荧光定量逆转录聚合酶链反应在HCV感染检测中的应用
【摘要】 目的 了解荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)在丙型肝炎病毒(HCV)感染中的临床应用价值。方法 用FQ-RT-PCR检测63份怀疑HCV感染的临床样本，并同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗HCV，用全自动生化检测仪测定丙氨酸转氨酶(ALT)水平，了解样本中HCV-RNA含量与抗HCV及ALT的相关性。结果 63份样本中有40份HCV-RNA含量高于80拷贝/ml，57份抗HCV阳性，26例ALT异常，经统计分析每两者间具有明显相关性。结论FQ-RT-PCR技术检测HCV-RNA特异性强，灵敏度高，具有良好的应用价值。
关键词 丙型肝炎病毒 聚合酶链反应 荧光定量
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)01-0019-02
Clinical application of detection of HCV-RNA with FQ-RT-PCR
, http://www.100md.com
Chen Wensi，Li Gang，Chen Xuejuan.
Department of Infectious Diseases，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou510630.
【Abstract】 Objective To investigate the clinical application of the fluorescent quantitative reverse transcripˉtion polymerase chain reaction(FQ-RT-PCR)in the detection of HCV RNA.Methods HCV RNA of63sera from patients clinically diagnosed hepatitis C were detected by FQ-RT-PCR andantibody to HCV by ELISA.Spearman correlation analysis was used to understand the correlation between the HCV-RNA copies and the anti-HCV titers and ALT standard.Results HCV RNA in40of63samples were more than80copies/ml，while57of63sampleswere detected anti-HCV positive.There is a good correlation between these two methods(r=0.831，P<0.001).Conclusion FQ-RT-PCR is a specific and sensitive method for the detection of HCV RNA and can be widely used in clinical detection.
, 百拇医药
Key words heptitis C virus polymerase chain reaction fluoreseent quantitation
近年的许多研究表明，应用FQ-RT-PCR技术检测HCV RNA具有快速、特异、灵敏等优点。此方法对于丙型肝炎患者的早期确诊，治疗期间抗病毒药物的疗效评价、感染人群的普查以及污染源的监测等均具有较高的实用价值。本实验用逆转录PCR结合荧光探针的体外RNA扩增技术对63份怀疑丙型肝炎的临床样本进行检测，从方法学的角度探讨此技术在临床检测中的应用价值。
1 材料和方法
1.1 标本来源 选取临床上疑为丙型肝炎的血清样本63 份，其中59份为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性，2份HBˉsAg阳性，63份均为甲型肝炎病毒抗体(抗HAV IgM)和戊型肝炎病毒抗体(抗HEV IgM和IgG)阴性，51份有输血史，标本来自广州中山大学附属第三医院传染科住院或门诊病人。
, 百拇医药
1.2 FQ-RT-PCR检测方法 取50μl血清离心沉淀，RNA经提取后进行逆转录，吸取5μl逆转录产物按常规方式进行PCR扩增。PCR反应后再经荧光检测仪测定荧光强度。具体的操作步骤、结果判断按说明书进行。试剂由中山医科大学达安基因诊断中心提供，用PE5700基因检测系统进行PCR扩增及数据处理。HCV RNA含量的检测临界值为<80拷贝/ml。每份血清同时采用ELISA检测抗HCV，检测试剂由深圳月亮湾生物工程公司提供。用全自动生化仪测 定ALT水平，正常值<35U/L。
1.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行分析。
2 结果
2.1 HCV RNA及抗HCV、ALT检测结果 63份样本经FQ-RT-PCR检测，有40份含量高于80拷贝/ml，其中有2份是HBsAg阳性，为HCV与HBV合并感染。具体结果见表1。
, 百拇医药
表1 63份样本HCV RNA及抗HCV检测结果
从表1可以看出，40份HCV RNA含量高于80拷贝/ml的病例其抗HCV基本为阳性;而低于80拷贝/ml的病例有82%为抗HCV阳性，这可能是因为患者处于恢复期或经过药物治疗，此时血中RNA水平处于低复制或无复制状态。进一步经Spearman相关分析，HCV RNA阳性与抗HCV具有很好的相关性(r=0.587，P=0.002)。
2.2 HCV RNA含量与ALT异常的关系 见表2。
表2 HCV RNA含量与ALT异常的关系
从表2可见，40份HCV RNA含量高于80拷贝/ml的病例中，有26份ALT异常，其异常率随HCV-RNA含量的升高而增加。经统计学分析，ALT水平和HCV RNA含量之间差异无显著性(经秩和检验P=0.095)，而ALT异常率与HCV RNA含量呈正相关(R=0.903，P=0.036)。
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3 讨论
荧光定量PCR检测技术是一种较为成熟、稳定的技术。它具有定量准确性高，定量范围宽(可达80～10 7 拷贝/ml)，特异性较强而且步骤简单，自动化程度较高，操作快速等优点。该技术按常规PCR方式进行体外基因扩增，在反应体系中，荧光探针能与被扩增片段中某一区域特异性结合，当引物延模板伸至结合处时，荧光报告基团因Taq酶的3’-5’外切酶活性将探针切下来，即释放出荧光。仪器根据实时检测到的数据及标准曲线确定样本核酸的含量。因此该技术把基因扩增，分子杂交和荧光化学合为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，解决了PCR扩增产物污染和不能定量的问题。通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和结果的自动分析。目前，有资料表明，全自动PCR-ELISA内标法系 统(COBAS Amplicor)是公认的具有良好准确性和重复性的HCV RNA定量方法 [1] ，但由于设备和配套试剂极其昂贵，很难在的临床实验室推广使用 [2] ，而FQ-RT-PCR则避免了这些不足，故更适合于临床样本的检测。
, http://www.100md.com
本文资料显示，40份HCV RNA含量高于80拷贝/ml的样本中，抗HCV基本为阳性，且ALT异常率较高，提示这部分病例的HCV处于活动性复制阶段而患者肝脏亦处于活动性炎症状态。本文HCV RNA阳性者(含量高于80拷贝/ml)的检测结果与抗HCV基本一致，但HCV RNA阴性(低于80拷贝/ml)的病例亦有82%为抗HCV阳性。在本文63份怀疑丙型肝炎病毒感染的病例中，总的抗HCV阳性率高于HCV RNA阳性率，与王志明等报道的HCV RNA阳性率高于抗HCV阳性率的结果有所差异 [3] ，其原因可能为:本文调查的病例中，部分患者处于感染恢复期或经过一段时期的抗病毒治疗，病毒复制减弱或停止，血清中已无HCV RNA存在或病毒载量极低，定量PCR也无法检出，而此时抗HCV仍未消失。本资料还显示，ALT水平与HCV RNA含量无明显相关性，但ALT异常率随HCV RNA含量的升高而增加，与文献报道 [3] 基本相符。
参考文献
, 百拇医药
1 Didomenico N，Link H，Konbel R，et al.COBAS Amplicor:fully autoˉmated RNA and DNA amplification and detection system for routine PCR.Clin Chem，1996，42:1915-1923.
2 Maria M，Jordi G，Juan IE，et al.High-thoughput real-time reverse ranscription-PCR quantitation of HCV-RNA.J Clin Microbiol，1999，37:327-332.
3 王志明，谭复明，陈伟华，等.输血后丙型肝炎病毒感染的血清病毒定量研究.中华传染病杂志，2000，18:37-39.
(收稿日期:2002-08-30)
作者单位:510630广州中山大学附属第三医院传染病科
(编辑梅 燕), http://www.100md.com(陈文思 李刚 陈雪娟)
关键词 丙型肝炎病毒 聚合酶链反应 荧光定量
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)01-0019-02
Clinical application of detection of HCV-RNA with FQ-RT-PCR
, http://www.100md.com
Chen Wensi，Li Gang，Chen Xuejuan.
Department of Infectious Diseases，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou510630.
【Abstract】 Objective To investigate the clinical application of the fluorescent quantitative reverse transcripˉtion polymerase chain reaction(FQ-RT-PCR)in the detection of HCV RNA.Methods HCV RNA of63sera from patients clinically diagnosed hepatitis C were detected by FQ-RT-PCR andantibody to HCV by ELISA.Spearman correlation analysis was used to understand the correlation between the HCV-RNA copies and the anti-HCV titers and ALT standard.Results HCV RNA in40of63samples were more than80copies/ml，while57of63sampleswere detected anti-HCV positive.There is a good correlation between these two methods(r=0.831，P<0.001).Conclusion FQ-RT-PCR is a specific and sensitive method for the detection of HCV RNA and can be widely used in clinical detection.
, 百拇医药
Key words heptitis C virus polymerase chain reaction fluoreseent quantitation
近年的许多研究表明，应用FQ-RT-PCR技术检测HCV RNA具有快速、特异、灵敏等优点。此方法对于丙型肝炎患者的早期确诊，治疗期间抗病毒药物的疗效评价、感染人群的普查以及污染源的监测等均具有较高的实用价值。本实验用逆转录PCR结合荧光探针的体外RNA扩增技术对63份怀疑丙型肝炎的临床样本进行检测，从方法学的角度探讨此技术在临床检测中的应用价值。
1 材料和方法
1.1 标本来源 选取临床上疑为丙型肝炎的血清样本63 份，其中59份为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性，2份HBˉsAg阳性，63份均为甲型肝炎病毒抗体(抗HAV IgM)和戊型肝炎病毒抗体(抗HEV IgM和IgG)阴性，51份有输血史，标本来自广州中山大学附属第三医院传染科住院或门诊病人。
, 百拇医药
1.2 FQ-RT-PCR检测方法 取50μl血清离心沉淀，RNA经提取后进行逆转录，吸取5μl逆转录产物按常规方式进行PCR扩增。PCR反应后再经荧光检测仪测定荧光强度。具体的操作步骤、结果判断按说明书进行。试剂由中山医科大学达安基因诊断中心提供，用PE5700基因检测系统进行PCR扩增及数据处理。HCV RNA含量的检测临界值为<80拷贝/ml。每份血清同时采用ELISA检测抗HCV，检测试剂由深圳月亮湾生物工程公司提供。用全自动生化仪测 定ALT水平，正常值<35U/L。
1.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行分析。
2 结果
2.1 HCV RNA及抗HCV、ALT检测结果 63份样本经FQ-RT-PCR检测，有40份含量高于80拷贝/ml，其中有2份是HBsAg阳性，为HCV与HBV合并感染。具体结果见表1。
, 百拇医药
表1 63份样本HCV RNA及抗HCV检测结果
从表1可以看出，40份HCV RNA含量高于80拷贝/ml的病例其抗HCV基本为阳性;而低于80拷贝/ml的病例有82%为抗HCV阳性，这可能是因为患者处于恢复期或经过药物治疗，此时血中RNA水平处于低复制或无复制状态。进一步经Spearman相关分析，HCV RNA阳性与抗HCV具有很好的相关性(r=0.587，P=0.002)。
2.2 HCV RNA含量与ALT异常的关系 见表2。
表2 HCV RNA含量与ALT异常的关系
从表2可见，40份HCV RNA含量高于80拷贝/ml的病例中，有26份ALT异常，其异常率随HCV-RNA含量的升高而增加。经统计学分析，ALT水平和HCV RNA含量之间差异无显著性(经秩和检验P=0.095)，而ALT异常率与HCV RNA含量呈正相关(R=0.903，P=0.036)。
, http://www.100md.com
3 讨论
荧光定量PCR检测技术是一种较为成熟、稳定的技术。它具有定量准确性高，定量范围宽(可达80～10 7 拷贝/ml)，特异性较强而且步骤简单，自动化程度较高，操作快速等优点。该技术按常规PCR方式进行体外基因扩增，在反应体系中，荧光探针能与被扩增片段中某一区域特异性结合，当引物延模板伸至结合处时，荧光报告基团因Taq酶的3’-5’外切酶活性将探针切下来，即释放出荧光。仪器根据实时检测到的数据及标准曲线确定样本核酸的含量。因此该技术把基因扩增，分子杂交和荧光化学合为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，解决了PCR扩增产物污染和不能定量的问题。通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和结果的自动分析。目前，有资料表明，全自动PCR-ELISA内标法系 统(COBAS Amplicor)是公认的具有良好准确性和重复性的HCV RNA定量方法 [1] ，但由于设备和配套试剂极其昂贵，很难在的临床实验室推广使用 [2] ，而FQ-RT-PCR则避免了这些不足，故更适合于临床样本的检测。
, http://www.100md.com
本文资料显示，40份HCV RNA含量高于80拷贝/ml的样本中，抗HCV基本为阳性，且ALT异常率较高，提示这部分病例的HCV处于活动性复制阶段而患者肝脏亦处于活动性炎症状态。本文HCV RNA阳性者(含量高于80拷贝/ml)的检测结果与抗HCV基本一致，但HCV RNA阴性(低于80拷贝/ml)的病例亦有82%为抗HCV阳性。在本文63份怀疑丙型肝炎病毒感染的病例中，总的抗HCV阳性率高于HCV RNA阳性率，与王志明等报道的HCV RNA阳性率高于抗HCV阳性率的结果有所差异 [3] ，其原因可能为:本文调查的病例中，部分患者处于感染恢复期或经过一段时期的抗病毒治疗，病毒复制减弱或停止，血清中已无HCV RNA存在或病毒载量极低，定量PCR也无法检出，而此时抗HCV仍未消失。本资料还显示，ALT水平与HCV RNA含量无明显相关性，但ALT异常率随HCV RNA含量的升高而增加，与文献报道 [3] 基本相符。
参考文献
, 百拇医药
1 Didomenico N，Link H，Konbel R，et al.COBAS Amplicor:fully autoˉmated RNA and DNA amplification and detection system for routine PCR.Clin Chem，1996，42:1915-1923.
2 Maria M，Jordi G，Juan IE，et al.High-thoughput real-time reverse ranscription-PCR quantitation of HCV-RNA.J Clin Microbiol，1999，37:327-332.
3 王志明，谭复明，陈伟华，等.输血后丙型肝炎病毒感染的血清病毒定量研究.中华传染病杂志，2000，18:37-39.
(收稿日期:2002-08-30)
作者单位:510630广州中山大学附属第三医院传染病科
(编辑梅 燕), http://www.100md.com(陈文思 李刚 陈雪娟)