络病与心脑血管疾病相关性及治疗研究进展 通心络预处理对大鼠海马脑片缺氧损伤的影响
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作者简介: 梅元武 现任华中科技大学同济医学院附属协和医院神经科主任医师、教授、博士生导师，湖北省急救中心神经科主任、康复医学会常务理事、病理生理学会常务理事、神经专业委员会副主任委员、神经康复学会常委兼秘书、神经科学会常委，中华医学会神经康复学组副组长；2000年主持镁与神经系统疾病的相关研究，获湖北省科技进步2等奖，参加低血钾软病研究，曾先后获得武汉市、湖北省、卫生部科技进步1等奖，国家科技成果2等奖；被评为湖北省有突出贡献的中青年专家；先后发表论文30余篇参编或副主编专著8部；培养硕士生、博士生20余名。
摘 要
目的 探讨通心络预处理对海马脑片缺氧损伤的影响。 方法 将30只SD大鼠随机平均分入对照组、缺氧复氧组、通心络预处理组。经给氧、缺氧、复氧孵育后分别对各组中的5只大鼠取10张脑片检测海马CA1区神经元密度；对各组的另5只大鼠取10张脑片应用透射电镜观察海马CA1区神经元的超微结构。结果 通心络预处理组海马CA1区神经元密度以及超微结构改变与缺氧复氧组相比有显著差异。结论 通心络预处理对海马脑片缺氧损伤有保护作用。
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通心络胶囊是根据中医络病理论研制而成的，含人参、全蝎、土鳖虫、赤芍等多种中药的复方制剂，具有活血益气、通络止痛的功效，临床发现其对缺血性心脑血管疾病有很好的疗效。本研究观察通心络预处理对大鼠海马脑片缺氧模型的作用以探讨通心络防治缺血性脑血管病的作用。
材料与方法
材料与实验动物
药物与试剂 通心络胶囊干粉1.43g生药/g干粉由河北省石家庄以岭药业股份有限公司提供。人工脑脊液ACSF成分mmok/LNaCk 126，KCk 5，KH2PO4 1.3，MgSO4 1.3，CaCk2 2.4，NaHCO3 26， Gkucose 10 试剂配置均用蒸馏水。
实验动物及分组 雄性健康SD大鼠体重200～250g由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。将30只大鼠随机分为：①对照组，经胃管给于大鼠生理盐水4mk·kg-1·d-1，做成脑片后不予缺氧处理；②缺氧复氧组，经胃管给予大鼠生理盐水4mk·kg-1·d-1；③通心络组 给予大鼠通心络胶囊干粉，剂量为1.0 g·kg-1·d-1，所用药物均溶于生理盐水4mk·kg-1·d-1灌胃。
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实验设计
预处理 各组大鼠分别经生理盐水、通心络生理盐水溶液连续灌胃10天进行预处理。
海马脑片制备 预处理后1日给大鼠腹腔注射10%的水合氯醛3.5mk·kg-1，麻醉成功后断头处死小心快速取出整脑，投入预冷的4℃持续通有95%
O2/5%CO2的人工脑脊液中洗净血液并降温后将整脑从人工脑脊液中取出腹侧放在冰盘上视交叉后2～6mm处做脑组织冠状切面含海马将海马垂直于其长轴切成450um厚的脑片。脑片移入持续通有95%O2/5%CO235℃的人工脑脊液中孵育1小时使脑片恢复功能。将脑片孵育15分钟对照组继续通95%
O2/5%CO2，不予缺氧处理制成缺氧脑片，再孵育2小时使脑片复氧。
固定、石蜡包埋、切片染色 每组中5只大鼠的10张脑片在含4%多聚甲醛0.1%戊二醛的磷酸盐缓冲液中过夜固定。固定后的脑片经梯度酒精脱水二甲苯透明浸蜡铸块然后切成6 μm厚薄层。石蜡切片经Nissk染色后检测神经元密度。将已脱蜡入水的切片置于C.V.M.T混合Nissk染液中室温下24小时双蒸水冲洗5分钟分别入70%、80%、90%的酒精脱水兼分色直至背景颜色消退继续脱水、透明、中性树胶封片。采用双盲法400倍显微镜下从海马CA1区一端开始计数正常神经元数以其密度作为评价缺血损害的指标。神经元密度个/mm＝ 海马CA1区正常神经元数/海马CA1区长度。每组中另外5只大鼠10张脑片从ACSF中取出后立即置于4℃2%多聚甲醛与2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定24小时。切取海马CA1区组织块经1%锇酸固定梯度酒精脱水Epon812包埋超薄切片染色后用OPTON EM10C透射电镜观察超微结构。
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统计学处理
所有数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较用t检验.表1
海马CA1区神经元密度变化
N
CA1区神经元密度
对照组
10
9.61±0.75
缺氧复氧组
10
7.34±1.69
, http://www.100md.com 通心络预处理组
10
8.71±1.26
注 缺氧复氧组与对照组比较p <0.05 ⑵通心络预处理组与缺氧复氧组比较p <0.05 N表示对组观察的视野数
结 果
神经元密度
正常情况下海马区神经元分布相对密集排列规则形态完整经Nissk染色后 Nissk体清晰可见其中海马CA1区光镜下可见排列整齐紧密的3～4层锥体细胞。缺氧孵育后 海马CA1区神经元肿胀、轮廓不清、排列散乱、存在空泡样变性及核固缩而且海马CA1区神经元密度显著下降。通心络预处理组神经元肿胀有所减轻细胞轮廓相对清晰神经元排列明显规则 海马CA1区神经元密度较缺氧复氧组高。
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对照组电镜观察海马CA1区神经元超微结构未见异常改变。 缺氧复氧组可见较多神经元线粒体肿胀嵴不完整或消失呈空泡状内质网池扩张变形粗面内质网脱颗粒.部分神经元明显皱缩胞浆核质电子密度明显增高胞浆内布满空泡和多种形态的溶酶体和脂质包含物核周可见发亮间隙。部分神经元碎裂细胞死亡。通心络预处理组镜下超微结构较缺氧复氧组损伤明显减轻神经元大部分保存完好神经元变性程度明显轻于缺氧复氧组变形神经元的改变以线粒体肿胀、嵴不完全肿胀和内质网扩展变形为主明显皱缩、电子密度增高的神经元少见。
讨 论
缺血性脑血管病是当今死亡率和致残率较高的疾病之一。制备理想的动物模型是研究该类疾病的重要手段之一。但是在体脑缺血模型制作复杂栓塞部位不恒定模型成功率低。而本试验通过制作海马脑片表明脑片模型简单易行缺氧复氧条件易于控制是可行的研究缺血性脑血管病的模型。
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缺血预适应的神经元保护现象
1986年Murry在心肌缺血研究中首先发现并提出缺血预适应(ischemic preconditioning IPC)，随后大量研究进一步肯定了心肌缺血预适应的保护作用。最早发现缺血预适应是在心肌组织，目前研究最多的也是心肌缺血预适应。短暂性脑缺血发作(TIA)是脑梗死的危险因素之一，那么脑组织是否存在缺血预适应？1990年，Kitagawa 等最早用沙土鼠全脑缺血模型发现，短暂的全脑缺血后再灌注产生缺血耐受，能减轻随后较长时间的全脑缺血损伤。继之在其他脑缺血模型中亦发现有此现象。
预适应虽然可诱导脑缺血耐受形成而产生保护作用，但是在预想可能发生的脑缺血之前给予一次短暂缺血进行预适应，在临床应用中尚不实际。鉴于上述情况，Riepe提出了化学预适应(Chemicak preconditioning)的概念 ，小剂量(3～20mg·kg-1)应用氧化磷酸化抑制剂3-硝基丙酸预处理可以模拟缺血预适应的保护机制。3-NPA是一种存在于植物及真菌的毒素，能够不可逆地抑制琥珀酸脱氢酶(SDH，即线粒体复合体II)，使氧化磷酸化解耦连，ATP产生减少，从而造成化学性缺氧。3-NPA大剂量或长期慢性摄入时可导致严重的神经元变性，而小剂量单次应用时却可以模拟轻度缺氧/短暂缺血，不造成组织学改变的神经元坏死，且可调动机体自身保护机制，对缺血/缺氧形成耐受，该作用产生于预处理后1h并持续72h以上。
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化学预适应的机制尚不清楚，目前已经证明NO在引发缺血预适应延迟性保护作用中起关键作用。NO作为一种自由基在脑缺血性损伤机制中有不同的作用，其生成与一氧化氮合酶(NOS)有密切关系：⑴毒性作用 通过形成NO-铁复合物，巯基蛋白的氧化，形成超氧阴离子等方式产生神经毒性；⑵保护作用 NO可扩张血管，改善缺血脑组织血供；抑制血小板和血细胞聚集而对内膜起保护作用，抑制肾上腺素等物质产生血管收缩作用，从而减轻脑缺血损伤。有资料表明，含NOS的神经元能选择性保护阿尔茨海默病患者的海马结构。故推测脑缺血后NOS的升高代表一种生物学机制，抵抗脑缺血时由活性氧引起的细胞毒性作用。在心肌缺血预适应模型中，已经证实NO参与耐受效应过程，并使某些基因上调，形成具有保护性的蛋白质。除NO外，化学预适应还可能与腺苷受体、ATP敏感性钾通道(K-ATP通道)、氧自由基(OFR)、凋亡相关基因的激活等有关。
虽然3-NPA在临床应用中不可行，但是我们可以根据缺血预适应的保护机制来研究开发新药。
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通心络胶囊是在络病理论指导下进行组方的，方中人参为君，补益心气；水蛭活血通络，全蝎解痉通络共为臣药。本试验通过在对海马脑片进行缺氧复氧(即缺血再灌注)前给于通心络预处理10天，证明通心络预处理的海马脑片神经元密度较单纯缺氧复氧组高，神经元肿胀有所减轻，细胞轮廓相对清晰，神经元排列明显规则；并且通心络预处理组镜下超微结构较缺氧复氧组损伤明显减轻神经元大部分保存完好变性程度明显轻于缺氧复氧组变性神经元的改变以线粒体肿胀嵴不完全肿胀和内质网扩展变形为主明显皱缩、电子密度增高的神经元少见。因此，通心络预处理的海马脑片对缺氧的耐受性明显增高。有实验研究表明，通心络可明显提高兔结扎冠脉前的血清NO水平。内皮细胞分泌的NOS能使血液中的L-精氨酸变成NO，作用于血管中平滑肌细胞、血小板和白细胞，调节血管的舒张功能；而且还可抗黏附、抗血小板和白细胞聚集，因此通心络预处理增强海马脑片的缺氧耐受性，这可能与其增加血清NO水平，保护内皮细胞有关。内皮细胞分泌内皮源性血管收缩因子(EDCF)和内皮源性血管舒张因子(EDRF)，调节血管平滑肌张力。其中，EDCF包括内皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)、前列腺素H2(PGH2)、超氧阴离子与肾素血管紧张素系统的成份等；EDRF包括NO、前列环素(PGI2)、内皮源性超极化因子(EDHF)等。EDRF和EDCF之间的平衡使血管张力保持平衡，提供器官灌流，反之则发生内皮功能障碍，导致心脑血管疾病。内皮素是目前已知作用最强的长效血管收缩剂，受损的血管内皮对内皮素敏感性大大增强，可引起血管痉挛，诱发或加重脑梗死神经功能缺损程度；可直接作用于神经元，导致死亡；它能引起细胞外钙离子内流及细胞内贮存钙的释放，致使细胞内钙超载，脑血管收缩，细胞水肿和神经元坏死。而通心络胶囊通过增加血清NO水平，从而维持 NO与内皮素的平衡，防治血管痉挛，减轻细胞内钙超载，减轻细胞水肿及神经元坏死，从而减轻脑梗死神经功能缺损程度，达到治疗目的。
通心络作为一种脑血管病的预防性用药，以减轻发病后的神经功能缺损，具有应用前景。(参考文献从略), 百拇医药