色发现在AK细胞与靶细胞混合后二者即迅速粘着，淋巴细胞围绕靶细胞，形成花环样结构。这种现象在凋亡的肿瘤细胞周围更明显。
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3.3 与IL-12AK功能活性相关AM的作用及其意义 CD44在IL-12AK的细胞毒活性中发挥了重要作用，虽然CD44在IL-2AK中的表达高于在IL-12AK。Fujii [6] 等在炎细胞中进行的研究助于解释这一现象，他们发现CD44与感染细胞的交联促进炎症细胞Fas的表达，并由此引起Fas-FasL介导的炎细胞凋亡。在肿瘤的杀伤过程中CD44确切作用还不清楚，但作为AM CD44应当具有介导靶细胞与淋巴细胞粘附和聚集的作用。当CD44抗体封闭后，淋巴细胞与肿瘤细胞的粘附能力大大丧失。我们已发现IL-12AK具有较强诱导肿瘤细胞凋亡作用 [3] ，而CD44在IL-2AK中的高表达并没有产生高于IL-12AK的杀伤辅助功能，表明CD44在肿瘤杀伤中可能也有其在炎细胞中类似的促Fas高表达，并导致Fas-FasL途径的肿瘤杀伤。CD49b在IL-12AK活性中也表现出较强的作用，Arese对小鼠NK细胞相关抗原的研究发现一抗NK抗原的抗体能识别CD49b并能与之结合，被这一单抗识别的NK细胞具有较高的细胞毒活性，此活性能够被抗CD49b单抗阻断 [7] ，这一结果能够帮助解释CD49b对IL-12AK活性的影响的原因。CD56是NK细胞的标志之一，它在NK杀伤中的作 用已得到证实 [8] ，IL-12是NK细胞的重要生长因子，因此，CD56在IL-12AK中的作用，说明CD56参与了IL-12AK对肿瘤的杀伤，也证实IL-12AK中有相当数量的NK细胞。
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3.4 肿瘤细胞AM与杀伤的关系 肿瘤细胞表面AM抗原位点封闭后对杀伤活性的影响基本与AM的表达一致。CD44表达最高，位点封闭后杀伤活性抑制最显著，CD49d封闭后肿瘤细胞对AK杀伤的敏感性也显著降低，说明它们在AK与肿瘤的粘着，甚至识别中起作用。CD56封闭后对IL-2AK和IL-12AK的影响没有明显区别，CD56的低表达是主要原因，也反证了CD56在AK细胞中起着重要作用。
总体来讲IL-2诱导的AM表达水平高于IL-12，而IL-12AK对肝癌细胞以及胃癌和大肠癌细胞的杀伤水平高于IL-2AK，并且这种杀伤能力对AM的依赖较IL-2AK低。说明IL-12AK细胞毒活性的实现途径与IL-2AK有区别。曾进行的比较研究已证实IL-12AK致肿瘤细胞凋亡高于IL-2AK [3] 。结合本实验结果可以证明AM在肿瘤杀伤中，不仅起着杀伤细胞与靶细胞结合的桥梁作用，并传递不同的信号决定着杀伤效应和肿瘤细胞的死亡方式。二者的重要区别之一是NK细胞在IL-12AK中占很大比例，由此也说明NK细胞对肿瘤细胞的杀伤更多是通过致凋亡途径实现的。
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参考文献
1 O’SullivanB，ThomasR.CD40and dendritic cell function.Crit Rev Imˉmunol，2003，23(1-2):83-107.
2 李先兴，李莉，付志仁，等.IL-12与IL-2活化的淋巴细胞表型改变的区别及其意义.解放军医学杂志，2001，26(5):344-345.
3 李先兴，李莉，付志仁，等.IL-12和IL-2激活的杀伤细胞抗肿瘤活性比较及杀伤机制探讨.中华中西医杂志，2001，2(8):673-674.
4 李莉，张玲珍，陈育贵，等.中国人淋巴细胞37种表型正常值的测定.上海免疫学杂志，1998，18:267-270.
5 Stuyt RJ，Netea MG，Geijtenbeek TB，et al.Selective regulation of interˉcellular adhesion molecule-1expression by interleukin-18and interˉleukin-12on human monocytes.Immunology，2003，110(3):329.
, http://www.100md.com
6 Koichi F，Yuko F，Stefan H，et al.CD44is the physiological trigger of Fas up-regulation on rheumatoid synovial cells.J Immunol，2001，167:1198.
7 Ratthe C，PelletierM，Roberge CJ，et al.Activation of human neutrophils bythe pollutant sodium sulfite;effect on cytokine production，chemoˉtaxis，and cell surface expression of cell adhesion molecules.Clin Imˉmunol，2002，105(2):169.
8 Takasaki S，Hayashida K，Morita C，et al.CD56directly interacts in the process of NCAM-positive target cell-killing by NK cells.Cell Biol Int，2000，24:101.
作者单位:200003上海第二军医大学长征医院器官移植中心肝移植部(全军临床免疫中心)
(编辑小 川), 百拇医药(李先兴 李莉 付志仁 王强 张玲珍 仲人前)
关键词 IL-2 IL-12 粘附分子 杀伤细胞 细胞毒性
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)18-2666-03
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The effects of IL-2and IL-12on the expression of adhesion
molecules and the role of them in killing tumor cells
Li Xianxing，Li Li，Fu Zhiren，et al.
Department of General Surgery and the Center of Clinical
Immunology of PLA，Second Military Medical University，Shanghai200003.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of IL-2and IL-12in the expression of AM on PBL and to clarify the role of AM in IL-2AK and IL-12AK in killing tumors cells.Methods Immunofluorescence labelling and FACS were used to examine the expression of AM on the PBL before and after activated by IL-2and IL-12.The anti-tumor activity that IL-2AK and IL-12AK to kill the hepatocellular carcinoma cell line was detected beˉfore and after the anti-AM monoclonal antibodies(MAbs)blocking the IL-2AK and IL-12AK.Results Both the IL-2and IL-12promotedmost of the AM expression on PBL in different degrees.The anti-tumor activity of IL-2AK and IL-12AK showed significantly decreased after blocked by anti-AM mAbs.Conclusion IL-2and IL-12promoted the expression of many kind of AM on PBL.AM directly took part in the killing activity of IL-2AK and IL-12AK to kill tumor cells.But the effects was varied depending on the type of the AM expressed on AK and tumor cells.
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Key words IL-2 IL-12 adhesion molecules killing cells cytotoxicity
粘附分子在淋巴细胞杀伤肿瘤中的作用早已受到关注，已证实AM在肿瘤杀伤中介导了淋巴细胞与肿瘤细胞的结合，研究认为AM可能参与了对肿瘤杀伤的信号传导 [1] ，某些AM起着触发作用，能够诱导杀伤细胞杀伤靶细胞。本实验的目的是通过分析两种杀伤活性最显著的刺激因子IL-2和IL-12对正常人PBL中CD2、CD29、CD49b、CD49d、CD44等AM表达的影响，以及抗AM单抗分别封闭IL-2AK和IL-12AK和肿瘤细胞表面AM抗原位点后IL-2AK和IL-12AK抗肿瘤活性的改变，进而明确AM在杀伤肿瘤中的作用，及其作用程度和影响因素。
1 材料与方法
1.1 标本与试剂 血标本取自献血员外周静脉，肝素抗凝。组织培养基(TCM)RPMI1640和DMEM(GIBCO，美国)1:1混合，加10%小牛血清rhIL-2(英路因，沈阳三生药业有限公司)rhIL-12(英国Genetic Institute Inc.Laurie Lee Lischer惠赠)生物活性6.0×10 6 U/ml，特异性活性4.5×10 6 /ml。
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1.2 Mabs 小鼠抗人IgG，异硫氰荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)直接或间接标记。CD44-FITC、CD54、CD56、CD69(美国PharMingen公司)。CD2、CD29、CD49b、CD49d、CD50(美国BECKMAN-COULTER公司)。
1.3 肿瘤细胞传代 肝癌细胞系SMMC7721由本院实验科传代、维持对数生长。
1.4 PBL分离和杀伤细胞诱生 淋巴细胞分离液常规法分离PBL。TCM中加入不同刺激因子，0组:仅TCM;A、B组先加PHA1μg/ml，孵育24h，分别加IL-21000U/ml(A组);IL-1220U/ml(B组)。再培养72h，分别收集。TCM洗2遍，去除可溶性细胞因子影响。
1.5 AM标记及检测 直接法和间接法标记按文献 [4] 标记和流式细胞仪分析。
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1.6 细胞毒活性及AM的影响检测 如上准备杀伤细胞和靶细胞。未加任何抗体的杀伤细胞为正常对照。AM对细胞毒活性影响检测分为AM单抗封闭杀伤细胞表面AM位点和封闭靶细胞表面AM位点两部分。杀伤细胞2×10 6 /0.5ml/管和靶细胞2×10 6 /1.2ml/管，逐管加入饱和量相应AM单抗，同型配对非免疫小鼠IgG为实验对照，4℃冰浴15min，PBS洗，调整杀伤细胞2×10 6 /ml，靶细胞1×10 5 /ml。效靶细胞20:1混合，置24孔培养板，2ml/孔，37℃5%CO
2 孵育5h。LDH释放法检测，方法及结果计算参照文献 [3] 。
1.7 统计学分析 每实验组(n=5)间比较用单因素方差分析。
2 结果
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2.1 IL-2和IL-12作用下AM表达的改变 正常人PBL高表达CD2、CD29、CD44、CD49d、CD50。CD49b、CD54和CD56水平较低，基本不表达CD69，见表1。IL-2和IL-12对AM表现为普遍的表达诱导和上调，IL-2作用更明显，IL-12却下调。
表1 IL-12和IL-2活化的PBL中AM的表达
注:高于正常组 ˇ P<0.05;显著高于正常组 ˇˇ P<0.001，显著低于正常组 ˇˇˇ P<0.001 CD50表达，对CD2和CD56的促表达作用较IL-2显著。CD2等AM在IL-2和IL-12作用下，不仅阳性细胞百分比提高，细胞膜表面平均荧光强度也明显增加，特别是CD2和CD69，总体平均荧光强度右移，并可见双峰。
2.2 AM在细胞毒活性中的作用 AM抗体封闭后IL-2AK和IL-12AK杀伤活性显著降低(P<0.001)，CD2、CD29、CD44、CD49b、CD49d和CD54的作用明显。不同的AM在IL-2AK和IL-12AK的杀伤活性中的作用不同(图1)。CD2、CD29和CD49d在IL-2AK的杀伤中作用明显，CD44、CD49b和CD56在IL-12AK中的作用明显，CD50作用较弱，CD56对IL-2AK的影响较小。同时对胃癌和大肠癌细胞系MKN28和SW1116进行的相同实验也得到类似的结果。重复三次检测肿瘤细胞AM表达(图2)，和AM单抗封闭肿瘤细胞表面位点后细胞毒活性的改变，结果AM在IL-2AK和IL-12AK杀伤肿瘤中的作用与肿瘤细胞表面AM的表达有关。
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图1 LDH释放法检测AM单抗封闭前后IL-2AK和IL-12AK对人肝细胞癌细胞系SMMC7721杀伤活性(%，ˉx±s)
图2 AM在SMMC7721细胞表面的表达以及抗AM单抗封闭肿瘤细胞表面位点后IL-2AK与IL-12AK杀伤活性的改变(%，ˉx±s)
3 讨论
3.1 IL-12与IL-2在PBL AM表达中的作用 本文证实IL-2对多种AM的表达均有较强促进作用。IL-12对AM的表达则表现为上调和下调两种效应，上调CD29、CD49d、CD54、CD44和CD56的表达，对CD49b的表达无影响，下调CD50的表达。因为没有进行不同时间的表达检测，不能除外时间影响因素，可能CD50的表达更早或晚。IL-2的促表达效应高于IL-12(P<0.05)。结合杀伤活性检测 [3] 可以说明AM的表达与淋巴细胞的杀伤活性直接相关。有报道认为，淋巴细胞通过表面AM与肿瘤细胞表面相应配体识别和结合参与对靶细胞的接触，粘附和移动抑制，以及粘附解除。LAK和NK活性增加与细胞间粘附分子的表达或功能增强相关 [1] 。
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但目前还不清楚AM介导细胞凝集主要是通过分子构型变化，还是通过其数量的增加实现的，该实验证实细胞表面分子的增加在其中起着重要作用。IL-2和IL-12显著促进了AM表达，形态学观察证实AK细胞与粘附最密切的形态学特征是细胞聚集和形态改变，这种效应在IL-2的作用下最显著，培养48h后淋巴细胞的聚集和增殖形成肉眼可见的白色颗粒，这一现象与IL-2对AM的促表达作用结果一致，这种粘附就是由AM直接介导的。推测与IL-2较高的溶细胞活性的产生有关，也与其对血管内皮的损伤有关。
3.2 粘附分子在AK细胞杀伤肿瘤中的作用 NK与靶细胞的结合是细胞毒活性所必需的，而结合的实现依赖于细胞表面AM与靶细胞上相应配体的结合。AM抗原位点封闭后IL-2AK与IL-12AK杀伤活性的下降是AM直接参与杀伤细胞对肿瘤的杀伤的最好证明。并表明杀伤活性的改变与AM的类型直接相关，不同的AM在淋巴细胞对靶细胞的杀伤中起着不同作用。当然也受刺激因子的影响，也与AM在肿瘤细胞表面的表达情况有关。CD2、CD44、CD49b、d、CD54和CD69都在杀伤肿瘤中起着非常重要的作用。CD2、CD29、CD44、CD49和CD50是在IL-2和IL-12作用下达到最高表达的分子，但相应抗体封闭后杀伤抑制率却不尽相同。CD69参与AK对靶细胞的杀伤，这一点尚未见报道。而在细胞表面高表达的CD50在AK对肿瘤杀伤中的作用并不如预期的高，可能与CD50主要参与免疫应答的诱导，即在免疫反应的早期起作用有关，也与实验所用单抗的特性有关。实验还通过形态观察和HE染色发现在AK细胞与靶细胞混合后二者即迅速粘着，淋巴细胞围绕靶细胞，形成花环样结构。这种现象在凋亡的肿瘤细胞周围更明显。
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3.3 与IL-12AK功能活性相关AM的作用及其意义 CD44在IL-12AK的细胞毒活性中发挥了重要作用，虽然CD44在IL-2AK中的表达高于在IL-12AK。Fujii [6] 等在炎细胞中进行的研究助于解释这一现象，他们发现CD44与感染细胞的交联促进炎症细胞Fas的表达，并由此引起Fas-FasL介导的炎细胞凋亡。在肿瘤的杀伤过程中CD44确切作用还不清楚，但作为AM CD44应当具有介导靶细胞与淋巴细胞粘附和聚集的作用。当CD44抗体封闭后，淋巴细胞与肿瘤细胞的粘附能力大大丧失。我们已发现IL-12AK具有较强诱导肿瘤细胞凋亡作用 [3] ，而CD44在IL-2AK中的高表达并没有产生高于IL-12AK的杀伤辅助功能，表明CD44在肿瘤杀伤中可能也有其在炎细胞中类似的促Fas高表达，并导致Fas-FasL途径的肿瘤杀伤。CD49b在IL-12AK活性中也表现出较强的作用，Arese对小鼠NK细胞相关抗原的研究发现一抗NK抗原的抗体能识别CD49b并能与之结合，被这一单抗识别的NK细胞具有较高的细胞毒活性，此活性能够被抗CD49b单抗阻断 [7] ，这一结果能够帮助解释CD49b对IL-12AK活性的影响的原因。CD56是NK细胞的标志之一，它在NK杀伤中的作 用已得到证实 [8] ，IL-12是NK细胞的重要生长因子，因此，CD56在IL-12AK中的作用，说明CD56参与了IL-12AK对肿瘤的杀伤，也证实IL-12AK中有相当数量的NK细胞。
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3.4 肿瘤细胞AM与杀伤的关系 肿瘤细胞表面AM抗原位点封闭后对杀伤活性的影响基本与AM的表达一致。CD44表达最高，位点封闭后杀伤活性抑制最显著，CD49d封闭后肿瘤细胞对AK杀伤的敏感性也显著降低，说明它们在AK与肿瘤的粘着，甚至识别中起作用。CD56封闭后对IL-2AK和IL-12AK的影响没有明显区别，CD56的低表达是主要原因，也反证了CD56在AK细胞中起着重要作用。
总体来讲IL-2诱导的AM表达水平高于IL-12，而IL-12AK对肝癌细胞以及胃癌和大肠癌细胞的杀伤水平高于IL-2AK，并且这种杀伤能力对AM的依赖较IL-2AK低。说明IL-12AK细胞毒活性的实现途径与IL-2AK有区别。曾进行的比较研究已证实IL-12AK致肿瘤细胞凋亡高于IL-2AK [3] 。结合本实验结果可以证明AM在肿瘤杀伤中，不仅起着杀伤细胞与靶细胞结合的桥梁作用，并传递不同的信号决定着杀伤效应和肿瘤细胞的死亡方式。二者的重要区别之一是NK细胞在IL-12AK中占很大比例，由此也说明NK细胞对肿瘤细胞的杀伤更多是通过致凋亡途径实现的。
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参考文献
1 O’SullivanB，ThomasR.CD40and dendritic cell function.Crit Rev Imˉmunol，2003，23(1-2):83-107.
2 李先兴，李莉，付志仁，等.IL-12与IL-2活化的淋巴细胞表型改变的区别及其意义.解放军医学杂志，2001，26(5):344-345.
3 李先兴，李莉，付志仁，等.IL-12和IL-2激活的杀伤细胞抗肿瘤活性比较及杀伤机制探讨.中华中西医杂志，2001，2(8):673-674.
4 李莉，张玲珍，陈育贵，等.中国人淋巴细胞37种表型正常值的测定.上海免疫学杂志，1998，18:267-270.
5 Stuyt RJ，Netea MG，Geijtenbeek TB，et al.Selective regulation of interˉcellular adhesion molecule-1expression by interleukin-18and interˉleukin-12on human monocytes.Immunology，2003，110(3):329.
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6 Koichi F，Yuko F，Stefan H，et al.CD44is the physiological trigger of Fas up-regulation on rheumatoid synovial cells.J Immunol，2001，167:1198.
7 Ratthe C，PelletierM，Roberge CJ，et al.Activation of human neutrophils bythe pollutant sodium sulfite;effect on cytokine production，chemoˉtaxis，and cell surface expression of cell adhesion molecules.Clin Imˉmunol，2002，105(2):169.
8 Takasaki S，Hayashida K，Morita C，et al.CD56directly interacts in the process of NCAM-positive target cell-killing by NK cells.Cell Biol Int，2000，24:101.
作者单位:200003上海第二军医大学长征医院器官移植中心肝移植部(全军临床免疫中心)
(编辑小 川), 百拇医药(李先兴 李莉 付志仁 王强 张玲珍 仲人前)