高氧液对窒息家兔血氧及心肌细胞凋亡的影响
尹 明1 沈 洪1 黄先勇1 宋杨莉1 王彩云2 王艳辉1
【摘要】 目的 观察高氧液对急性窒息家兔复苏的效果，以及对血气变化和心肌细胞凋亡的影响。方法 以窒息后开始复苏时间5min为早期复苏, 10min为延迟复苏，随机分为早期高氧液复苏组(A组)、延迟高氧液复苏组(B组)、早期复苏对照组(C组)、延迟复苏对照组(D组)。A、B组予高氧液预处理30min，C、D组用等量空白生理盐水。观察各组窒息5min后血气指标。A、C组打开气道，呼吸机辅助呼吸，30min后测定动脉血气，B、D组维持气道夹闭状态至窒息10min，处理同前。取心肌组织原位杂交细胞凋亡(Tunnel法)染色观察凋亡。结果 窒息5min组应用高氧液可明显提高复苏成功率。高氧液可明显提高窒息时动脉血中PaO2 、SaO2水平，而A、B组与对照组(C、D组)动脉血PaCO2无明显改变。高氧液可明显降低窒息兔血清乳酸水平。高氧液组较对照组心肌细胞凋亡率有所降低。结论 高氧液可在窒息状态下提高血氧浓度，降低乳酸浓度，从而增加复苏成功率。
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【关键词】 高氧液；窒息；复苏；动脉血气；细胞凋亡
Effects of high soluble oxygen fluid on blood gas and apoptosis effected of myocardial cells in asphyxia rabbit
YIN Ming, SHEN Hong, HUANG Xianyong, SONG Yangli, WANG Caiyun, WANG Yanhui
Emergency department, General hospital of PLA. Beijing 100853, China
【Abstract】 Objective To investigate the changes of blood gas and myocardial cells apoptosis effected by high-soluble oxygen fluid in acute asphyxia rabbit resuscitated. Methods All the rabbits randomly were divided into four groups, early resuscitation used high-soluble oxygen fluid ( group A), delay resuscitation used high-soluble oxygen fluid(group B), early resuscitation control (group C) and delay resuscitation control (group D), according to the beginning time of resuscitation ( 5 min in early group, 10 min in delay group). The high-soluble oxygen fluid was given for 30 min before asphyxia in group A and B, the same dose of saline was given in group C and D. Blood gas was measured in 5 min after asphyxia in every group, when the procedure open airway and ventilation were performed immediately in group A and C. Artery blood gas was measured again in 30 min. The same procedure was made in group B and D after asphyxia 10 min. The myocardial cells apoptosis was investigated by Tunnel method. Results A increase resuscitation rate was effected by high-soluble oxygen fluid in group A after asphyxia 5 min than others. The level of PaO2 、SaO2 could be elevated obviously in the groups used high-soluble oxygen fluid, but artery PaCO2 had not significant change in every group. The concentration of lactic acid was decreased significantly in the groups used high-soluble oxygen fluid, and the rate of myocardial cells apoptosis was reduced in the same groups. Conclusions Under asphyxia state, high-soluble oxygen fluid can improve blood oxygen level and increase resuscitation rate, decreased the concentration of lactic acid.
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【Key words】 high-soluble oxygen fluid; asphyxia; resuscitation; artery blood gas; cell apoptosis
细胞缺氧是各种危重病病理变化的共同基础，是导致细胞能量衰竭和多器官功能衰竭(MOF)重要机制，恢复组织氧供是急救的首要目的。临床供氧方式主要通过提供高浓度氧在肺部进行气体交换，但当发生肺脏气体交换功能障碍或血液运氧能力下降(如阻塞性肺气肿、一氧化碳中毒、血管阻塞、失血性休克)时，高氧液则是一种采用含有高浓度溶解且具高氧分压(PO2＝80~100kpa)的液体静脉输注新的给氧方法，从而达到直接给组织供氧治疗。本研究观察高氧液对家兔急性窒息模型复苏治疗效果，及其对复苏后心肌凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 采用成年新西兰兔40只，雌雄不拘，体重2.6±0.3 kg，由解放军总医院实验动物研究中心提供，试验前饲养1w。
, http://www.100md.com
1.2 高氧液制备 基液为37℃生理盐水，亦为对照液，基液经医用充气瓶活性氧活化处理成高氧液，使其氧分压达到80~100kPa。
1.3 实验仪器 900C呼吸机(德国西门子公司)， 54S型多功能监护仪(美国惠普公司)，全自动生化分析仪(日本日立公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组 动物随机分为四组(每组10只)：根据窒息后开始复苏时间, 窒息5min为早期复苏，窒息10min为延迟复苏，组别为早期复苏治疗组(A组)、延迟复苏治疗组(B组)、早期复苏对照组(C组)、延迟复苏对照组(D组)。
1.4.2 窒息模型制作 氯胺酮(15 mg/kg)肌肉注射麻醉，于兔左颈总动脉抽血作血气分析，血乳酸检测。颈外静脉建立液体通路。A、B组给予高氧液1.0ml/min预处理，C、D组用等量空白生理盐水，各组输液30min，再次测定血气指标。各组完全止血钳夹闭气道，观察心率、心律和呼吸变化。窒息5min后测定血气指标。A，C组打开气道，呼吸机辅助呼吸，吸入50%浓度 O2，频率40次/min，潮气量50ml/min，30min后测定动脉血气，静脉血等标本，复苏期间仍维持高氧液治疗。以动物恢复自主呼吸、心率持续大于80次/min为复苏成功标准，以心率小于30次/min，心电监护可见持续心脏电机械分离，无自主呼吸，为复苏失败。B，D组维持气道夹闭状态至窒息10min，恢复气道通气，处理同前。
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1.4.3检测指标与标本采集 各时间点心率、呼吸频率值由监护仪直接读出。各样本PaO2 、PaCO2 、SaO2由日立全自动血气分析仪测出。各时间点乳酸均采集左股静脉不抗凝静脉血，送检。采集血液标本后，立即取下心脏，取左室前壁心肌组织约1mm3，中性10%甲醛固定，常规石蜡包埋，HE染色及原位杂交细胞凋亡(Tunnel法)染色。
1.4.4 TUNLE法染色 样品片放入3%H2O2水溶液中，室温10min；PBS洗涤样片，将TdT及Biotin-11-dUTP混合液至样片20ul/片，37℃湿盒中孵育标记60min；以封闭液按照1：50配置Avidin-HRP为工作液，50ul加与样品片，37℃湿盒中孵育标记60min； DAB显色液显色，苏木素染液复染胞核，计算各组凋亡率。
1.5 统计学处理 所有数据用X±S表示，以方差检验各组指标均数，定性资料用Fisher检验处理。P<0.05为有显著性差异。
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2. 结果
2.1 各组动物复苏成功率 窒息5min组应用高氧液可明显提高复苏成功率(P<0.05)，但高氧液并不能完全代替有效通气，窒息10分钟组，复苏成功率无显著改变(P>0.05)，见表1。
2.2 各组血气变化 高氧液可明显提高窒息时动脉血中PaO2 、SaO2水平(P<0.01)，而非窒息状态下应用高氧液SaO2水平无明显改变(P>0.05)。治疗组(A、B组)与对照组(C、D组)动脉血PaCO2无明显改变(P>0.05)，见表2、3、4。
2.3 各组血清乳酸水平变化 高氧液可明显降低窒息兔血清乳酸水平(P<0.01)，见表5。
2.4 各组心肌细胞凋亡率比较 不同组心肌细胞的凋亡率分别为：A组12%，B组24%，C组22%，D组30%。高氧液组较对照组心肌细胞凋亡率有所降低(P<0.05)，见图1。
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3 讨论
复苏研究中发现，即使成功的复苏，有相当数量患者的器官得不到充分功能恢复和组织血液的再灌注。实际上，单纯恢复血压和改善组织的氧交换，也并不能提高复苏后的存活率。细胞低氧是各种危重疾病的共同病理基础，是造成细胞生物能量衰竭和多器官功能障碍综合征(MODS)重要致病机制之一[1]。进一步研究发现，在整个复苏过程中，胸腺、脾、肝脏、肾脏、脑等器官均有大量细胞被诱导凋亡[3]，有研究证明线粒体在调节细胞凋亡与坏死中也发挥着重要的作用[3，4]，缺氧时线粒体膜电位较对照组明显下降，而复氧期线粒体膜电位下降的幅度较缺氧期更明显[5]。曾有用低温疗法来增加脑组织对缺氧的耐受能力，从而减少脑组织细胞凋亡[6], 但有关心肺复苏中心肌细胞凋亡的研究少有报道。本研究结果显示，在急性窒息兔早期复苏即使成功，心脏功能已恢复，仍存在大量心肌细胞发生凋亡，且随着复苏开始时间的延迟，心肌细胞凋亡随之增加。应用高氧液可通过改善组织供氧，使心肌细胞凋亡率有所降低。
及早发现判断细胞缺氧损伤和组织氧合状态，及时加以纠正，对提高缺氧患者抢救的成功率有重要意义。在通气或氧交换障碍情况下，静脉液体给高氧液可能成为早期供氧的另外一种方式。本研究观察，应用医用充气瓶制备的高氧液可明显提高窒息家兔动脉血PaO2和SaO2水平。同时，可以明显降低因急性窒息所致血清乳酸水平升高程度。血乳酸浓度作为细胞缺氧时葡萄糖酵解增加的终产物之一，被当作判断组织氧合状态的指标，并对危重病患者的预后有一定的评价作用[7，8]。
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复苏过程中高氧液可增加血液携氧量，并为组织细胞所利用，减轻组织缺氧程度，从而提高复苏的成功率。其改善缺氧机制可能与以下因素有关：(1)高氧液通过高氧分压(PO2＝80～100kPa)，使氧的弥散半径与高压氧仓；(2个纯氧大气压)下的弥散半径大致相等，为正常动脉血氧弥散半径的2倍，可使缺氧组织细胞的低氧状况得到显著改善；(2)高氧液中含一定浓度的活性氧(O3)，可提高红细胞变形能力，降低血小板聚集，降低血液粘度，增加冠脉侧支血流量，减轻心肌缺血程度；(3)由于血液内氧分压升高，加快氧气向组织液扩散，有利于组织对氧的充分利用；(4)输入高氧液可增加了体内的氧的储备，使机体可耐受较长时间的缺氧；(5)复苏中应用高氧液可加快组织功能恢复。
本研究结果提示，高氧液可在窒息缺氧状态下提高动脉血氧浓度，降低乳酸浓度，改善组织供氧，从而增加复苏的成功率，为心肺复苏提供了一种新的救治选择。
参考文献
, 百拇医药 1 Homer-Vanniasinkam S, Crinnion JN, Gough MJ. Post-ischemic organ dysfunction: a review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 1997;14:195-203.
2 Guan J, Jin DD, Jin LJ, Lu Q. Apoptosis in organs of rats in early stage after polytrauma combined with shock. J Trauma 2002 Jan;52(1):104-11.
3 Halestrap AP, Kerr PM, Javadov S, et al. Elucidating the molecular mechanism of the permeability transition pore and its role in reperfusion injury of the heart. Biochim Biophys Acta. 1998 Aug 10;1366(1-2):79-94.
, 百拇医药
4 Kroemer G, Dsllaporta B, RescheRigon M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Ann Rev Physiol 1998; 60: 619-642.
5 秦宇红，沈 洪，蔡莉蓉等. 缺氧复氧对心肌细胞线粒体膜电位的影响及纳洛酮的保护作用.世界急危重病医学杂志 2004; 1: 38-42.
6 Edwards AD, Mehmet H. Apoptosis in perinatal hypoxic-ischaemic cerebral damage. Neuropathol Appl Neurobiol 1996 Dec;22(6):494-8.
7 毕铭华，张淑文，王宝恩. 血浆乳酸浓度在评价重症感染合并多脏器功能不全综合征组织氧合中的意义，急诊医学 1999;4：8.
8 湛浩强，张赛，刘敬业等，亚低温治疗重型颅脑损伤病人血气、血糖、乳酸的变化. 中国医师杂志 2000;2：2.
作者单位：1、100853北京，解放军总医院急诊科 2、解放军总医院生化科
作者简介：尹明，男，主治医师，在读医学博士, http://www.100md.com
【摘要】 目的 观察高氧液对急性窒息家兔复苏的效果，以及对血气变化和心肌细胞凋亡的影响。方法 以窒息后开始复苏时间5min为早期复苏, 10min为延迟复苏，随机分为早期高氧液复苏组(A组)、延迟高氧液复苏组(B组)、早期复苏对照组(C组)、延迟复苏对照组(D组)。A、B组予高氧液预处理30min，C、D组用等量空白生理盐水。观察各组窒息5min后血气指标。A、C组打开气道，呼吸机辅助呼吸，30min后测定动脉血气，B、D组维持气道夹闭状态至窒息10min，处理同前。取心肌组织原位杂交细胞凋亡(Tunnel法)染色观察凋亡。结果 窒息5min组应用高氧液可明显提高复苏成功率。高氧液可明显提高窒息时动脉血中PaO2 、SaO2水平，而A、B组与对照组(C、D组)动脉血PaCO2无明显改变。高氧液可明显降低窒息兔血清乳酸水平。高氧液组较对照组心肌细胞凋亡率有所降低。结论 高氧液可在窒息状态下提高血氧浓度，降低乳酸浓度，从而增加复苏成功率。
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【关键词】 高氧液；窒息；复苏；动脉血气；细胞凋亡
Effects of high soluble oxygen fluid on blood gas and apoptosis effected of myocardial cells in asphyxia rabbit
YIN Ming, SHEN Hong, HUANG Xianyong, SONG Yangli, WANG Caiyun, WANG Yanhui
Emergency department, General hospital of PLA. Beijing 100853, China
【Abstract】 Objective To investigate the changes of blood gas and myocardial cells apoptosis effected by high-soluble oxygen fluid in acute asphyxia rabbit resuscitated. Methods All the rabbits randomly were divided into four groups, early resuscitation used high-soluble oxygen fluid ( group A), delay resuscitation used high-soluble oxygen fluid(group B), early resuscitation control (group C) and delay resuscitation control (group D), according to the beginning time of resuscitation ( 5 min in early group, 10 min in delay group). The high-soluble oxygen fluid was given for 30 min before asphyxia in group A and B, the same dose of saline was given in group C and D. Blood gas was measured in 5 min after asphyxia in every group, when the procedure open airway and ventilation were performed immediately in group A and C. Artery blood gas was measured again in 30 min. The same procedure was made in group B and D after asphyxia 10 min. The myocardial cells apoptosis was investigated by Tunnel method. Results A increase resuscitation rate was effected by high-soluble oxygen fluid in group A after asphyxia 5 min than others. The level of PaO2 、SaO2 could be elevated obviously in the groups used high-soluble oxygen fluid, but artery PaCO2 had not significant change in every group. The concentration of lactic acid was decreased significantly in the groups used high-soluble oxygen fluid, and the rate of myocardial cells apoptosis was reduced in the same groups. Conclusions Under asphyxia state, high-soluble oxygen fluid can improve blood oxygen level and increase resuscitation rate, decreased the concentration of lactic acid.
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【Key words】 high-soluble oxygen fluid; asphyxia; resuscitation; artery blood gas; cell apoptosis
细胞缺氧是各种危重病病理变化的共同基础，是导致细胞能量衰竭和多器官功能衰竭(MOF)重要机制，恢复组织氧供是急救的首要目的。临床供氧方式主要通过提供高浓度氧在肺部进行气体交换，但当发生肺脏气体交换功能障碍或血液运氧能力下降(如阻塞性肺气肿、一氧化碳中毒、血管阻塞、失血性休克)时，高氧液则是一种采用含有高浓度溶解且具高氧分压(PO2＝80~100kpa)的液体静脉输注新的给氧方法，从而达到直接给组织供氧治疗。本研究观察高氧液对家兔急性窒息模型复苏治疗效果，及其对复苏后心肌凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 采用成年新西兰兔40只，雌雄不拘，体重2.6±0.3 kg，由解放军总医院实验动物研究中心提供，试验前饲养1w。
, http://www.100md.com
1.2 高氧液制备 基液为37℃生理盐水，亦为对照液，基液经医用充气瓶活性氧活化处理成高氧液，使其氧分压达到80~100kPa。
1.3 实验仪器 900C呼吸机(德国西门子公司)， 54S型多功能监护仪(美国惠普公司)，全自动生化分析仪(日本日立公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组 动物随机分为四组(每组10只)：根据窒息后开始复苏时间, 窒息5min为早期复苏，窒息10min为延迟复苏，组别为早期复苏治疗组(A组)、延迟复苏治疗组(B组)、早期复苏对照组(C组)、延迟复苏对照组(D组)。
1.4.2 窒息模型制作 氯胺酮(15 mg/kg)肌肉注射麻醉，于兔左颈总动脉抽血作血气分析，血乳酸检测。颈外静脉建立液体通路。A、B组给予高氧液1.0ml/min预处理，C、D组用等量空白生理盐水，各组输液30min，再次测定血气指标。各组完全止血钳夹闭气道，观察心率、心律和呼吸变化。窒息5min后测定血气指标。A，C组打开气道，呼吸机辅助呼吸，吸入50%浓度 O2，频率40次/min，潮气量50ml/min，30min后测定动脉血气，静脉血等标本，复苏期间仍维持高氧液治疗。以动物恢复自主呼吸、心率持续大于80次/min为复苏成功标准，以心率小于30次/min，心电监护可见持续心脏电机械分离，无自主呼吸，为复苏失败。B，D组维持气道夹闭状态至窒息10min，恢复气道通气，处理同前。
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1.4.3检测指标与标本采集 各时间点心率、呼吸频率值由监护仪直接读出。各样本PaO2 、PaCO2 、SaO2由日立全自动血气分析仪测出。各时间点乳酸均采集左股静脉不抗凝静脉血，送检。采集血液标本后，立即取下心脏，取左室前壁心肌组织约1mm3，中性10%甲醛固定，常规石蜡包埋，HE染色及原位杂交细胞凋亡(Tunnel法)染色。
1.4.4 TUNLE法染色 样品片放入3%H2O2水溶液中，室温10min；PBS洗涤样片，将TdT及Biotin-11-dUTP混合液至样片20ul/片，37℃湿盒中孵育标记60min；以封闭液按照1：50配置Avidin-HRP为工作液，50ul加与样品片，37℃湿盒中孵育标记60min； DAB显色液显色，苏木素染液复染胞核，计算各组凋亡率。
1.5 统计学处理 所有数据用X±S表示，以方差检验各组指标均数，定性资料用Fisher检验处理。P<0.05为有显著性差异。
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2. 结果
2.1 各组动物复苏成功率 窒息5min组应用高氧液可明显提高复苏成功率(P<0.05)，但高氧液并不能完全代替有效通气，窒息10分钟组，复苏成功率无显著改变(P>0.05)，见表1。
2.2 各组血气变化 高氧液可明显提高窒息时动脉血中PaO2 、SaO2水平(P<0.01)，而非窒息状态下应用高氧液SaO2水平无明显改变(P>0.05)。治疗组(A、B组)与对照组(C、D组)动脉血PaCO2无明显改变(P>0.05)，见表2、3、4。
2.3 各组血清乳酸水平变化 高氧液可明显降低窒息兔血清乳酸水平(P<0.01)，见表5。
2.4 各组心肌细胞凋亡率比较 不同组心肌细胞的凋亡率分别为：A组12%，B组24%，C组22%，D组30%。高氧液组较对照组心肌细胞凋亡率有所降低(P<0.05)，见图1。
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3 讨论
复苏研究中发现，即使成功的复苏，有相当数量患者的器官得不到充分功能恢复和组织血液的再灌注。实际上，单纯恢复血压和改善组织的氧交换，也并不能提高复苏后的存活率。细胞低氧是各种危重疾病的共同病理基础，是造成细胞生物能量衰竭和多器官功能障碍综合征(MODS)重要致病机制之一[1]。进一步研究发现，在整个复苏过程中，胸腺、脾、肝脏、肾脏、脑等器官均有大量细胞被诱导凋亡[3]，有研究证明线粒体在调节细胞凋亡与坏死中也发挥着重要的作用[3，4]，缺氧时线粒体膜电位较对照组明显下降，而复氧期线粒体膜电位下降的幅度较缺氧期更明显[5]。曾有用低温疗法来增加脑组织对缺氧的耐受能力，从而减少脑组织细胞凋亡[6], 但有关心肺复苏中心肌细胞凋亡的研究少有报道。本研究结果显示，在急性窒息兔早期复苏即使成功，心脏功能已恢复，仍存在大量心肌细胞发生凋亡，且随着复苏开始时间的延迟，心肌细胞凋亡随之增加。应用高氧液可通过改善组织供氧，使心肌细胞凋亡率有所降低。
及早发现判断细胞缺氧损伤和组织氧合状态，及时加以纠正，对提高缺氧患者抢救的成功率有重要意义。在通气或氧交换障碍情况下，静脉液体给高氧液可能成为早期供氧的另外一种方式。本研究观察，应用医用充气瓶制备的高氧液可明显提高窒息家兔动脉血PaO2和SaO2水平。同时，可以明显降低因急性窒息所致血清乳酸水平升高程度。血乳酸浓度作为细胞缺氧时葡萄糖酵解增加的终产物之一，被当作判断组织氧合状态的指标，并对危重病患者的预后有一定的评价作用[7，8]。
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复苏过程中高氧液可增加血液携氧量，并为组织细胞所利用，减轻组织缺氧程度，从而提高复苏的成功率。其改善缺氧机制可能与以下因素有关：(1)高氧液通过高氧分压(PO2＝80～100kPa)，使氧的弥散半径与高压氧仓；(2个纯氧大气压)下的弥散半径大致相等，为正常动脉血氧弥散半径的2倍，可使缺氧组织细胞的低氧状况得到显著改善；(2)高氧液中含一定浓度的活性氧(O3)，可提高红细胞变形能力，降低血小板聚集，降低血液粘度，增加冠脉侧支血流量，减轻心肌缺血程度；(3)由于血液内氧分压升高，加快氧气向组织液扩散，有利于组织对氧的充分利用；(4)输入高氧液可增加了体内的氧的储备，使机体可耐受较长时间的缺氧；(5)复苏中应用高氧液可加快组织功能恢复。
本研究结果提示，高氧液可在窒息缺氧状态下提高动脉血氧浓度，降低乳酸浓度，改善组织供氧，从而增加复苏的成功率，为心肺复苏提供了一种新的救治选择。
参考文献
, 百拇医药 1 Homer-Vanniasinkam S, Crinnion JN, Gough MJ. Post-ischemic organ dysfunction: a review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 1997;14:195-203.
2 Guan J, Jin DD, Jin LJ, Lu Q. Apoptosis in organs of rats in early stage after polytrauma combined with shock. J Trauma 2002 Jan;52(1):104-11.
3 Halestrap AP, Kerr PM, Javadov S, et al. Elucidating the molecular mechanism of the permeability transition pore and its role in reperfusion injury of the heart. Biochim Biophys Acta. 1998 Aug 10;1366(1-2):79-94.
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4 Kroemer G, Dsllaporta B, RescheRigon M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Ann Rev Physiol 1998; 60: 619-642.
5 秦宇红，沈 洪，蔡莉蓉等. 缺氧复氧对心肌细胞线粒体膜电位的影响及纳洛酮的保护作用.世界急危重病医学杂志 2004; 1: 38-42.
6 Edwards AD, Mehmet H. Apoptosis in perinatal hypoxic-ischaemic cerebral damage. Neuropathol Appl Neurobiol 1996 Dec;22(6):494-8.
7 毕铭华，张淑文，王宝恩. 血浆乳酸浓度在评价重症感染合并多脏器功能不全综合征组织氧合中的意义，急诊医学 1999;4：8.
8 湛浩强，张赛，刘敬业等，亚低温治疗重型颅脑损伤病人血气、血糖、乳酸的变化. 中国医师杂志 2000;2：2.
作者单位：1、100853北京，解放军总医院急诊科 2、解放军总医院生化科
作者简介：尹明，男，主治医师，在读医学博士, http://www.100md.com