生防微生物生物技术研究与发展
作者：黄大昉 来源：中国农业科学院生物技术研究所
生防微生物的应用是植物病虫害综合治理的重要手段，是保护生态环境，实现农业可持续发展的有力保证。通过自然菌株选育开发微生物农药已有久远的历史，对于农业生产的发展起到了重要作用。但是，由于传统选育方法本身的局限与不足，其产业化发展仍然受到很大限制。现代生物技术的发展，特别是基因工程的应用，给农业微生物的研究注入了新的活力，现已成为微生物遗传改良的有效途径。
一、研究进展
1.苏云金芽孢杆菌基因工程及应用
苏云金芽孢杆菌(Bt)制剂是目前国内外产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂。Bt杀虫作用的主要机制是在其生长过程中产生不同类型的杀虫晶体蛋白(ICPs)。自1981年Schnepf分离了第一个cry基因以来 ，迄今全世界从Bt中发现并正式命名的ICP基因已有42大类，总数超过250种。在国家863计划的支持下，近年我国Bt分子生物学的研究发展迅速。1997以来已经克隆了28种ICP基因，占同期国际新记载Bt基因总数的1/3。除ICP以外，Bt以及蜡样芽孢杆菌营养生长阶段产生的另一种杀虫蛋白VIP亦引起了广泛注意，有的Vip基因对一些重要农业害虫更显特异性，因而具有很大的开发应用潜力。
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为了进一步提高Bt的杀虫效果，如延长持效期、扩大杀虫谱等，可以通过杀虫基因的修饰、改造、转移等基因工程手段构建新型的工程菌。在国外，已有Conder、MVP等10余种Bt工程菌制剂投入了商业应用。在我国，也开发出多种高效Bt和荧光假单胞菌的组合基因工程菌剂，其中WG001已于2000年通过安全性审批，允许生产和应用。
2.重组杆状病毒的构建
昆虫病毒资源非常丰富，目前世界上有记载的昆虫病毒超过1000种，已开发投入市场的产品有30多种。我国多年来也研制了20多种病毒杀虫剂，但除了棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)每年防治面积超过百万亩以外，其它病毒制剂应用规模都不很大。进一步提高病毒的毒力，缩短其侵染时间是扩大昆虫病毒生产应用的关键。国外近年尝试通过基因工程方法，将不同的外源杀虫基因导入野生型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)，有关研究取得了良好的进展。我国采用导入蝎神经毒素基因(AalT)和缺失蜕皮激素UTP葡萄糖苷转移酶(egt–)的策略，得到了杀虫速度明显加快的重组HaSNPV。大田试验结果显示，施用病毒制剂后棉铃虫幼虫LT50减少了1/4，取食量减少了2/3。
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3.昆虫真菌的遗传改良
在国际记载的800多种昆虫病原真菌中，应用效果最好的是白僵菌(Beauveria)和绿僵菌(Metarhizium)。这类微生物杀虫剂具有能多次感染害虫引起流行的优点，但也存在侵染过程易受环境因素影响、毒力发挥较慢等不足。昆虫真菌分子生物学和生物技术研究国内外起步稍晚，但近年来某些关键技术已取得突破。我国在国际上首次建立了球孢白僵菌(B. bassiana)的农杆菌转化体系，并从该菌中克隆了类枯草杆菌蛋白酶基因(Bbpr1)、几丁质酶基因(Bbchit1)和真菌孢子形成相关基因。新构建的含有前两种基因的工程菌较单一Bbpr1基因工程菌杀虫毒力提高近一倍，侵染致病时间缩短近一半。
4.新型病害生防制剂-Harpin的开发
Harpin是一类能激活、诱导植物保卫反应和产生系统抗性的新型蛋白，最早发现于梨火疫病菌(Erwinia amylovora)的侵染机理研究。由于这类蛋白具有作用机制独特、防病和促进植物生长效果显著和环境友好的突出优点，现已迅速开发成为一类新型的“绿色农药”并进入了国际市场。我国在水稻白叶枯病菌、水稻条斑病菌等多种细菌的研究中发现，Harpin不仅广泛存在，而且其基因结构具有丰富的遗传多样性。这就为这类激活蛋白作用机理的进一步研究和生防制剂的后续开发创造了良好的条件。
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5.抗生素产生菌的遗传操作
近年来，可产生许多重要抗生素的链霉菌的分子生物学研究取得了迅速的进展，有关基因簇克隆和遗传操作技术平台已经建立并日趋完善。其中，以链霉菌聚酮类抗生素的研究最为活跃。例如产生阿维菌素(Avermectin)的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的全基因组测序已接近完成，聚酮合酶(PKS)生物合成途径与主要功能已基本明确，这就为进一步利用分子生物学手段对该菌进行遗传改良打下了基础。目前国内通过缺失其生物合成途径中的一个关键酶(C5-0-甲基转移酶)而阻断支路代谢，获得了仅产B组分的工程菌。下一步的目标是构建仅产B1组分双氢还原物的伊维菌素(Ivermectin)。若能成功，不仅使这种微生物农药更加高效和低毒，还能大大简化工艺流程和降低生产成本，因而得到更加广泛的应用。
二、发展建议
为了促进生防微生物生物技术研究并尽快实现产业化，建议采取以下几项措施：
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1.加强基础研究，促进源头创新
要十分重视微生物资源的发掘和利用，更要大力加强微生物基础生物学和分子遗传学研究。当前，特别要借助于基因组学理论与技术的迅速发展，从高起点切入，适时开展重要生防微生物的结构基因和功能基因研究，以进一步揭示生防作用的分子机理，并鉴定和分离拥有自主产权的、可供遗传改良利用的新型功能基因。为了促进原始创新，建议科技部将“杀虫与防病微生物基因发掘和利用的基础研究”列入国家重点基础研究计划(973计划)。
2.确定研究重点，加快应用进程
与转基因植物相比，基因重组的微生物具有研究快速、生产方便、应用灵活、害虫不易产生抗性等诸多优点。建议将农业生产发展迫切需要，又可能在研究开发中取得较快突破的生防微生物研究课题列为“十五”863计划的重点，加大支持力度，使其早日实现产业化。另外，也要加强生物安全评价研究，确保基因重组的生防微生物产品对人类健康和生态环境如同自然菌剂一样安全。
3.革新生产工艺，改进加工剂型
除“上游”基因工程技术以外，也须不断改进现有的生产工艺，发展适用的加工剂型，尽快提高“下游”技术水平。这也是我国生物农药发展的主要技术“瓶颈”之一，突破这一瓶颈，对于提升我国生物农药的研制的整体水平，加快产业化进程至关重要。
4.调整研发结构，深化体制改革
要想从根本上扭转目前微生物农药企业规模小、资金少、研发力量弱、技术含量低的现状，唯有深化经济和科技体制，加快企业重组和“产学研”结合，构建具有我国特色的“产业链”。, 百拇医药
生防微生物的应用是植物病虫害综合治理的重要手段，是保护生态环境，实现农业可持续发展的有力保证。通过自然菌株选育开发微生物农药已有久远的历史，对于农业生产的发展起到了重要作用。但是，由于传统选育方法本身的局限与不足，其产业化发展仍然受到很大限制。现代生物技术的发展，特别是基因工程的应用，给农业微生物的研究注入了新的活力，现已成为微生物遗传改良的有效途径。
一、研究进展
1.苏云金芽孢杆菌基因工程及应用
苏云金芽孢杆菌(Bt)制剂是目前国内外产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂。Bt杀虫作用的主要机制是在其生长过程中产生不同类型的杀虫晶体蛋白(ICPs)。自1981年Schnepf分离了第一个cry基因以来 ，迄今全世界从Bt中发现并正式命名的ICP基因已有42大类，总数超过250种。在国家863计划的支持下，近年我国Bt分子生物学的研究发展迅速。1997以来已经克隆了28种ICP基因，占同期国际新记载Bt基因总数的1/3。除ICP以外，Bt以及蜡样芽孢杆菌营养生长阶段产生的另一种杀虫蛋白VIP亦引起了广泛注意，有的Vip基因对一些重要农业害虫更显特异性，因而具有很大的开发应用潜力。
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为了进一步提高Bt的杀虫效果，如延长持效期、扩大杀虫谱等，可以通过杀虫基因的修饰、改造、转移等基因工程手段构建新型的工程菌。在国外，已有Conder、MVP等10余种Bt工程菌制剂投入了商业应用。在我国，也开发出多种高效Bt和荧光假单胞菌的组合基因工程菌剂，其中WG001已于2000年通过安全性审批，允许生产和应用。
2.重组杆状病毒的构建
昆虫病毒资源非常丰富，目前世界上有记载的昆虫病毒超过1000种，已开发投入市场的产品有30多种。我国多年来也研制了20多种病毒杀虫剂，但除了棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)每年防治面积超过百万亩以外，其它病毒制剂应用规模都不很大。进一步提高病毒的毒力，缩短其侵染时间是扩大昆虫病毒生产应用的关键。国外近年尝试通过基因工程方法，将不同的外源杀虫基因导入野生型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)，有关研究取得了良好的进展。我国采用导入蝎神经毒素基因(AalT)和缺失蜕皮激素UTP葡萄糖苷转移酶(egt–)的策略，得到了杀虫速度明显加快的重组HaSNPV。大田试验结果显示，施用病毒制剂后棉铃虫幼虫LT50减少了1/4，取食量减少了2/3。
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3.昆虫真菌的遗传改良
在国际记载的800多种昆虫病原真菌中，应用效果最好的是白僵菌(Beauveria)和绿僵菌(Metarhizium)。这类微生物杀虫剂具有能多次感染害虫引起流行的优点，但也存在侵染过程易受环境因素影响、毒力发挥较慢等不足。昆虫真菌分子生物学和生物技术研究国内外起步稍晚，但近年来某些关键技术已取得突破。我国在国际上首次建立了球孢白僵菌(B. bassiana)的农杆菌转化体系，并从该菌中克隆了类枯草杆菌蛋白酶基因(Bbpr1)、几丁质酶基因(Bbchit1)和真菌孢子形成相关基因。新构建的含有前两种基因的工程菌较单一Bbpr1基因工程菌杀虫毒力提高近一倍，侵染致病时间缩短近一半。
4.新型病害生防制剂-Harpin的开发
Harpin是一类能激活、诱导植物保卫反应和产生系统抗性的新型蛋白，最早发现于梨火疫病菌(Erwinia amylovora)的侵染机理研究。由于这类蛋白具有作用机制独特、防病和促进植物生长效果显著和环境友好的突出优点，现已迅速开发成为一类新型的“绿色农药”并进入了国际市场。我国在水稻白叶枯病菌、水稻条斑病菌等多种细菌的研究中发现，Harpin不仅广泛存在，而且其基因结构具有丰富的遗传多样性。这就为这类激活蛋白作用机理的进一步研究和生防制剂的后续开发创造了良好的条件。
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5.抗生素产生菌的遗传操作
近年来，可产生许多重要抗生素的链霉菌的分子生物学研究取得了迅速的进展，有关基因簇克隆和遗传操作技术平台已经建立并日趋完善。其中，以链霉菌聚酮类抗生素的研究最为活跃。例如产生阿维菌素(Avermectin)的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的全基因组测序已接近完成，聚酮合酶(PKS)生物合成途径与主要功能已基本明确，这就为进一步利用分子生物学手段对该菌进行遗传改良打下了基础。目前国内通过缺失其生物合成途径中的一个关键酶(C5-0-甲基转移酶)而阻断支路代谢，获得了仅产B组分的工程菌。下一步的目标是构建仅产B1组分双氢还原物的伊维菌素(Ivermectin)。若能成功，不仅使这种微生物农药更加高效和低毒，还能大大简化工艺流程和降低生产成本，因而得到更加广泛的应用。
二、发展建议
为了促进生防微生物生物技术研究并尽快实现产业化，建议采取以下几项措施：
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1.加强基础研究，促进源头创新
要十分重视微生物资源的发掘和利用，更要大力加强微生物基础生物学和分子遗传学研究。当前，特别要借助于基因组学理论与技术的迅速发展，从高起点切入，适时开展重要生防微生物的结构基因和功能基因研究，以进一步揭示生防作用的分子机理，并鉴定和分离拥有自主产权的、可供遗传改良利用的新型功能基因。为了促进原始创新，建议科技部将“杀虫与防病微生物基因发掘和利用的基础研究”列入国家重点基础研究计划(973计划)。
2.确定研究重点，加快应用进程
与转基因植物相比，基因重组的微生物具有研究快速、生产方便、应用灵活、害虫不易产生抗性等诸多优点。建议将农业生产发展迫切需要，又可能在研究开发中取得较快突破的生防微生物研究课题列为“十五”863计划的重点，加大支持力度，使其早日实现产业化。另外，也要加强生物安全评价研究，确保基因重组的生防微生物产品对人类健康和生态环境如同自然菌剂一样安全。
3.革新生产工艺，改进加工剂型
除“上游”基因工程技术以外，也须不断改进现有的生产工艺，发展适用的加工剂型，尽快提高“下游”技术水平。这也是我国生物农药发展的主要技术“瓶颈”之一，突破这一瓶颈，对于提升我国生物农药的研制的整体水平，加快产业化进程至关重要。
4.调整研发结构，深化体制改革
要想从根本上扭转目前微生物农药企业规模小、资金少、研发力量弱、技术含量低的现状，唯有深化经济和科技体制，加快企业重组和“产学研”结合，构建具有我国特色的“产业链”。, 百拇医药