人参皂苷及其三醇对白血病细胞增殖抑制、凋亡和药敏的研究
【摘要】 目的 观察人参总皂苷(GS)及其三醇(GPT)对白血病祖细胞增殖抑制、诱导凋亡及化疗药物的协同作用，寻找GS中抗白血病的有效成分。方法 从人参提取GS，再分离出有效成分GPT;用白血病原代细胞与细胞株进行半固体祖细胞集落培养和液体培养，经GS或GPT处理后，采用MTT试验、流式细胞术、Annexin V试验和DNA片段电泳分析及药敏试验等方法检测。结果 (1)GS对白血病祖细胞的促进和抑制增殖的作用呈剂量依赖性，即小剂量刺激正常和白血病祖细胞增殖，中等剂量仍促进正常集落增加，但抑制白血病集落生长。(2)GS与化疗药高三尖杉酯碱、阿糖胞苷、阿霉素和足叶乙苷具有协同增敏作用，小剂量就能增强化疗药物的杀伤作用1.84～2.23倍，并使部分药敏试验由原先的不敏感转为敏感。(3)50mg/L的GS使化疗药物对K562/VCR、K562/Adr两耐药细胞株的抑制作用明显，且随着GS浓度的升高而逐渐增强。(4)50mg/L的GS作用于HL-60细胞3d能够诱导其凋亡，Annexin V阳性细胞率明显增高，并出现典型的DNA梯形条带。(5)GPT20mg/L低浓度能够显著地刺激K562细胞增殖，中浓度50mg/L时则抑制细胞增殖。GPT分别与化疗药物高三尖杉酯碱、阿糖胞苷联合应用时，对K562细胞的抑制作用明显增强。结论 不同剂量的GS及GPT对白血病祖细胞具有刺激增殖与抑制生长的双向效应，即小剂量时通过刺激增殖而增强化疗药物的杀伤作用，中等剂量则诱导白血病细胞凋亡。提示GPT是人参皂苷内抗白血病的有效成分，可为临床用作白血病的辅助治疗提供依据。
, http://www.100md.com
关键词 人参皂苷 人参三醇 白血病细胞 凋亡 药敏试验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)02-0097-04
Effects of ginsenosides and panaxatriol extracted
from ginseng on inhibition of proliferation，inducing apoptosis and
cytotoxic drug sensitivity in leukemic cells
Gao Ruilan，Lin Xiaojie，Qian Xudai，etal.
Affiliated Hospital of Zhejiang College of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou310006.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate if growth suppression and apoptosis ofleukemic progenitor cells can be induced by ginsenosides(GS)or panaxatriol(GPT)for exploring the effective components on leukemia within GS.Methods The components of GPT were purified from GS that were extracted from ginseng herb.Both primary leukemia progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia and cell lines of K562/VCR，K562/Adr(resisted to cytotoxic drugs)，HL-60，Meg-01，K562were incubated in semi-solid or liquid culture system.After being treated by GS or GPTwith various concentrations，the leukemia cells were observed for their proliferation，apoptosis and sensitivity of chemotherapy drugs by usingMTT assay，flow cytometry，Annexin V analysis，DNA ladder and drug sensiˉtive test.Results(1)GS displayed two activities of suppression and stimulation in proliferation of leukemic cells deˉpending on dose applied.Both normal and leukemic progenitor cells were susceptible to low concentration of GS to proˉliferate and increase the colony numbers.The leukemic progenitor cells were obviously suppressed by medium concenˉtration of GS to decrease their colony numbers although growth of normal progenitor cells was still prompted.(2)In combination of GS with any one of chemotherapeutic drugs-homoharringtonin，cytarabine，adriamycin and etoposidi，the leukemic progenitor cells became more sensitive to cytotoxic drugs，Theinhibition rates of colony number were at1.84～2.23fold as more as those of non-GS control by four kinds of cytotoxic drugs respectively.Most interestingly，partial of drug sensitive tests also could be reversed by GS from resistance to sensitivity.(3)In combination of GS50mg/L with cytotoxic drugs，K562/VCR and K562/Adr cells became more sensitive to low concentration of cytotoxic drugs.The suppression effects of GS were obviously in dose-dependence manner.(4)The apoptosis of HL-60cells could be specifically induced by GS50mg/L for3days displaying Annexin V positive cells with flow-cytomery and DNA fragments ladder on gel electrophoresis.(5)The proliferation of K562cells could be enhanced obviously at low dosage of GPT20mg/L，while medium concentration of50mg/L GPT exerted inhibitory effects on cells significantly.The synergetic inhibition effects of GPT with cytotoxic drugs-homoharingtonin，cytarabine and etoposide on leukemic cells were obviously observed with high inhibition rates.Conclusion GS or GPT displayed both suppression and stimˉulation activities on leukemic cells depending on dosage applied.Both GS and GPT at low dose could drive non-cyˉcling leukemic progenitors into cell cycle，thereby potentiate their susceptibility to cytotoxic drugs.Meanwhile，GS could specifically induce apoptosis of leukemic cells at its medium concentrations.It suggested that GPT is an efficient component for anti-leukemia within ginsenosids.Our results might provide reliable evidence for clinicaltrial as GPT-assistant chemotherapy drugs.
, 百拇医药
Key words ginsenosides panaxatriol leukemic progenitor cells apoptosis cytotoxic drug sensitivity
近年来有关人参及其皂苷抗肿瘤作用的研究表明对肿瘤细胞具有抑制生长、诱导分化等作用 [1～3] ，我们以前的研究表明，人参总皂苷(GS)对白血病祖细胞具有双向作用，低浓度时通过刺激白血病祖细胞增殖而增加对化疗药物的敏感性，中等浓度仍促进正常祖细胞生长，但抑制白血病祖细胞增殖，其原因未明 [4] 。由于总皂苷的成分还较复杂，为了解GS中抗白血病的有效成分，本文从人参中提取GS，再从GS中分离出有效成分人参三醇(GPT)用作研究。应用造血祖细胞半固体集落培养、流式细胞术、药敏试验、细胞凋亡检测等多种实验方法，观察GS及GPT对白血病细胞抑制增殖、诱导凋亡和增加药敏的作用，以寻找GS中抗白血病的有效成分。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 研究用药 GS干粉剂由本院中药研究室从人参中提取，纯度为81.6%。又从GS分离出有效成分GPT，经测定含量为75.8%。将GS或GPT配制成1g/L的工作液，无菌过滤，4℃保存备用。
1.2 液相—半固体相二步法培养白血病祖细胞集落(CFU-AML) 急性髓细胞白血病(AML)患者的骨髓细胞先用20%的植物血凝素—白细胞条件培养液(PHA-LCM)作刺激因子孵育20h，然后加入琼脂进行半固体集落培养，含20%小牛血清、10%PHA-LCM、0.3%琼脂和2×10 5/ml骨髓有核细胞。培养体系分别加入不同浓度的GS或GPT。置37℃，5%CO 2 中培养7d后，计数白血病集落数(>40个细胞)。
1.3 白血病细胞药敏试验 选择临床上常用治疗AML的四种化疗药物高三尖杉酯碱(HHr)1mg/L、阿糖胞苷(Ara)55mg/L，阿霉素(Adr)5.5mg/L和足叶乙甙(Vp-16)50mg/L，分别与白血病细胞作用1h，洗去化疗药后作CFU-AML集落培养。以药物对CFU-AML集落的抑制率>30%作为对该药物敏感的标准。
, http://www.100md.com
1.4 DNA梯形条带电泳分析 细胞经冷PBS洗涤后，用裂解液(1%NP-40、0.5M EDTA、1M Tris.HCl，pH7.5)破碎细胞，离心沉淀后，取上清100μl。加入RNase A(3mg/L)和1%SDS，56℃作用2h，再用蛋白酶K(2mg/L)37℃作用3h。经乙酸钠和无水乙醇沉淀DNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳2～3h，紫外光下观察并摄影。
1.5 Annexin V分析凋亡细胞百分率 细胞经冷PBS洗涤后，悬浮于100μl结合缓冲液(10mM HEPES/NaOH、140mM NaCl、2.5mM CaCl 2 ，pH7.4)，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI，混匀后孵育15min，用流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞比例。
1.6 GS对K562/VCR、K562/Adr两耐药细胞的抑制作用 细胞株由中国医学科学院血液病研究所提供，其中K562/VCR培养基含长春新碱(VCR)2mg/L，K562/Adr培养基含阿霉素(Adr)2mg/L。加入GS的终浓度分别为0、5、20、35、50、75、100mg/L，并分别针对细胞加VCR(2mg/L)或Adr(2mg/L)，药物处理细胞72h。在终止培养前4h加MTT试剂2μl(5g/L)/孔，离心去上清，再加DMSO150μl，振荡使沉淀完全溶解，在酶标仪570nm处测吸光度(OD值)。K562/VCR、K562/Adr白血病祖细胞集落培养的方法同上。
, http://www.100md.com
1.7 GPT对白血病K562细胞的抑制和药敏试验 在K562细胞培养体系中加入GPT，终浓度分别为0、10、20、50和100mg/L。采用半固体集落培养观察GPT对K562祖细胞集落增殖(CFU-K562)的抑制作用，方法同上。MTT法观察GPT与化疗药物的协同作用，液体培养分为GPT10mg/L组、单用化疗药物组分别为HHr、Ara和Vp-16、GPT联合化疗药物组和无GPT的对照组。细胞与药物共同孵育72h后作MTT法检测。
2 结果
2.1 GS对白血病祖细胞具有刺激增殖与抑制生长的双向效应 采用白血病祖细胞集落形成培养法，观察GS对HL-60、Meg-01白血病细胞株和急性髓细胞白血病患者的骨髓细胞集落形成的抑制作用，同时与正常骨髓粒单祖细胞集落(CFU-GM)培养结果作比较。结果显示:(1)正常与白血病祖细胞对低浓度的GS(5～25mg/L)均有刺激增殖反应，集落形成数增加。GS使正常CFU-GM的集落提高(29.7±1.2)%(P<0.01)，同样也使HL-60与Meg-01白血病细胞的集落提高(26.1±3.8)%～(25.4±4.1)%(P均<0.01)。(2)中等浓度的GS(75mg/L)使正常CFU-GM集落提高(27.5±1.4)%(P<0.01);但抑制HL-60、Meg-01和CFU-AML集落生长，抑制率分别为(50.8±3.1)%、(25.1±3.8)%和(19.0±2.9)%(P均<0.01)。(3)高浓度的GS(100mg/L)对正常CFU-GM生长无明显影响;但对白血病祖细胞的抑制作用很明显，HL-60细胞不能形成集落，只能形成细胞簇(20个细胞);Meg-01和CFU-AML的集落数也减少(53.3±4.2)%和(28.9±3.9)%(P均<0.01)。
, 百拇医药
2.2 GS增加白血病对化疗药物的敏感性 采用白血病祖细胞集落形成(CFU-AML)药敏试验法，选用临床上治疗AML白血病常用的HHr、Ara、Adr和Vp-16四种化疗药物作药敏试验，并分别加入GS，观察GS与化疗药物的协同性。结果显示:(1)小剂量的GS刺激CFU-AML在体外增殖，集落数提高37.9%，并使化疗药物对CFU-AML的抑制率从原先的(30.4±5.0)%～(47.4±6.5)%，分别提高到(51.2±5.5)%～(62.0±5.7)%。(2)增强了化疗药物对白血病祖细胞的杀伤作用，与无GS的对照组相比，GS使四种化疗药物对白血病祖细胞生长的抑制作用增强1.84～2.23倍。(3)72项药敏试验(4种化疗药物×18例AML患者)中有17项经GS的作用后，由原先的不敏感转为敏感，即化疗药物对白血病祖细胞的抑制率从原先的<30%提高到>30%。
2.3 GS抑制白血病耐药细胞增殖和提高化疗药物的敏感性 选用K562/VCR、K562/Adr两耐药细胞株作为靶细胞，采用液体培养MTT分析法和半固体集落培养法观察不同浓度的GS对耐药细胞增殖的影响，及是否能提高耐药细胞对化疗药物的敏感性。结果显示:(1)MTT分析法显示单用低和中等浓度的GS(5～50mg/L)对细胞增殖无明显影响，但当浓度升高至75mg/L时，则抑制细胞增殖，两株细胞的吸光度分别为0.42±0.04与0.52±0.07，明显低于对照组的0.56±0.08与0.63±0.07(P分别<0.05与0.01)。(2)同样，GS75mg/L时，两株细胞生成的集落数分别为90.2±5.6与97.4±6.7，明显低于对照的133.8±10.1与144.6±7.5(P均<0.01)。(3)当GS与化疗药物联合应用时，在化疗药物浓度(1mg/L)不变的情况下，耐药细胞对化疗药物的敏感性与GS呈剂量依赖关系，即GS50mg/L时，化疗药物对两株细胞的抑制作用明显，MTT分析法的吸光度分别为0.41±0.17与0.49±0.07，明显低于单用化疗药的对照0.58±0.13与0.61±0.11(P均<0.01)。同样，两株细胞的集落生成分别为76.2±11.6与79.0±13.7，明显低于单用化疗药的对照136.2±20.2与152.6±24.8(P均<0.01)。而且随着GS浓度的升高，抑制作用逐渐增强。
, http://www.100md.com
2.4 GS诱导HL-60白血病细胞凋亡的作用 上述实验表明GS具有抑制白血病细胞增殖的作用，为了解GS是怎样作用于白血病细胞的，用流式细胞术、细胞DNA含量测定、DNA片段电泳，及Annexin V试验等方法，观察GPT诱导白血病细胞凋亡的作用。结果显示:(1)液体培养用GS50mg/L孵育HL-60细胞3、4和5d后，细胞生长抑制率分别为10.3%、25.5%和26.04%，与对照组相比差异具有显著性(P分别<0.05和<0.01)。(2)50mg/L的GS作用细胞3d后，镜下可见部分细胞染色质浓聚，形成致密的染色质团块，并沿核膜边缘聚集，胞质空泡化，继之核固缩，碎裂成大小不等的核物质，细胞膜包裹裂解的细胞核及细胞浆形成凋亡小体。(3)50mg/L的GPT作用细胞3d，DNA片段电泳分析出现典型的DNA梯形条带。(4)GPT50和100mg/L作用细胞3d后，Annexin V分析显示细胞凋亡率分别为5.18%和9.19%，明显高于对照组的0.25%(P<0.05)。(5)流式细胞术分析DNA含量可见G 0 /G 1 期细胞减少，G 2 /M期和S期细胞增多。同时直方图上呈现特征性的亚二倍体峰，即凋亡小峰(Ap峰)，且随GS剂量加大、作用时间延长而增高。
, http://www.100md.com
2.5 人参皂苷组分GPT增加白血病K562细胞对化疗药的敏感性 为了解GS中抗白血病细胞的有效成分，从GS进一步分离出多个皂苷组分，筛选出其中具有抗白血病效应的组分GPT作进一步研究。在液体、半固体集落培养中，以不同浓度的GPT处理K562白血病细胞分别为24h、48h、72h，用细胞生长曲线和集落形成率来观察GPT对白血病细 胞的增殖和抑制的效应，并用MTT法检测GPT与化疗药物的协同性。结果显示:(1)低浓度(10、20mg/L)的GPT能够显著地刺激K562细胞增殖，可见到细胞生长密集成团，优于对照组，呈正效应，且随着培养时间的延长而增殖作用明显，GPT组的细胞数高于对照组(P<0.01)。(2)中浓度(50mg/L)时使细胞增殖受抑，呈单个疏散型生长，且随着时间的延长而抑制作用明显，呈时间—效应依赖性。细胞经中浓度GPT处理72h时后，半固体培养集落形成率从246.5±16.3骤减至150.3±12.9/5×10 3 细胞(P<0.01)。(3)GPT分别与化疗药物HHr或Ara联合应用能增加对K562细胞的杀伤作用，抑制率为(88.4±2.7)%和(73.8±8.8)%，明显高于对照组的(49.3±9.3)%和(30.1±7.5)%(P均<0.01)。对低敏的Vp-16组也能使抑制率从原先的<10%提高到>50%。
, 百拇医药
3 讨论
本文结果提示GS对白血病祖细胞的作用不同于正常造血祖细胞，不同的浓度显示为刺激增殖与抑制生长的双向作用，即小剂量刺激正常和白血病祖细胞增殖，中等剂量仍促进正常集落增加，但抑制白血病集落生长，大剂量的GS则对正常CFU-GM生长仍无明显影响，但抑制白血病祖细胞的作用却非常明显。
观察GS与化疗药物的协同作用，小剂量的GS通过刺激CFU-AML在体外增殖，从而增强了化疗药物对白血病祖细胞的杀伤作用1.84～2.23倍，同时部分药敏由原先的不敏感转为敏感。鉴于在体外集落内的白血病细胞在体内均处于细胞增殖周期中，容易被化疗药物杀伤 [5]，因此设想应用小剂量GS可使体内更多的静止期细胞进入增殖周期，从而增加患者的白血病细胞对化疗药物的敏感性，而应用中高剂量的GS则在某种程度上能够直接地抑制白血病和肿瘤细胞。
MTT分析法和集落形成试验均显示当GS与化疗药物联合应用时，在化疗药物浓度不变的情况下，GS通过提高K562/VCR、K562/Adr耐药细胞对化疗药物的敏感性，而与化疗药物起协同作用。同时GS在一定浓度下，则能直接地抑制白血病耐药细胞的增殖。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的机制较复杂，但以P-gp蛋白 [6] 、MRP蛋白表达增高为主 [7] ，其中胞膜的蛋白泵能把胞内的有毒物质排出胞外，减少胞内的细胞毒性，从而对化疗药物产生耐药，而钙拮抗剂能逆转K562/VCR、K562/Adr的耐药作用，使其对化疗药物敏感性增加;有作者报道人参皂苷也具有类似钙拮抗剂的效应 [8] ，因此推测GS可能通过钙拮抗剂抑制了细胞膜蛋白泵的功能，使白血病细胞内药物浓度增加而抑制细胞生长。
, 百拇医药
我们也观察到GS具有诱导HL-60细胞凋亡的作用，使GS对白血病细胞抑制的原因得到一定程度的解释。说明GS不仅能刺激正常造血祖细胞增殖，还能诱导白血病细胞凋亡，具有“双向调节作用”。本文HL-60白血病细胞可通过GS诱导凋亡而引起死亡，表现明显的形态学特征，包括核固缩、膜成泡状和细胞皱缩。在凋亡早期，存在于细胞膜内层面的磷酰酯丝氨酸暴露在膜外面，Annexin V能特异地结合磷酰酯丝氨酸 [9] ，用流式细胞仪可检测出Annexin V阳性的凋亡细胞。本文结果提示在细胞凋亡后期，GS可使细胞内源性核酸酶活性增高，作用于DNA最敏感的部位，核小体之间连接部位的DNA切割形成180～200bp及其倍数的梯状片段 [10] 。
为了解GS中抗白血病的有效成分，我们从人参中提取GS，再从GS中分离出有效成分人参三醇(GPT)用作研究。结果显示低浓度的GPT与GS相同，能够显著地刺激K562细胞增殖，中浓度时使白血病细胞增殖受抑，且呈时间—效应依赖性。将GPT分别与化疗药物HHr或Ara联合应用能增加对K562细胞的杀伤作用，对低敏的Vp-16组也能使抑制率从原先的<10%提高到>50%。提示GPT是人参皂苷内抗白血病细胞的有效成分，这将为临床作为治疗白血病的辅助剂提供实验依据。
, 百拇医药
参考文献
1 Mochizuki M，Yoo YC，Matsuzawa K，et al.Inhibitory effect of tumor metastasis in mice by saponins，ginsenoside-Rb2，20(R)-and20(S)-ginsenoside-Rg3，of red ginseng.Biol Pharm Bull，1995，18:1197-1202.
2 易永林，李薇，郝秀智.人参茎叶总皂甙对58例急性非淋巴细胞白血病细胞的诱导分化作用.中国中西医结合杂志，1993，13(12):722-724.
3 Abdrasilov BS，Kim YuA，Nurieva RI，et al.The effects of total saponinsfrom Panax Ginseng C.A.Meyer on the intracellular signaling system in Ehrlich ascites tumor cells.Biochem&Mol Biol Inter，1996，38(3):519-526.
, http://www.100md.com
4 高瑞兰，牛泱平，Chong BH.人参总皂苷对白血病祖细胞作用实验观察.上海中医药杂志，1999，9:46-48.
5 高瑞兰，金锦梅，牛泱平，等.人参总皂苷增加白血病细胞对化疗药物的敏感性.中国中西医结合杂志，1999，19(1):17-19.
6 Borg AG，Burgess R，Green LM，et al.P-glycoprotein and multidrug resistance-associated protein，but not lung resistance protein，lower the intracellular daunorubicin accumulation in acute myeloid leukameic cells.Br J Haematol，2000，108:48-45.
7 Kiyoko Shinkai，Akedo H，Mukai M，et al.Inhibition of in vitro Tumor cell Invasion by Ginsenside Rg3.Jpn J Cancer Res，1996，87:357-362.
, 百拇医药
8 尚世丽.异搏定对白血病K562细胞耐药的逆转作用.中国医科大学学报，2000，29(3):56-58.
9 Vemes I，Haanen C，Steffens NH，et al.A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.J Immunol Methods，1995，184:39-46.
10 Hermann M，Lorenz MH，Voll R，et al.A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments.Nucleic Acid Research，1994，22(24):5505-5507.
基金项目:1.浙江省自然科学基金重大项目(200007)
2.中澳国际合作项目，受澳大利亚政府资助(IDP Education Australia2-8)
作者单位:310006浙江中医学院附属医院
澳大利亚新南威尔士大学血管和凝血中心
(收稿日期:2003-10-25)
(编辑维 兰), 百拇医药(高瑞兰 林筱洁 钱煦岱 陈小红 牛泱平 B.H.Ch)
, http://www.100md.com
关键词 人参皂苷 人参三醇 白血病细胞 凋亡 药敏试验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)02-0097-04
Effects of ginsenosides and panaxatriol extracted
from ginseng on inhibition of proliferation，inducing apoptosis and
cytotoxic drug sensitivity in leukemic cells
Gao Ruilan，Lin Xiaojie，Qian Xudai，etal.
Affiliated Hospital of Zhejiang College of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou310006.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate if growth suppression and apoptosis ofleukemic progenitor cells can be induced by ginsenosides(GS)or panaxatriol(GPT)for exploring the effective components on leukemia within GS.Methods The components of GPT were purified from GS that were extracted from ginseng herb.Both primary leukemia progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia and cell lines of K562/VCR，K562/Adr(resisted to cytotoxic drugs)，HL-60，Meg-01，K562were incubated in semi-solid or liquid culture system.After being treated by GS or GPTwith various concentrations，the leukemia cells were observed for their proliferation，apoptosis and sensitivity of chemotherapy drugs by usingMTT assay，flow cytometry，Annexin V analysis，DNA ladder and drug sensiˉtive test.Results(1)GS displayed two activities of suppression and stimulation in proliferation of leukemic cells deˉpending on dose applied.Both normal and leukemic progenitor cells were susceptible to low concentration of GS to proˉliferate and increase the colony numbers.The leukemic progenitor cells were obviously suppressed by medium concenˉtration of GS to decrease their colony numbers although growth of normal progenitor cells was still prompted.(2)In combination of GS with any one of chemotherapeutic drugs-homoharringtonin，cytarabine，adriamycin and etoposidi，the leukemic progenitor cells became more sensitive to cytotoxic drugs，Theinhibition rates of colony number were at1.84～2.23fold as more as those of non-GS control by four kinds of cytotoxic drugs respectively.Most interestingly，partial of drug sensitive tests also could be reversed by GS from resistance to sensitivity.(3)In combination of GS50mg/L with cytotoxic drugs，K562/VCR and K562/Adr cells became more sensitive to low concentration of cytotoxic drugs.The suppression effects of GS were obviously in dose-dependence manner.(4)The apoptosis of HL-60cells could be specifically induced by GS50mg/L for3days displaying Annexin V positive cells with flow-cytomery and DNA fragments ladder on gel electrophoresis.(5)The proliferation of K562cells could be enhanced obviously at low dosage of GPT20mg/L，while medium concentration of50mg/L GPT exerted inhibitory effects on cells significantly.The synergetic inhibition effects of GPT with cytotoxic drugs-homoharingtonin，cytarabine and etoposide on leukemic cells were obviously observed with high inhibition rates.Conclusion GS or GPT displayed both suppression and stimˉulation activities on leukemic cells depending on dosage applied.Both GS and GPT at low dose could drive non-cyˉcling leukemic progenitors into cell cycle，thereby potentiate their susceptibility to cytotoxic drugs.Meanwhile，GS could specifically induce apoptosis of leukemic cells at its medium concentrations.It suggested that GPT is an efficient component for anti-leukemia within ginsenosids.Our results might provide reliable evidence for clinicaltrial as GPT-assistant chemotherapy drugs.
, 百拇医药
Key words ginsenosides panaxatriol leukemic progenitor cells apoptosis cytotoxic drug sensitivity
近年来有关人参及其皂苷抗肿瘤作用的研究表明对肿瘤细胞具有抑制生长、诱导分化等作用 [1～3] ，我们以前的研究表明，人参总皂苷(GS)对白血病祖细胞具有双向作用，低浓度时通过刺激白血病祖细胞增殖而增加对化疗药物的敏感性，中等浓度仍促进正常祖细胞生长，但抑制白血病祖细胞增殖，其原因未明 [4] 。由于总皂苷的成分还较复杂，为了解GS中抗白血病的有效成分，本文从人参中提取GS，再从GS中分离出有效成分人参三醇(GPT)用作研究。应用造血祖细胞半固体集落培养、流式细胞术、药敏试验、细胞凋亡检测等多种实验方法，观察GS及GPT对白血病细胞抑制增殖、诱导凋亡和增加药敏的作用，以寻找GS中抗白血病的有效成分。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 研究用药 GS干粉剂由本院中药研究室从人参中提取，纯度为81.6%。又从GS分离出有效成分GPT，经测定含量为75.8%。将GS或GPT配制成1g/L的工作液，无菌过滤，4℃保存备用。
1.2 液相—半固体相二步法培养白血病祖细胞集落(CFU-AML) 急性髓细胞白血病(AML)患者的骨髓细胞先用20%的植物血凝素—白细胞条件培养液(PHA-LCM)作刺激因子孵育20h，然后加入琼脂进行半固体集落培养，含20%小牛血清、10%PHA-LCM、0.3%琼脂和2×10 5/ml骨髓有核细胞。培养体系分别加入不同浓度的GS或GPT。置37℃，5%CO 2 中培养7d后，计数白血病集落数(>40个细胞)。
1.3 白血病细胞药敏试验 选择临床上常用治疗AML的四种化疗药物高三尖杉酯碱(HHr)1mg/L、阿糖胞苷(Ara)55mg/L，阿霉素(Adr)5.5mg/L和足叶乙甙(Vp-16)50mg/L，分别与白血病细胞作用1h，洗去化疗药后作CFU-AML集落培养。以药物对CFU-AML集落的抑制率>30%作为对该药物敏感的标准。
, http://www.100md.com
1.4 DNA梯形条带电泳分析 细胞经冷PBS洗涤后，用裂解液(1%NP-40、0.5M EDTA、1M Tris.HCl，pH7.5)破碎细胞，离心沉淀后，取上清100μl。加入RNase A(3mg/L)和1%SDS，56℃作用2h，再用蛋白酶K(2mg/L)37℃作用3h。经乙酸钠和无水乙醇沉淀DNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳2～3h，紫外光下观察并摄影。
1.5 Annexin V分析凋亡细胞百分率 细胞经冷PBS洗涤后，悬浮于100μl结合缓冲液(10mM HEPES/NaOH、140mM NaCl、2.5mM CaCl 2 ，pH7.4)，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI，混匀后孵育15min，用流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞比例。
1.6 GS对K562/VCR、K562/Adr两耐药细胞的抑制作用 细胞株由中国医学科学院血液病研究所提供，其中K562/VCR培养基含长春新碱(VCR)2mg/L，K562/Adr培养基含阿霉素(Adr)2mg/L。加入GS的终浓度分别为0、5、20、35、50、75、100mg/L，并分别针对细胞加VCR(2mg/L)或Adr(2mg/L)，药物处理细胞72h。在终止培养前4h加MTT试剂2μl(5g/L)/孔，离心去上清，再加DMSO150μl，振荡使沉淀完全溶解，在酶标仪570nm处测吸光度(OD值)。K562/VCR、K562/Adr白血病祖细胞集落培养的方法同上。
, http://www.100md.com
1.7 GPT对白血病K562细胞的抑制和药敏试验 在K562细胞培养体系中加入GPT，终浓度分别为0、10、20、50和100mg/L。采用半固体集落培养观察GPT对K562祖细胞集落增殖(CFU-K562)的抑制作用，方法同上。MTT法观察GPT与化疗药物的协同作用，液体培养分为GPT10mg/L组、单用化疗药物组分别为HHr、Ara和Vp-16、GPT联合化疗药物组和无GPT的对照组。细胞与药物共同孵育72h后作MTT法检测。
2 结果
2.1 GS对白血病祖细胞具有刺激增殖与抑制生长的双向效应 采用白血病祖细胞集落形成培养法，观察GS对HL-60、Meg-01白血病细胞株和急性髓细胞白血病患者的骨髓细胞集落形成的抑制作用，同时与正常骨髓粒单祖细胞集落(CFU-GM)培养结果作比较。结果显示:(1)正常与白血病祖细胞对低浓度的GS(5～25mg/L)均有刺激增殖反应，集落形成数增加。GS使正常CFU-GM的集落提高(29.7±1.2)%(P<0.01)，同样也使HL-60与Meg-01白血病细胞的集落提高(26.1±3.8)%～(25.4±4.1)%(P均<0.01)。(2)中等浓度的GS(75mg/L)使正常CFU-GM集落提高(27.5±1.4)%(P<0.01);但抑制HL-60、Meg-01和CFU-AML集落生长，抑制率分别为(50.8±3.1)%、(25.1±3.8)%和(19.0±2.9)%(P均<0.01)。(3)高浓度的GS(100mg/L)对正常CFU-GM生长无明显影响;但对白血病祖细胞的抑制作用很明显，HL-60细胞不能形成集落，只能形成细胞簇(20个细胞);Meg-01和CFU-AML的集落数也减少(53.3±4.2)%和(28.9±3.9)%(P均<0.01)。
, 百拇医药
2.2 GS增加白血病对化疗药物的敏感性 采用白血病祖细胞集落形成(CFU-AML)药敏试验法，选用临床上治疗AML白血病常用的HHr、Ara、Adr和Vp-16四种化疗药物作药敏试验，并分别加入GS，观察GS与化疗药物的协同性。结果显示:(1)小剂量的GS刺激CFU-AML在体外增殖，集落数提高37.9%，并使化疗药物对CFU-AML的抑制率从原先的(30.4±5.0)%～(47.4±6.5)%，分别提高到(51.2±5.5)%～(62.0±5.7)%。(2)增强了化疗药物对白血病祖细胞的杀伤作用，与无GS的对照组相比，GS使四种化疗药物对白血病祖细胞生长的抑制作用增强1.84～2.23倍。(3)72项药敏试验(4种化疗药物×18例AML患者)中有17项经GS的作用后，由原先的不敏感转为敏感，即化疗药物对白血病祖细胞的抑制率从原先的<30%提高到>30%。
2.3 GS抑制白血病耐药细胞增殖和提高化疗药物的敏感性 选用K562/VCR、K562/Adr两耐药细胞株作为靶细胞，采用液体培养MTT分析法和半固体集落培养法观察不同浓度的GS对耐药细胞增殖的影响，及是否能提高耐药细胞对化疗药物的敏感性。结果显示:(1)MTT分析法显示单用低和中等浓度的GS(5～50mg/L)对细胞增殖无明显影响，但当浓度升高至75mg/L时，则抑制细胞增殖，两株细胞的吸光度分别为0.42±0.04与0.52±0.07，明显低于对照组的0.56±0.08与0.63±0.07(P分别<0.05与0.01)。(2)同样，GS75mg/L时，两株细胞生成的集落数分别为90.2±5.6与97.4±6.7，明显低于对照的133.8±10.1与144.6±7.5(P均<0.01)。(3)当GS与化疗药物联合应用时，在化疗药物浓度(1mg/L)不变的情况下，耐药细胞对化疗药物的敏感性与GS呈剂量依赖关系，即GS50mg/L时，化疗药物对两株细胞的抑制作用明显，MTT分析法的吸光度分别为0.41±0.17与0.49±0.07，明显低于单用化疗药的对照0.58±0.13与0.61±0.11(P均<0.01)。同样，两株细胞的集落生成分别为76.2±11.6与79.0±13.7，明显低于单用化疗药的对照136.2±20.2与152.6±24.8(P均<0.01)。而且随着GS浓度的升高，抑制作用逐渐增强。
, http://www.100md.com
2.4 GS诱导HL-60白血病细胞凋亡的作用 上述实验表明GS具有抑制白血病细胞增殖的作用，为了解GS是怎样作用于白血病细胞的，用流式细胞术、细胞DNA含量测定、DNA片段电泳，及Annexin V试验等方法，观察GPT诱导白血病细胞凋亡的作用。结果显示:(1)液体培养用GS50mg/L孵育HL-60细胞3、4和5d后，细胞生长抑制率分别为10.3%、25.5%和26.04%，与对照组相比差异具有显著性(P分别<0.05和<0.01)。(2)50mg/L的GS作用细胞3d后，镜下可见部分细胞染色质浓聚，形成致密的染色质团块，并沿核膜边缘聚集，胞质空泡化，继之核固缩，碎裂成大小不等的核物质，细胞膜包裹裂解的细胞核及细胞浆形成凋亡小体。(3)50mg/L的GPT作用细胞3d，DNA片段电泳分析出现典型的DNA梯形条带。(4)GPT50和100mg/L作用细胞3d后，Annexin V分析显示细胞凋亡率分别为5.18%和9.19%，明显高于对照组的0.25%(P<0.05)。(5)流式细胞术分析DNA含量可见G 0 /G 1 期细胞减少，G 2 /M期和S期细胞增多。同时直方图上呈现特征性的亚二倍体峰，即凋亡小峰(Ap峰)，且随GS剂量加大、作用时间延长而增高。
, http://www.100md.com
2.5 人参皂苷组分GPT增加白血病K562细胞对化疗药的敏感性 为了解GS中抗白血病细胞的有效成分，从GS进一步分离出多个皂苷组分，筛选出其中具有抗白血病效应的组分GPT作进一步研究。在液体、半固体集落培养中，以不同浓度的GPT处理K562白血病细胞分别为24h、48h、72h，用细胞生长曲线和集落形成率来观察GPT对白血病细 胞的增殖和抑制的效应，并用MTT法检测GPT与化疗药物的协同性。结果显示:(1)低浓度(10、20mg/L)的GPT能够显著地刺激K562细胞增殖，可见到细胞生长密集成团，优于对照组，呈正效应，且随着培养时间的延长而增殖作用明显，GPT组的细胞数高于对照组(P<0.01)。(2)中浓度(50mg/L)时使细胞增殖受抑，呈单个疏散型生长，且随着时间的延长而抑制作用明显，呈时间—效应依赖性。细胞经中浓度GPT处理72h时后，半固体培养集落形成率从246.5±16.3骤减至150.3±12.9/5×10 3 细胞(P<0.01)。(3)GPT分别与化疗药物HHr或Ara联合应用能增加对K562细胞的杀伤作用，抑制率为(88.4±2.7)%和(73.8±8.8)%，明显高于对照组的(49.3±9.3)%和(30.1±7.5)%(P均<0.01)。对低敏的Vp-16组也能使抑制率从原先的<10%提高到>50%。
, 百拇医药
3 讨论
本文结果提示GS对白血病祖细胞的作用不同于正常造血祖细胞，不同的浓度显示为刺激增殖与抑制生长的双向作用，即小剂量刺激正常和白血病祖细胞增殖，中等剂量仍促进正常集落增加，但抑制白血病集落生长，大剂量的GS则对正常CFU-GM生长仍无明显影响，但抑制白血病祖细胞的作用却非常明显。
观察GS与化疗药物的协同作用，小剂量的GS通过刺激CFU-AML在体外增殖，从而增强了化疗药物对白血病祖细胞的杀伤作用1.84～2.23倍，同时部分药敏由原先的不敏感转为敏感。鉴于在体外集落内的白血病细胞在体内均处于细胞增殖周期中，容易被化疗药物杀伤 [5]，因此设想应用小剂量GS可使体内更多的静止期细胞进入增殖周期，从而增加患者的白血病细胞对化疗药物的敏感性，而应用中高剂量的GS则在某种程度上能够直接地抑制白血病和肿瘤细胞。
MTT分析法和集落形成试验均显示当GS与化疗药物联合应用时，在化疗药物浓度不变的情况下，GS通过提高K562/VCR、K562/Adr耐药细胞对化疗药物的敏感性，而与化疗药物起协同作用。同时GS在一定浓度下，则能直接地抑制白血病耐药细胞的增殖。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的机制较复杂，但以P-gp蛋白 [6] 、MRP蛋白表达增高为主 [7] ，其中胞膜的蛋白泵能把胞内的有毒物质排出胞外，减少胞内的细胞毒性，从而对化疗药物产生耐药，而钙拮抗剂能逆转K562/VCR、K562/Adr的耐药作用，使其对化疗药物敏感性增加;有作者报道人参皂苷也具有类似钙拮抗剂的效应 [8] ，因此推测GS可能通过钙拮抗剂抑制了细胞膜蛋白泵的功能，使白血病细胞内药物浓度增加而抑制细胞生长。
, 百拇医药
我们也观察到GS具有诱导HL-60细胞凋亡的作用，使GS对白血病细胞抑制的原因得到一定程度的解释。说明GS不仅能刺激正常造血祖细胞增殖，还能诱导白血病细胞凋亡，具有“双向调节作用”。本文HL-60白血病细胞可通过GS诱导凋亡而引起死亡，表现明显的形态学特征，包括核固缩、膜成泡状和细胞皱缩。在凋亡早期，存在于细胞膜内层面的磷酰酯丝氨酸暴露在膜外面，Annexin V能特异地结合磷酰酯丝氨酸 [9] ，用流式细胞仪可检测出Annexin V阳性的凋亡细胞。本文结果提示在细胞凋亡后期，GS可使细胞内源性核酸酶活性增高，作用于DNA最敏感的部位，核小体之间连接部位的DNA切割形成180～200bp及其倍数的梯状片段 [10] 。
为了解GS中抗白血病的有效成分，我们从人参中提取GS，再从GS中分离出有效成分人参三醇(GPT)用作研究。结果显示低浓度的GPT与GS相同，能够显著地刺激K562细胞增殖，中浓度时使白血病细胞增殖受抑，且呈时间—效应依赖性。将GPT分别与化疗药物HHr或Ara联合应用能增加对K562细胞的杀伤作用，对低敏的Vp-16组也能使抑制率从原先的<10%提高到>50%。提示GPT是人参皂苷内抗白血病细胞的有效成分，这将为临床作为治疗白血病的辅助剂提供实验依据。
, 百拇医药
参考文献
1 Mochizuki M，Yoo YC，Matsuzawa K，et al.Inhibitory effect of tumor metastasis in mice by saponins，ginsenoside-Rb2，20(R)-and20(S)-ginsenoside-Rg3，of red ginseng.Biol Pharm Bull，1995，18:1197-1202.
2 易永林，李薇，郝秀智.人参茎叶总皂甙对58例急性非淋巴细胞白血病细胞的诱导分化作用.中国中西医结合杂志，1993，13(12):722-724.
3 Abdrasilov BS，Kim YuA，Nurieva RI，et al.The effects of total saponinsfrom Panax Ginseng C.A.Meyer on the intracellular signaling system in Ehrlich ascites tumor cells.Biochem&Mol Biol Inter，1996，38(3):519-526.
, http://www.100md.com
4 高瑞兰，牛泱平，Chong BH.人参总皂苷对白血病祖细胞作用实验观察.上海中医药杂志，1999，9:46-48.
5 高瑞兰，金锦梅，牛泱平，等.人参总皂苷增加白血病细胞对化疗药物的敏感性.中国中西医结合杂志，1999，19(1):17-19.
6 Borg AG，Burgess R，Green LM，et al.P-glycoprotein and multidrug resistance-associated protein，but not lung resistance protein，lower the intracellular daunorubicin accumulation in acute myeloid leukameic cells.Br J Haematol，2000，108:48-45.
7 Kiyoko Shinkai，Akedo H，Mukai M，et al.Inhibition of in vitro Tumor cell Invasion by Ginsenside Rg3.Jpn J Cancer Res，1996，87:357-362.
, 百拇医药
8 尚世丽.异搏定对白血病K562细胞耐药的逆转作用.中国医科大学学报，2000，29(3):56-58.
9 Vemes I，Haanen C，Steffens NH，et al.A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.J Immunol Methods，1995，184:39-46.
10 Hermann M，Lorenz MH，Voll R，et al.A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments.Nucleic Acid Research，1994，22(24):5505-5507.
基金项目:1.浙江省自然科学基金重大项目(200007)
2.中澳国际合作项目，受澳大利亚政府资助(IDP Education Australia2-8)
作者单位:310006浙江中医学院附属医院
澳大利亚新南威尔士大学血管和凝血中心
(收稿日期:2003-10-25)
(编辑维 兰), 百拇医药(高瑞兰 林筱洁 钱煦岱 陈小红 牛泱平 B.H.Ch)