羟乙基淀粉40氯化钠注射液细菌内毒素检测法
【文献标识码】 B 【文章编号】 1606-8106(2003)18-2727-02
为考察羟乙基淀粉40氯化钠注射液对鲎试验的干扰行为，本文采用鲎试剂检测羟乙基淀粉40氯化钠注射液的细菌内毒素。经干扰试验结果表明，样品原液及样品按1:1稀释后对鲎试验均有直接的抑制作用，样品按1:3稀释后可消除抑制作用。所以使用灵敏度0.125EU/ml的鲎试剂按细菌内毒素检查法检测是可行的。
1 试药与仪器
1.1 试药 鲎试剂(规格0.5EU/ml，批号为0201212，生产厂家为湛江安度斯生物有限公司;规格0.25EU/ml，批号为001213，生产厂家福州新北生化有限公司;规格0.125EU/ml，批号为0109243，生产厂家为湛江安度斯生物有限公司;鲎试剂灵敏度复核试验结果(Es)分别为0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.105EU/ml)细菌内毒素检查用水(规格2ml/支，批号为010201，生产厂家为福州新北生化工业有限公司)细菌内毒素工作标准品(规格70EU/支，批号为2001-3，生产厂家为中国药品生物检定所)羟乙基淀粉40氯化钠注射液(规格500ml/瓶、6%，批号为020416304，020416205，020416206，生产厂家为牡丹江温春双鹤药业有限责任公司，热原由兔法检查均合格)。
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1.2 仪器 电热恒温干燥箱、恒温水浴箱、超净工作台、旋涡混合器、所用玻璃器皿经三交热原灭活剂处理(于250℃干烤2h)。
2 试验方法
2.1 内毒素限值(L)的确定 在进行干扰试验前，首先确定了该品种的细菌内毒素限值:L=K/M;注射剂的K=5EU/(kg·h):M为人用最大剂量，以ml/(kg·h)表示，中国人均体重按60kg计算，即热原检查剂量，中国药典(二部)2000年版规定热原项检查取本品，剂量按家兔体重每10ml/kg注射，则:L=K/M=5EU/(kg·h)/10ml/(kg·h)=0.5EU/ml。因此，羟乙基淀粉40氯化钠注射液细菌内毒素检查的限值为每1ml含内毒素量不得超过0.5EU。
2.2 细菌内毒素干扰试验起始浓度及浓度范围的确定 进行干扰试验前，计算供试品进行内毒素检查时的最大浓度和最小浓度(未考虑干扰因素)，按以下公式进行计算:当L表示为EU/mg、EU/U时:C max =λ max /L，C min =λ min /L。
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目前市售鲎试剂的灵敏度一般在0.03EU/ml～1.0EU/ml之间，所以λ max 选为1.0EU/ml，λ min 选为0.03EU/ml，当L表示为EU/ml时:C max =C 0 ·λ max /L C min =C 0·λ min /L……C 0 为供试品原液的浓度。
因此，羟乙基淀粉40氯化钠注射液(规格500ml、6%)的有效浓度范围计算如下:C max=C 0 ·λ max /L=6%×0.5/0.5=6%C min =C 0 ·λ min /L=6%×0.03/0.5=0.36%
2.3 干扰试验 [1]本试验对牡丹江温春双鹤药业有限责任公司生产的3批供试品进行了干扰试验。羟乙基淀粉40氯化钠注射液(规格500ml、6%)的有效浓度范围为0.36%～6%，因此，干扰试验起始浓度为6%;细菌内毒素检查的限值为每1ml含内毒素量不得过0.5EU。
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2.3.1 原液试验 直接取羟乙基淀粉40氯化钠注射液原液(即起始浓度6%)做为供试品溶液，批号020416304，020416305，020416306，采用0.5EU/ml规格的鲎试剂按中国药典(二部) [2] 2000年版细菌内毒素检查法进行试验。试验结果:三个不同批号羟乙基淀粉40氯化钠注射液的原液，在四个浓度细菌内毒素的试验中，结果均为阴性，供试品阴性对照也均为阴性。因此，根据上述试验，结果表明采用λ为0.5EU/ml规格的鲎试剂试验，本品在起始浓度6%时有干扰行为。因此需使用更灵敏的鲎试剂，对供试品进行更大稀释倍数的干扰试验。
2.3.2 1倍稀释液试验 取羟乙基淀粉40氯化钠注射液的1倍稀释液(即取供试品与细菌内毒素检查用水按1:1进行混合)做为供试品溶液(即有效稀释浓度为3%)，供试品批号为020416304，020416305，020416306，采用0.25EU/ml规格的鲎试剂按中国药典(二部) [2] 2000年版细菌内毒素检查法进行试验。试验结果:三个不同批号羟乙基淀粉40氯化钠注射液按1:1稀释后，在四个浓度细菌内毒素的试验中，结果均为阴性，供试品阴性对照也均为阴性。因此，根据上述试验，结果表明样品按1:1稀释后，采用λ为0.25EU/ml规格的鲎试剂试验，本品在有效浓度3%时有干扰行为。因此需使用更灵敏的鲎试剂，对供试品进行更大稀释倍数的干扰试验。
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2.3.3 4倍稀释液试验 取羟乙基淀粉40氯化钠注射液的4倍稀释液(即取供试品与细菌内毒素检查用水按1:3进行混合)做为供试品溶液(即有效稀释浓度为1.5%)，供试品批号为020416304，020416305，020416306，采用0.125EU/ml规格的鲎试剂按中国药典(二部) [2] 2000年版细菌内毒素检查法进行试验。试验结果见表1、表2、表3。
实验数据处理:实验结果在细菌内毒素最大浓度(2λ)4管全为阳性，最小浓度(1/4λ)4管全为阴性，按下式计算Et:
Et=lg -1 々Et4=1g -1 (-0.903)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)4 =1g -1 (-0.903) =0.125EU/ml
实验数据处理:实验结果在细菌内毒素最大浓度(2λ)4管全为阳性，最小浓度(1/4λ)4管全为阴性，按下式计算Et:
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Et=lg -1 々Et4=1g -1 (-0.903)+(-0.903)+(-1.204)+(-0.903)4 =1g -1 (-0.97825)=0.095EU/ml
表1 批号为020416304羟乙基淀粉40氯化钠注射液4倍稀释液干扰试验
表2 批号为020416305羟乙基淀粉40氯化钠注射液4倍稀释液干扰试验
表3 批号为020416306羟乙基淀粉40氯化钠注射液4倍稀释液干扰试验
实验数据处理:实验结果在细菌内毒素最大浓度(2λ)4管全为阳性，最小浓度(1/4λ)4管全为阴性，按下式计算Et:
Et=lg -1 々Et4=1g -1 (-0.903)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)4 =1g -1 (-0.903) =0.125EU/ml
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根据上述三批供试品的干扰试验，结果表明因采用λ为0.125EU/ml规格的鲎试剂试验，Es=0.105EU/ml，在0.5λ～2.0λ之间，且Et在0.5Es～2.0Es之间，故羟乙基淀粉40氯化钠注射液在采用4倍稀释即有效稀释浓度为1.5%时不干扰试验。
3 讨论
根据本实验对羟乙基淀粉40氯化钠注射液的三个批 号:020416304，020416305，020416306，在鲎试剂来源及供试品的配方或生产工艺未改变前提下进行了干扰试验，实验结果表明本品在起始浓度6%及样品按1:1稀释时有干扰行为，因此需使用更灵敏的鲎试剂，对供试品进行更大稀释倍数的干扰试验。该品种在4倍稀释后即浓度在1.5%时不干扰细菌内毒素试验，所以，该品种可使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂，将样品按1:3稀释后，按细菌内毒素检查法检查是可行的。
参考文献
1 中国药品生物制品检定所.细菌内毒素检查法.中国药品检验标准操作规程.北京:中国医药科技出版社，2000，389.
2 国家药典委员会.细菌内毒素检查法应用指导原则.中国药典(二部).北京:化学工业出版社，2000，附录，204.
作者单位:157041黑龙江省牡丹江温春双鹤药业有限责任公司
(编辑李年令), 百拇医药(窦学义)
为考察羟乙基淀粉40氯化钠注射液对鲎试验的干扰行为，本文采用鲎试剂检测羟乙基淀粉40氯化钠注射液的细菌内毒素。经干扰试验结果表明，样品原液及样品按1:1稀释后对鲎试验均有直接的抑制作用，样品按1:3稀释后可消除抑制作用。所以使用灵敏度0.125EU/ml的鲎试剂按细菌内毒素检查法检测是可行的。
1 试药与仪器
1.1 试药 鲎试剂(规格0.5EU/ml，批号为0201212，生产厂家为湛江安度斯生物有限公司;规格0.25EU/ml，批号为001213，生产厂家福州新北生化有限公司;规格0.125EU/ml，批号为0109243，生产厂家为湛江安度斯生物有限公司;鲎试剂灵敏度复核试验结果(Es)分别为0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.105EU/ml)细菌内毒素检查用水(规格2ml/支，批号为010201，生产厂家为福州新北生化工业有限公司)细菌内毒素工作标准品(规格70EU/支，批号为2001-3，生产厂家为中国药品生物检定所)羟乙基淀粉40氯化钠注射液(规格500ml/瓶、6%，批号为020416304，020416205，020416206，生产厂家为牡丹江温春双鹤药业有限责任公司，热原由兔法检查均合格)。
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1.2 仪器 电热恒温干燥箱、恒温水浴箱、超净工作台、旋涡混合器、所用玻璃器皿经三交热原灭活剂处理(于250℃干烤2h)。
2 试验方法
2.1 内毒素限值(L)的确定 在进行干扰试验前，首先确定了该品种的细菌内毒素限值:L=K/M;注射剂的K=5EU/(kg·h):M为人用最大剂量，以ml/(kg·h)表示，中国人均体重按60kg计算，即热原检查剂量，中国药典(二部)2000年版规定热原项检查取本品，剂量按家兔体重每10ml/kg注射，则:L=K/M=5EU/(kg·h)/10ml/(kg·h)=0.5EU/ml。因此，羟乙基淀粉40氯化钠注射液细菌内毒素检查的限值为每1ml含内毒素量不得超过0.5EU。
2.2 细菌内毒素干扰试验起始浓度及浓度范围的确定 进行干扰试验前，计算供试品进行内毒素检查时的最大浓度和最小浓度(未考虑干扰因素)，按以下公式进行计算:当L表示为EU/mg、EU/U时:C max =λ max /L，C min =λ min /L。
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目前市售鲎试剂的灵敏度一般在0.03EU/ml～1.0EU/ml之间，所以λ max 选为1.0EU/ml，λ min 选为0.03EU/ml，当L表示为EU/ml时:C max =C 0 ·λ max /L C min =C 0·λ min /L……C 0 为供试品原液的浓度。
因此，羟乙基淀粉40氯化钠注射液(规格500ml、6%)的有效浓度范围计算如下:C max=C 0 ·λ max /L=6%×0.5/0.5=6%C min =C 0 ·λ min /L=6%×0.03/0.5=0.36%
2.3 干扰试验 [1]本试验对牡丹江温春双鹤药业有限责任公司生产的3批供试品进行了干扰试验。羟乙基淀粉40氯化钠注射液(规格500ml、6%)的有效浓度范围为0.36%～6%，因此，干扰试验起始浓度为6%;细菌内毒素检查的限值为每1ml含内毒素量不得过0.5EU。
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2.3.1 原液试验 直接取羟乙基淀粉40氯化钠注射液原液(即起始浓度6%)做为供试品溶液，批号020416304，020416305，020416306，采用0.5EU/ml规格的鲎试剂按中国药典(二部) [2] 2000年版细菌内毒素检查法进行试验。试验结果:三个不同批号羟乙基淀粉40氯化钠注射液的原液，在四个浓度细菌内毒素的试验中，结果均为阴性，供试品阴性对照也均为阴性。因此，根据上述试验，结果表明采用λ为0.5EU/ml规格的鲎试剂试验，本品在起始浓度6%时有干扰行为。因此需使用更灵敏的鲎试剂，对供试品进行更大稀释倍数的干扰试验。
2.3.2 1倍稀释液试验 取羟乙基淀粉40氯化钠注射液的1倍稀释液(即取供试品与细菌内毒素检查用水按1:1进行混合)做为供试品溶液(即有效稀释浓度为3%)，供试品批号为020416304，020416305，020416306，采用0.25EU/ml规格的鲎试剂按中国药典(二部) [2] 2000年版细菌内毒素检查法进行试验。试验结果:三个不同批号羟乙基淀粉40氯化钠注射液按1:1稀释后，在四个浓度细菌内毒素的试验中，结果均为阴性，供试品阴性对照也均为阴性。因此，根据上述试验，结果表明样品按1:1稀释后，采用λ为0.25EU/ml规格的鲎试剂试验，本品在有效浓度3%时有干扰行为。因此需使用更灵敏的鲎试剂，对供试品进行更大稀释倍数的干扰试验。
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2.3.3 4倍稀释液试验 取羟乙基淀粉40氯化钠注射液的4倍稀释液(即取供试品与细菌内毒素检查用水按1:3进行混合)做为供试品溶液(即有效稀释浓度为1.5%)，供试品批号为020416304，020416305，020416306，采用0.125EU/ml规格的鲎试剂按中国药典(二部) [2] 2000年版细菌内毒素检查法进行试验。试验结果见表1、表2、表3。
实验数据处理:实验结果在细菌内毒素最大浓度(2λ)4管全为阳性，最小浓度(1/4λ)4管全为阴性，按下式计算Et:
Et=lg -1 々Et4=1g -1 (-0.903)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)4 =1g -1 (-0.903) =0.125EU/ml
实验数据处理:实验结果在细菌内毒素最大浓度(2λ)4管全为阳性，最小浓度(1/4λ)4管全为阴性，按下式计算Et:
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Et=lg -1 々Et4=1g -1 (-0.903)+(-0.903)+(-1.204)+(-0.903)4 =1g -1 (-0.97825)=0.095EU/ml
表1 批号为020416304羟乙基淀粉40氯化钠注射液4倍稀释液干扰试验
表2 批号为020416305羟乙基淀粉40氯化钠注射液4倍稀释液干扰试验
表3 批号为020416306羟乙基淀粉40氯化钠注射液4倍稀释液干扰试验
实验数据处理:实验结果在细菌内毒素最大浓度(2λ)4管全为阳性，最小浓度(1/4λ)4管全为阴性，按下式计算Et:
Et=lg -1 々Et4=1g -1 (-0.903)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)4 =1g -1 (-0.903) =0.125EU/ml
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根据上述三批供试品的干扰试验，结果表明因采用λ为0.125EU/ml规格的鲎试剂试验，Es=0.105EU/ml，在0.5λ～2.0λ之间，且Et在0.5Es～2.0Es之间，故羟乙基淀粉40氯化钠注射液在采用4倍稀释即有效稀释浓度为1.5%时不干扰试验。
3 讨论
根据本实验对羟乙基淀粉40氯化钠注射液的三个批 号:020416304，020416305，020416306，在鲎试剂来源及供试品的配方或生产工艺未改变前提下进行了干扰试验，实验结果表明本品在起始浓度6%及样品按1:1稀释时有干扰行为，因此需使用更灵敏的鲎试剂，对供试品进行更大稀释倍数的干扰试验。该品种在4倍稀释后即浓度在1.5%时不干扰细菌内毒素试验，所以，该品种可使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂，将样品按1:3稀释后，按细菌内毒素检查法检查是可行的。
参考文献
1 中国药品生物制品检定所.细菌内毒素检查法.中国药品检验标准操作规程.北京:中国医药科技出版社，2000，389.
2 国家药典委员会.细菌内毒素检查法应用指导原则.中国药典(二部).北京:化学工业出版社，2000，附录，204.
作者单位:157041黑龙江省牡丹江温春双鹤药业有限责任公司
(编辑李年令), 百拇医药(窦学义)