特应性皮炎和银屑病皮损部位花生四烯酸衍生的炎症介质水平与组胺水平研究
摘 要
特应性皮炎和银屑病中皮肤炎症的生物学过程尚不清楚。因为本病的一个显著特点是瘙痒，因此推测组胺可能参与了发病，然而抗组胺药物对本病的疗效甚微。相反，根据特应性皮炎的病理生理，使用皮质类固醇激素是合理的。花生四烯酸衍生的炎症介质(白三烯B4即LTB4；PGD2和PDE2)由于具有强有力的炎症活性，从而被认为与皮肤炎症的发生有关。在体外试验中皮质类固醇通过间接抑制磷酯酶A2的活性既可抑制花生四烯酸的环氧化酶代谢产物，又可抑制脂氧合酶代谢产物的生成，这一事实说明花生四烯酸在皮肤炎症中发挥重要作用。为此，我们采用负压法在特应性皮炎和银屑病皮损及正常部位吸疱，检测疱液中花生四烯酸衍生的炎症介质水平与组胺水平。
材料和方法
研究纳入特应性皮炎患者16例，男女各半，年龄13～69岁，特应性皮炎的诊断是根据Hanifin和Rajka等的标准做出的；银屑病患者9例，6男3女，年龄18～78岁，其中6例为慢性斑块性银屑病，2例为红皮病性银屑病，1例为点滴状银屑病。对照为12名志愿者，男女各6人，年龄21～72岁。所有受试者14天内均未用过药，其中一些特应性皮炎患者在筛选前一直使用润肤剂。用皮肤负压吸疱仪吸疱，特应性皮炎患者在皮炎好发部位吸疱，通常在肘窝进行。湿疹样皮损一般取急性炎症期。在湿疹性皮损部位，有时不能吸出完整水疱，在这种情况下就收集吸疱器中的液体。未受累部位通常在脐旁吸疱。正常受试者也在相应部位吸疱。疱液收集后迅速在液氮中冷冻，保存于零下70度直至分析。用放射免疫法测定疱液中花生四烯酸代谢产物PGD2、PGE2和LTB4水平。当有白蛋白时PGD2不稳定，待其转变为稳定的降解产物后再进行测定。
, 百拇医药
在进行放射免疫检测前，先用高压液相色谱法(HPLC)对来源于特应性皮炎疱液中的LTB4进行分离，然后再进行免疫反应，以确定是否为LTB4。按照Fitzpatrick等的方法进行HPLC检测，简要步骤为：先将特应性皮炎皮损部位获得的有LTB4样免疫反应的4份疱液混合(1 mk)，添加Tris-HCk缓冲液至10 mk，pH调至3.0，然后过C18-Sep Pak柱，用10 mk己烷洗脱，然后用8
mk甲基甲酸盐洗脱，该组分中即含有LTB4，最后用5
mk甲醇洗脱，该组分中含有硫化LTB4。将甲基甲酸盐洗脱的组分蒸馏、溶于甲醇，注射入C18-Nuckeosik柱。驱动相组成为甲醇：水：乙酸＝68：32：0.01，pH为5.5。收集1mk组分液，用放射免疫法测定免疫活性。用放射性酶促反应法测定疱液中组胺的水平。用纸片放射免疫吸收试验(PRIST)进行血清IgE测定。
结 果
, 百拇医药
皮肤中LTB4水平(图1)，健康志愿者疱液中检测不到具有LTB4样免疫活性物质，或者浓度很低，9个肘窝部位的水疱中，7个未检测到LTB4；12个腹部水疱中，10个也未检测到LTB4，该放射活性的检出值下限为194
pg/mk，仅2例可检出低水平LTB4(197～268
pg/mk)。同样，在特应性皮炎非受累部位的13个水疱中，8个未检测到LTB4，其余5个的LTB4浓度分别为199 pg/mk、283 pg/mk、291 pg/mk、299 pg/mk、388 pg/mk，平均为231±62
pg/mk。对未检测到的疱液LTB4浓度均估计为194
pg/mk。与此形成鲜明对比的是，特应性皮炎皮损部位水疱中LTB4水平明显升高。16个水疱中，只有5个未检测出LTB4，检出的最高值为1524 pg/mk，平均为426±85
, 百拇医药
pg/mk。皮损和非皮损部位的LTB4水平有显著差异(p<0.05
秩和检验)。LTB4水平与疾病严重程度(如病变范围、程度)无关。LTB4水平与血清IgE水平也无关。在所检测的13份血清标本中，10份有IgE升高。
图1. 特应性皮炎和银屑病患者以及健康志愿者疱液中的LTB4样免疫活性比较
在7个银屑病非皮损部位水疱中，5个LTB4放射活性在检出值以下，另外2个分别为373 pg/mk和730
pg/mk。相反，在9个受累部位水疱液中，仅1个LTB4放射活性在检出值以下，其余水疱液中LTB4值均在239～1042 pg/mk之间，平均为649±102
pg/mk。LTB4水平与银屑病类型、严重程度无关。用反相HPLC进一步分析LTB4，将4份特应性皮炎患者皮损部位水疱液混合，用HPLC进行分离，LTB4放射活性见于这1
, 百拇医药
mk混合液中。放射活性仅见于LTB4的洗脱部分，这样就排除了与12-羟二十碳烯酸(12-HETE)和花生四烯酸交叉反应的可能(图2)。
图2. 特应性皮炎患者疱液的反相高压液相色谱法分离结果
洗脱液的LTB4样免疫活性通过对LTB4抗体-LTB4标准品反应的抑制来测定，LTB4的洗脱时间与LTB4标准品的洗脱时间一致。箭头所示为LT标准样品的洗脱位置。
特应性皮炎皮损部位疱液中组胺水平为2.71±0.59 ng/mk，非皮损疱液中为2.66±0.23 ng/mk。银屑病皮损和非皮损部位疱液中组胺水平分别为2.32± 0.23 ng/mk和2.98±0.46 ng/mk。以上两组间均无统计学差异(表1)。表1. 负压吸疱的疱液中组胺水平(均数±标准差)
组别
, 百拇医药
组胺浓度(ng/ml)
正常人
肘窝
3.11±0.48
腹部
2.25±0.20
特应性皮炎
皮损
2.71±0.59
非皮损
2.66±0.23
银屑病
, 百拇医药
皮损
2.32±0.23
非皮损
2.08±0.46
讨 论
为探索特应性皮炎时皮肤炎症局部的生物学变化，检测了负压吸疱的疱液中几种强炎症介质PGD2、PGE2、LTB4和组胺的浓度。健康志愿者疱液中未能检出花生四烯酸的5-脂氧合酶代谢产物LTB4，即使检出其水平也很低。特应性皮炎非皮损部位也类似。相反，特应性皮炎皮损部位水疱中LTB4水平明显升高，LTB4水平与疾病严重程度和血清IgE水平均无关。另一方面，特应性皮炎非皮损部位花生四烯酸的环氧合酶代谢产物在正常范围，PGE2水平在各组中几乎相同，PGD2则检测不到。银屑病患者结果也类似，未受累皮肤LTB4含量很低或检测不到，而皮损处LTB4则很高，甚至超过特应性皮炎皮损处。LTB4含量与银屑病类型无相关性。未检测到PGD2，PGE2则在正常范围。以上各组患者皮肤中组胺水平也均在正常范围。
, 百拇医药
本试验结果支持糖皮质激素对特应性皮炎和银屑病的疗效。因为糖皮质激素可抑制环氧化酶和5-脂氧合酶，至少在体外试验如此。
Brain和Grabbe等首次发现斑块状银屑病皮损处LTB4水平升高，本试验结果与Brain和Grabbe等的报告相似。然而该现象并非银屑病特有，因为在特应性皮炎中也可升高。这一发现可能具有病理学意义。虽然LTB4为嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的趋化因子，但局部外用LTB4后仅可诱导早期嗜中性粒细胞向表皮和真皮浸润，而这种变化缺少银屑病特征。稍后，可见以单个核细胞为主的浸润，提示在特应性皮炎中LTB4有可能趋化单个核细胞到达炎症局部。
LTB4对正常人单个核细胞有趋化活性，而在特应性皮炎这种作用则增强。Czarnetzki等发现，特应性皮炎和银屑病的单个核细胞对LTB4的反应性增高，这可以解释在特应性皮炎局部主要为单个核细胞的聚集。因为单个核细胞很可能为真皮内LTB4的主要来源(但根据本研究的结果，也不能排除角质形成细胞)，这样在特应性皮炎局部，单个核细胞自己产生LTB4，而LTB4又吸引更多巨噬细胞，如此形成循环性放大效应，这一过程可能为特应性皮炎的重要机制之一。LTB4水平升高无疾病特异性，特应性皮炎和银屑病等炎症性皮肤病LTB4均可升高，这一点并不奇怪，也不影响LTB4在特应性皮炎和银屑病发病机制中的重要作用。由于糖皮质激素对这些疾病都有效，因此，这些皮肤病的生物学过程可能都类似，也进一步提示花生四烯酸参与了发病过程。其他因子可能与其他某些疾病表现有关。不过组胺在特应性皮炎发病中发挥的作用可能较小。
, 百拇医药
特应性皮炎皮损疱液中组胺水平在正常范围内，这与本研究者最近对特应性皮炎皮损活检标本进行的组胺检测结果一致。仅在1例高IgE综合征患者中发现组胺水平升高。既往曾报告过特应性皮炎皮损的组胺水平升高，但他们所用的方法特异性差。本研究者也曾经发现，在特应性皮炎的急性期，血浆组胺水平有所升高，但在疾病缓解后又恢复正常。
最近，有人提出这样的问题：在负压吸疱形成的疱液中，LTB4样免疫反应是否存在与花生四烯酸或其12-脂氧合酶代谢物12-HETE的交叉反应，因为Hammarstrom等曾经报告银屑病皮损中有12-HETE。本研究者认为这种可能性不大，其理由是：①用反相HPLC分开混合疱液各组分后，有LTB4样免疫反应的组分正好与LTB4标准品在同一分子位置；②抗LTB4抗体与花生四烯酸或12-HETE仅有微弱的交叉反应，因此只有存在很高浓度的这类物质才能形成对LTB4放射免疫反应的干扰，但如此高的浓度也必然引起与PGD2和PGE2发生交叉反应，而后一种情况并未观察到。
Dieksmeier等通过试验发现，特应性皮炎皮损部位有LTB4的趋化活性，但在非皮损部位则无。
总之，特应性皮炎皮损部位LTB4水平升高，因为LTB4具有很强的致炎活性，因此这种变化可能在本病的发病机制中发挥重要作用。可有效治疗特应性皮炎的糖皮质激素可能有LTB4合成抑制作用，但由于糖皮质激素的作用特异性不强，因此只有在选择性LTB4合成抑制剂或选择性LTB4拮抗剂问世后，才可能真正阐明LTB4在皮肤炎症中的作用。, 百拇医药(张建中 摘译自J Invest Dermatol 1986,86:105-108)
特应性皮炎和银屑病中皮肤炎症的生物学过程尚不清楚。因为本病的一个显著特点是瘙痒，因此推测组胺可能参与了发病，然而抗组胺药物对本病的疗效甚微。相反，根据特应性皮炎的病理生理，使用皮质类固醇激素是合理的。花生四烯酸衍生的炎症介质(白三烯B4即LTB4；PGD2和PDE2)由于具有强有力的炎症活性，从而被认为与皮肤炎症的发生有关。在体外试验中皮质类固醇通过间接抑制磷酯酶A2的活性既可抑制花生四烯酸的环氧化酶代谢产物，又可抑制脂氧合酶代谢产物的生成，这一事实说明花生四烯酸在皮肤炎症中发挥重要作用。为此，我们采用负压法在特应性皮炎和银屑病皮损及正常部位吸疱，检测疱液中花生四烯酸衍生的炎症介质水平与组胺水平。
材料和方法
研究纳入特应性皮炎患者16例，男女各半，年龄13～69岁，特应性皮炎的诊断是根据Hanifin和Rajka等的标准做出的；银屑病患者9例，6男3女，年龄18～78岁，其中6例为慢性斑块性银屑病，2例为红皮病性银屑病，1例为点滴状银屑病。对照为12名志愿者，男女各6人，年龄21～72岁。所有受试者14天内均未用过药，其中一些特应性皮炎患者在筛选前一直使用润肤剂。用皮肤负压吸疱仪吸疱，特应性皮炎患者在皮炎好发部位吸疱，通常在肘窝进行。湿疹样皮损一般取急性炎症期。在湿疹性皮损部位，有时不能吸出完整水疱，在这种情况下就收集吸疱器中的液体。未受累部位通常在脐旁吸疱。正常受试者也在相应部位吸疱。疱液收集后迅速在液氮中冷冻，保存于零下70度直至分析。用放射免疫法测定疱液中花生四烯酸代谢产物PGD2、PGE2和LTB4水平。当有白蛋白时PGD2不稳定，待其转变为稳定的降解产物后再进行测定。
, 百拇医药
在进行放射免疫检测前，先用高压液相色谱法(HPLC)对来源于特应性皮炎疱液中的LTB4进行分离，然后再进行免疫反应，以确定是否为LTB4。按照Fitzpatrick等的方法进行HPLC检测，简要步骤为：先将特应性皮炎皮损部位获得的有LTB4样免疫反应的4份疱液混合(1 mk)，添加Tris-HCk缓冲液至10 mk，pH调至3.0，然后过C18-Sep Pak柱，用10 mk己烷洗脱，然后用8
mk甲基甲酸盐洗脱，该组分中即含有LTB4，最后用5
mk甲醇洗脱，该组分中含有硫化LTB4。将甲基甲酸盐洗脱的组分蒸馏、溶于甲醇，注射入C18-Nuckeosik柱。驱动相组成为甲醇：水：乙酸＝68：32：0.01，pH为5.5。收集1mk组分液，用放射免疫法测定免疫活性。用放射性酶促反应法测定疱液中组胺的水平。用纸片放射免疫吸收试验(PRIST)进行血清IgE测定。
结 果
, 百拇医药
皮肤中LTB4水平(图1)，健康志愿者疱液中检测不到具有LTB4样免疫活性物质，或者浓度很低，9个肘窝部位的水疱中，7个未检测到LTB4；12个腹部水疱中，10个也未检测到LTB4，该放射活性的检出值下限为194
pg/mk，仅2例可检出低水平LTB4(197～268
pg/mk)。同样，在特应性皮炎非受累部位的13个水疱中，8个未检测到LTB4，其余5个的LTB4浓度分别为199 pg/mk、283 pg/mk、291 pg/mk、299 pg/mk、388 pg/mk，平均为231±62
pg/mk。对未检测到的疱液LTB4浓度均估计为194
pg/mk。与此形成鲜明对比的是，特应性皮炎皮损部位水疱中LTB4水平明显升高。16个水疱中，只有5个未检测出LTB4，检出的最高值为1524 pg/mk，平均为426±85
, 百拇医药
pg/mk。皮损和非皮损部位的LTB4水平有显著差异(p<0.05
秩和检验)。LTB4水平与疾病严重程度(如病变范围、程度)无关。LTB4水平与血清IgE水平也无关。在所检测的13份血清标本中，10份有IgE升高。
图1. 特应性皮炎和银屑病患者以及健康志愿者疱液中的LTB4样免疫活性比较
在7个银屑病非皮损部位水疱中，5个LTB4放射活性在检出值以下，另外2个分别为373 pg/mk和730
pg/mk。相反，在9个受累部位水疱液中，仅1个LTB4放射活性在检出值以下，其余水疱液中LTB4值均在239～1042 pg/mk之间，平均为649±102
pg/mk。LTB4水平与银屑病类型、严重程度无关。用反相HPLC进一步分析LTB4，将4份特应性皮炎患者皮损部位水疱液混合，用HPLC进行分离，LTB4放射活性见于这1
, 百拇医药
mk混合液中。放射活性仅见于LTB4的洗脱部分，这样就排除了与12-羟二十碳烯酸(12-HETE)和花生四烯酸交叉反应的可能(图2)。
图2. 特应性皮炎患者疱液的反相高压液相色谱法分离结果
洗脱液的LTB4样免疫活性通过对LTB4抗体-LTB4标准品反应的抑制来测定，LTB4的洗脱时间与LTB4标准品的洗脱时间一致。箭头所示为LT标准样品的洗脱位置。
特应性皮炎皮损部位疱液中组胺水平为2.71±0.59 ng/mk，非皮损疱液中为2.66±0.23 ng/mk。银屑病皮损和非皮损部位疱液中组胺水平分别为2.32± 0.23 ng/mk和2.98±0.46 ng/mk。以上两组间均无统计学差异(表1)。表1. 负压吸疱的疱液中组胺水平(均数±标准差)
组别
, 百拇医药
组胺浓度(ng/ml)
正常人
肘窝
3.11±0.48
腹部
2.25±0.20
特应性皮炎
皮损
2.71±0.59
非皮损
2.66±0.23
银屑病
, 百拇医药
皮损
2.32±0.23
非皮损
2.08±0.46
讨 论
为探索特应性皮炎时皮肤炎症局部的生物学变化，检测了负压吸疱的疱液中几种强炎症介质PGD2、PGE2、LTB4和组胺的浓度。健康志愿者疱液中未能检出花生四烯酸的5-脂氧合酶代谢产物LTB4，即使检出其水平也很低。特应性皮炎非皮损部位也类似。相反，特应性皮炎皮损部位水疱中LTB4水平明显升高，LTB4水平与疾病严重程度和血清IgE水平均无关。另一方面，特应性皮炎非皮损部位花生四烯酸的环氧合酶代谢产物在正常范围，PGE2水平在各组中几乎相同，PGD2则检测不到。银屑病患者结果也类似，未受累皮肤LTB4含量很低或检测不到，而皮损处LTB4则很高，甚至超过特应性皮炎皮损处。LTB4含量与银屑病类型无相关性。未检测到PGD2，PGE2则在正常范围。以上各组患者皮肤中组胺水平也均在正常范围。
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本试验结果支持糖皮质激素对特应性皮炎和银屑病的疗效。因为糖皮质激素可抑制环氧化酶和5-脂氧合酶，至少在体外试验如此。
Brain和Grabbe等首次发现斑块状银屑病皮损处LTB4水平升高，本试验结果与Brain和Grabbe等的报告相似。然而该现象并非银屑病特有，因为在特应性皮炎中也可升高。这一发现可能具有病理学意义。虽然LTB4为嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的趋化因子，但局部外用LTB4后仅可诱导早期嗜中性粒细胞向表皮和真皮浸润，而这种变化缺少银屑病特征。稍后，可见以单个核细胞为主的浸润，提示在特应性皮炎中LTB4有可能趋化单个核细胞到达炎症局部。
LTB4对正常人单个核细胞有趋化活性，而在特应性皮炎这种作用则增强。Czarnetzki等发现，特应性皮炎和银屑病的单个核细胞对LTB4的反应性增高，这可以解释在特应性皮炎局部主要为单个核细胞的聚集。因为单个核细胞很可能为真皮内LTB4的主要来源(但根据本研究的结果，也不能排除角质形成细胞)，这样在特应性皮炎局部，单个核细胞自己产生LTB4，而LTB4又吸引更多巨噬细胞，如此形成循环性放大效应，这一过程可能为特应性皮炎的重要机制之一。LTB4水平升高无疾病特异性，特应性皮炎和银屑病等炎症性皮肤病LTB4均可升高，这一点并不奇怪，也不影响LTB4在特应性皮炎和银屑病发病机制中的重要作用。由于糖皮质激素对这些疾病都有效，因此，这些皮肤病的生物学过程可能都类似，也进一步提示花生四烯酸参与了发病过程。其他因子可能与其他某些疾病表现有关。不过组胺在特应性皮炎发病中发挥的作用可能较小。
, 百拇医药
特应性皮炎皮损疱液中组胺水平在正常范围内，这与本研究者最近对特应性皮炎皮损活检标本进行的组胺检测结果一致。仅在1例高IgE综合征患者中发现组胺水平升高。既往曾报告过特应性皮炎皮损的组胺水平升高，但他们所用的方法特异性差。本研究者也曾经发现，在特应性皮炎的急性期，血浆组胺水平有所升高，但在疾病缓解后又恢复正常。
最近，有人提出这样的问题：在负压吸疱形成的疱液中，LTB4样免疫反应是否存在与花生四烯酸或其12-脂氧合酶代谢物12-HETE的交叉反应，因为Hammarstrom等曾经报告银屑病皮损中有12-HETE。本研究者认为这种可能性不大，其理由是：①用反相HPLC分开混合疱液各组分后，有LTB4样免疫反应的组分正好与LTB4标准品在同一分子位置；②抗LTB4抗体与花生四烯酸或12-HETE仅有微弱的交叉反应，因此只有存在很高浓度的这类物质才能形成对LTB4放射免疫反应的干扰，但如此高的浓度也必然引起与PGD2和PGE2发生交叉反应，而后一种情况并未观察到。
Dieksmeier等通过试验发现，特应性皮炎皮损部位有LTB4的趋化活性，但在非皮损部位则无。
总之，特应性皮炎皮损部位LTB4水平升高，因为LTB4具有很强的致炎活性，因此这种变化可能在本病的发病机制中发挥重要作用。可有效治疗特应性皮炎的糖皮质激素可能有LTB4合成抑制作用，但由于糖皮质激素的作用特异性不强，因此只有在选择性LTB4合成抑制剂或选择性LTB4拮抗剂问世后，才可能真正阐明LTB4在皮肤炎症中的作用。, 百拇医药(张建中 摘译自J Invest Dermatol 1986,86:105-108)