络病与心脑血管疾病相关性及治疗研究进展 通心络对高胆固醇诱导家兔动脉粥样硬化及主动脉VCAM-1 mRNAA表达量的影响
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黄元伟 教授
浙江大学医学院附属第一医院心内科教授、主任医师、博士生导师；善长心血管疑难重危病的诊治和相关的基础研究，尤其对高血压、冠心病的防治有较深的造诣；曾任中国医科院浙江分院心脑血管研究所所长，浙江医科大学附一院大内科主任，内科教研室主任；现任浙江省高教学会老教授医药专业委员会理事长，浙江医学会心血管学会副主任委员，《浙江大学学报》、《心脏杂志》副主编等职；已培养硕士毕业生25名、博士毕业生20名，在读博士生4名；曾获国家自然科学基金项目5个，卫生部“七五”及“九五”攻关项目2个(参加单位)；获浙江省科学进步奖或省医学科技进步奖12个；著有《临床血管学》等4本专著(均为主编)，在国家级及省级杂志上发表论文80余篇；享受国务院特殊津贴。
摘 要
目的：利用高胆固醇诱发的动脉粥样硬化模型观察通心络生药对预防家兔动脉粥样硬化的作用，并探讨其机制。
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方法：30只雄性健康家兔，随机分为三组：①对照组10只，喂以普通饲料；②高胆固醇组10只，喂以含1.5%胆固醇的饲料；③通心络组10只，喂以含1.5%胆固醇的饲料和通心络生药0.72g/kg/d。12周后测定：①血脂；②主动脉内膜/中膜厚度比值及斑块面积；③RT-PCR法检测主动脉中血管细胞黏附分子(VCAM-1) mRNA表达水平。
结果：通心络组和高胆固醇组的血清总胆固醇水平均显著高于对照组，通心络组低于高胆固醇组(P
<0.001)；与高胆固醇组相比，通心络组主动脉内膜/中膜厚度比值(0.57±0.06 比
1.06±0.09，P <0.001)，斑块面积 (38.93±3.42)% 比
(71.75±3.82)%，P <0.001，主动脉VCAM-1 mRNA表达量(以
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VCAM-1/GAPDH mRNA比值计算，0.59±0.15 比
0.91±0.18，P ＝ 0.001)均显著降低。
结论：通心络具有抗动脉粥样硬化作用，其降低血脂和主动脉组织VCAM-1 mRNA的表达水平可能是其作用机制之一。
目前，随着生活水平的提高和人口老龄化，心血管疾病发病率呈上升趋势，严重威胁人类健康，有关冠心病和动脉粥样硬化方面的研究已成为临床和基础研究的热点。通心络是由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蝉蜕、蜈蚣、赤芍、冰片等组成的中成药，很多临床研究表明该药对缓解冠心病心绞痛症状、改善心肌缺血有良好疗效，但有关该药对动脉粥样硬化的预防作用及其机制研究甚少。本实验旨在通过给家兔喂饲高胆固醇饲料，以建立家兔动脉粥样硬化模型，并观察通心络生药对预防家兔动脉粥样硬化的作用及探讨其可能的机制。
材料与方法
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主要仪器和试剂
仪器：PTC-150型PCR扩增仪(美国MJ RESEARCH INC公司)MDF-382E型超低温冰箱(-80℃)和医用低温冰箱(-20℃)(SANYO公司)3K18C型超速低温离心机(SIGMA公司)80-2109-98型核酸紫外分析仪(英国剑桥Pharmacia Biotech 公司)数码凝胶图像定量分析系统为ELECTROPHORESIS DOCUMENTATION AND ANALYSIS SYSTEM
120型(美国Kodak公司)。
试剂：胆固醇(广州南方化玻公司进口分装，批号20010830)；TRIzokRNA抽提试剂(GIBCO公司)，4℃保存；First-strand cDNA Synthesis kit(MBI Fermentas
公司)，-20℃保存；PCR引物(由上海生工生物工程公司合成)-20℃保存；Taq DNA PokymerasePromega公司，-20℃保存；琼脂糖(上海生工生物工程公司)；DNA分子量标记(100bp kadderMBI公司产品)，-20℃保存；溴化乙啶(EB
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10mg/mk，为Sigma公司产品)；甲醛、异丙醇、无水乙醇、氯仿等常规试剂(均为国产分析纯)。
动物模型制作与分组
雄性健康家兔30只(浙江省医学科学院实验动物中心提供)，体重(1.8～2.5)kg 随机分为三组：⑴
对照组10只，喂以普通饲料；⑵ 高胆固醇组10只，喂以含1.5%胆固醇的饲料；⑶
通心络组10只，喂以含1.5%胆固醇的饲料和通心络生药0.72g/kg/d 河北省石家庄以岭药业股份有限公司提供，蒸馏水稀释后灌胃。另两组等量蒸馏水灌胃。为期12周。
血脂测定
动物实验前和实验后第12周末采取静脉血，用酶法在全自动生化分析仪上测定血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL)的浓度。根据公式计算动脉硬化指数(AI)：AI＝(TC - HDL-C)/HDL-C。
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主动脉标本的制备及初步处理
12周后用戊巴比妥钠30mg/kg静脉麻醉动物，剖开胸腹腔，剥离主动脉全长，除去外膜脂肪组织，纵行切开，一半取主动脉弓及以下部分立即放入液氮中保存，随后再转入-80℃冰箱保存，并取升主动脉部分置入10%甲醛溶液中保存，进行常规 HE染色，显微镜下摄影；另一半置入油红O中染色，数码相机照相。照片经扫描仪处理后刻录至光盘，待进一步分析。
内膜、中膜厚度
及斑块面积测定方法
利用现代计算机图形学和计算机图像处理分析技术，分别定量测定血管内膜厚度、中膜厚度以及血管内膜粥样硬化斑块占整个血管面积的百分比。
血管内皮细胞间黏附分子mRNA
表达的测定
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采用RT-PCR方法测定血管内皮细胞间黏附分子mRNA的表达。
总RNA提取
按TRIzok试剂盒说明操作。在核酸紫外分析仪上测定RNA浓度和OD260/OD280比值，确定样品中RNA纯度，再经1%琼脂糖电泳证实RNA的完整性后，样本RNA置于-80℃冰箱中保存。
RNA逆转录 取总RNA 2 ug，严格按MBI Fermentas 公司First-strand cDNA Synthesis kit
说明书操作。产物置于-80℃保存，用于PCR扩增。
PCR反应 引物设计参照文献 (表1)。25uk反应体系中包括10×Buffer
2.5mk25mM Mgck2 2.5uk10mM dNTP(dATPdGTPdCTPdTTP各10mM)
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1.0ukDEPC处理水13.2uk每条引物各1uk(20pmok)共4ukTaq DNA Pokymeryse
0.3uk(1.5U),模板cDNA 1.5uk另加石蜡油12.5uk反应条件如表1。
表1.
RT-PCR法测定VCAM-1 mRNA的引物和反应条件
扩增基因
5′ 引物
3′ 引物
VCAM-1
5'-GAACACTCTTACCTGTGCCAGC-3'
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5'-CCATCCTCATAGCAATTAAGGTGAG-3'
(94℃
3min; 94℃ 30s,62℃ 1min,72℃ 2min,33 circles,72℃
8min)
GAPDH
5'-GCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTT-3'
5'-TGCCGAAGTGGTCGTGGATGACCT-3'
(94℃
3min,94℃ 30s,62℃ 1min,72℃ 2min,29 circles,72℃ 8min)
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电泳
取6uk PCR扩增产物，加2uk溴酚蓝，1.5%(质量浓度)琼脂糖凝胶板电泳60V×1h经Kodak公司120型数码凝胶图像定量分析系统成像，条带密度扫描，以GAPDH为内参照，测定各样本VCAM-1 mRNA 的相对表达量。
统计学方法
实验结果以均数±标准差(x±s)表示，数据处理采用统计软件SPSS10.0，在计算机上完成。两组间计量资料采用Independent-Sampke T Test多组间计量资料采用One-Way ANOVA 方法分析，以P
<0.05为统计学上差异显著。
结 果
实验过程中共有5只动物死亡，其中对照组2只，高胆固醇组1只，通心络组2只，4只由于灌胃时误入气管引起窒息，另1只死于皮肤破溃继发感染。
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实验前后各组动物体重及血脂水平比较
实验前三组动物的体重和各项血脂指标比较均无显著差异。由表2可见，第12周末，高胆固醇组和通心络组的血浆中TC、TG、AI均显著高于对照组，而通心络组TG、TC、AI低于高胆固醇组(P
<0.05或 P <0.01)。
表2
实验第12周末各组动物体重及血脂水平比较
组别
n
体重(kg)
TC(mmol)
, http://www.100md.com TG(mmol)
HDL(mmol)
AI
对照组
8
2.78±0.26
1.76±0.09
0.97±0.07
0.96±0.05
0.84±0.12
高胆固醇组
9
, 百拇医药 2.93±0.15
17.23±1.83
1.59±0.07
1.21±0.06
13.41±1.92
通心络组
8
2.96±0.19
15.36±1.26
1.50±0.06
1.27±0.07
11.17±1.42
, 百拇医药
F值
2.026
341.281
204.302
56.342
186.965
P值
0.156
0.000
0.000
0.000
0.000
注 与对照组比较 △P
<0.05 △△P <0.01；与高胆固醇组比较★P
<0.05 ，★★P <0.01
(未完待续), 百拇医药(浙江大学医学院附属第一医院心内科 黄元伟 王洪巨 黄元伟 教授 浙江大学医学院附属第一医院)