富集并检测结肠癌患者门静脉血癌细胞的研究
【摘要】 目的 用磁激活细胞分选技术结合流式细胞仪检测结肠癌患者门静脉血中的癌细胞，探讨其对结肠癌肝转移诊断和治疗的意义。方法 手术中抽取34例结直肠癌患者和11例对照者的门静脉血，运用磁激活细胞分选技术富集带有细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)抗原的上皮细胞，用流式细胞仪进行定量分析。结果 在未经磁激活细胞分选富集的标本中均未发现CK + CD45 - 细胞;在经富集的标准中其含量在对照组与患者组间以及Dukes A-B期与Dukes C-D期患者间差异有非常显著性。结论 此项技术能检测到结肠癌患者门静脉血中细胞水平的微转移，并能进行定量分析，为结肠癌的辅助化疗方案的制定和预后评估提供依据。
关键词 结肠癌 肿瘤细胞 磁激活细胞分选 流式细胞仪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2004)04-0294-02
The study of enriching and detecting carcinoma cells in protal vien of coloric cancer patients
, 百拇医药
Qin Jian，Dai Qiancheng，Liu Wenyong，et al.
Department of General Surgery，Shanghai9th People’s Hospital，Shanghai200011.
【Abstract】 Objective To study the significance of diagnosing and treating cancer metastasis by enriching and quantifying carcinoma cells in portal vein of coloric cancer patients using MACS(Magnetic activated cell soring).Methods Blood samples were collected from34patients with coloric cancer and11volunteers without cancer，then labeled with anti-cytokeratin(anti-CK);CK + carcinoma cells were separated from the samples through magnetic columns，and quantified by flow cytometry.Results CK + CD45 - cells could not be detected from the samples without MACS;in the sample undergone MACS，the concentrations of CK + CD45 - cellswere significantly higher in patient group than in control group，and lower in Dukes A-B patients than in Dukes C-D patients.Conclusion The techˉnique can effectively enrich epithelial tumor cells and detect micro-metastases occurring in the portal vein of coloric cancer patients.and could become a novel tool to guideevaluation of cancer metastasis risk，and the strategy of chemiˉcal therapy.
, 百拇医药
Key words coloric carcinoma tumor cell magnetic activated cell sorting flow cytometry
转移是造成恶性肿瘤治疗失败以及患者死亡最根本的原因，结肠癌最主要的远处转移是发生在经门静脉的肝脏转移。门静脉有无细胞水平的微转移是判断肿瘤病人预后的重要指标，并对手术后的进一步治疗提供重要的参考依据。近来用rt-PCR或磁激活细胞分选(Magnetic activated cell sorting，MACS)检测并富集外周血中播散的肿瘤细胞已获得极大进展。本课题是采用MACS结合流式细胞仪定量分析技术对结肠癌患者的门静脉血中可能存在的肿瘤细胞进行富集和检测，从而预估结肠癌肝转移发生的可能性，为手术后的治疗提供指导。
1 对象与方法
1.1 对象 随机抽取2001年9月～2003年4月间我院普外科手术治疗的结直肠癌患者34例，平均年龄64.6(51～87)岁，依据Dukes标准进行临床分期:A期2例、B期8例、C期15例、D期9例。均经手术治疗，其中29例病人行根治性或姑息性肿瘤切除，并获术后病理证实;有5例Dukes D期患者未能切除肿瘤，但有术前或术后病理证实;另有9例胆囊切除术、2例结肠息肉患者自愿为对照组。术后根据病理报告和术中所见判断临床分期。
, 百拇医药
1.2 方法 获取门静脉血:按结肠癌根治性手术标准，先解剖肿瘤所在肠段回流的静脉主干，从中抽取静脉血20～30ml，或在肝十二指肠韧带中暴露部分门静脉前壁穿刺抽取等量的血液，立即进行磁激活细胞分选和流式细胞仪的检测。MACS:实验采用MACS癌细胞富集试剂盒(德国Milˉtenyi Biotec公司)。将门静脉血标本20～30ml，400g离心30min，吸出血清与红细胞间约5ml白细胞层，加缓冲液至40ml，加入能破坏红细胞的细胞裂解液5ml，5min后加入细胞固定液5ml，放入30min以终止反应。300g离心10min，移去上清，悬浮于MACS细胞染剂(cell stain)，加免疫球蛋白恒定链受体阻断剂和MACS磁珠，放置45min，加CK抗体(标记FITC)及CD45抗体(标PE)，避光放置15min。再加MACS细胞染剂离心10min，取细胞悬浮于1ml MACS细胞染剂内。将细胞悬液经滤器加入磁柱(先经缓冲液冲洗)，然后用1ml缓冲液反复冲洗3次，冲出未标记磁珠的细胞并收集1号管;另加1ml缓冲液，用针芯快速推挤，压出标记有磁珠细胞入2号管。流式细胞仪分析:将上述两管细胞悬液分别送EPICSXL流式细胞仪(美国COULTER公司)分析，以1号管细胞为基准，计数2号管中的CK + CD45 - 细胞。
, http://www.100md.com
1.3 统计分析 四格表精确计算法和t检验，使用SPSS统计软件分析。
2 结果
患者组未经MACS富集的标本用流式细胞仪进行检测，未发现CK + CD45 - 细胞。经MACS后，11例对照组中CK + CD45 - 细胞占检测细胞总数的比例为0～0.1%，1例结肠息肉患者的CK + CD45 - 细胞为0.1%，其余对照组成员的门静脉血中未发现CD + CD45 - 细胞。结肠癌患者门静脉血中都发现CK + CD45 - 细胞，其比例为0.1%～1.45%，Dukes A-B期患者CK +CD45 - 细胞的比例为0.1%～0.25%， Dukes C-D期患者CK + CD45 - 细胞的比例为0.07%～1.45%。将CK + CD45 - 细胞比例大于或等于0.2%定为阳性标本，小于0.2%的定为阴性标本，将对照组与实验组之间用四格表精确计算法进行比较，差别有非常显著性(P<0.005)，见表1，将Dukes A-B期与Dukes C-D期间CK + CD45 - 细胞比例以均数t检验进行比较，差异也有非常显著性(P<0.01)，见表2。
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表1 患者组与对照组阳性标本比率的差异
3 讨论
最新的研究发现在消化道肿瘤患者的外周血以及淋巴液存在游离的肿瘤细胞，并已成为判断肿瘤转移性复发的独立预后指标之一 [1] 。为此已开发出多种检测细胞水平的微转移手段，主要有PCR和流式细胞仪检测等 [2] ，其中单独使用流式细胞仪检测，则其灵敏度不稳定;而RT-PCR则有较多的假阳性。而MACS技术是通过外胚层的正常或肿瘤细胞都表达CK抗原，因而标记上包被了CK抗体的磁珠后，即可被磁柱富集，从而可以提高流式细胞仪检测骨髓、淋巴结等组织中的肿瘤细胞的灵敏度和分析能力。运用这种方法一种肿瘤患者的外周血中富集并检测出了肿瘤细胞 [3] 。由于我们认为结肠癌最主要的转移途径是通过门静脉的肝转移，因而在手术中检测门静脉血中是否存在细胞水平的微转移对患者的预后判断和手术后治疗手段的选择有重要的意义，因而，我们运用MACS技术结合流式细胞仪检测结肠癌患者门静脉血中的肿瘤细胞。采取门静脉回流血的部位可以选在局部肠系膜回流静脉主干也可以直接在门静脉主干，前者由于手术正常的步骤就是首先解剖并结扎此处血管，因此采血基本不增加手 术时间、创伤和并发症，但有时因静脉血流不足而不能抽得足够的血量;而在门静脉主干采血需要简单解剖肝十二指肠韧带，增加了手术的创伤、时间和出血量，尤其是对下腹部手术而言，但都能采到足够的血量，若采用细针穿刺通过压迫都能止血，并不明显增加出血量和并发症发生率。不论采用何处采血部位，都要避免挤压肿瘤灶，以免使检测结果不准确。
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实验结果发现结肠癌患者与对照组患者相比门静脉血中CK + CD45 - 细胞数量明显增多，说明结肠癌患者门静脉血中上皮来源的细胞明显增多，因而可以解释为这些可能就是播散的肿瘤细胞。同时说明，结肠癌患者的门静脉血中普遍存在游离的肿瘤细胞。实验中发现1例结肠息肉患者CD + CD45 - 细胞比例为0.1%，可能说明结肠非恶性肿瘤的上皮细胞在病理状态下也可能进入血流中 [4] 。实验中发现在结肠癌淋巴结转移前的Dukes A-B期患者的门静脉血中CK + CD45 - 细胞的数量明显少于已出现了淋巴结转移的Dukes C-D期患者，这说明随着结肠癌的进展，由门静脉转移的肿瘤细胞数量也逐渐增加，这符合结肠癌肝转移发生的一般规律;同时也说明门静脉中CK + CD45 - 细胞数量可反映肿瘤细胞向肝脏播散的情况。所以，我们根据术中门静脉CD +CD45 - 细胞的多少来决定是否给予术中的门静脉化疗或置泵用于术后的门静脉化疗。在实验中我们也对患者组的未经MACS富集的标本用流式细胞仪进行了检测，均未发现CK + CD45 -细胞，而这些标本经MACS富集后均发现了CK + CD45 - 细胞。所以通过MACS富集标记了CK抗原的癌细胞可以被流式细胞仪检测并计数，这种技术有望成为一种特异且简便、有效的检测血液中单细胞水平肿瘤转移的方法。
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肝转移是结肠癌的最常见的转移方式，约40%～60%的结肠癌患者最后死于与肝转移相关的并发症。因此尽早发现并治疗肝转移是改善结肠癌预后的重要环节。由于造成肝转移的肿瘤细胞都是通过门静脉血扩散的，因而在手术中获取门静脉血进行肿瘤细胞的检测是预测术后肝转移的最直接的手段。我们采用的MACS富集结合流式细胞仪检测能发现门静脉血中细胞水平的微小转移。从而可提示我们对一些高危患者在术中就进行门静脉灌注化疗和置门静脉化疗泵，以及术后的密切随访和介入化疗。为预防和尽早治疗可能出现的肝转移提供指导。
参考文献
1 Lindemann F，Schlimok G，Dirschedl P，et al.Prognostic significance of micrometastatic tumour cells in bone marrow of colorectal cancer paˉtients.Lancet，1992，340:685-689.
, 百拇医药
2 Pantel K，Izbicki JR，AngstwurmM，et al.Immunocytological detection of bone marrow micrometastasis in operable non-small cell lung cancer.Cancer Res，1993，53:1027-1031.
3 彭志海，张放，凌云，等.磁激活细胞分选技术用于结直肠癌外周血癌细胞富集的研究.中华普通外科杂志，2002，17(1):43-44.
4 Hardingham JE，Hewett PJ，Sage RE，et al.Molecular detection if blood-borne epithelial cells in colorectal cancer patients and in patients with benign bowel disease.Int J Cancer，2000，89:8-13.
作者单位:200011上海市第九人民医院普外科
(收稿日期:2004-03-01)
(编辑晓 勇), http://www.100md.com
关键词 结肠癌 肿瘤细胞 磁激活细胞分选 流式细胞仪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2004)04-0294-02
The study of enriching and detecting carcinoma cells in protal vien of coloric cancer patients
, 百拇医药
Qin Jian，Dai Qiancheng，Liu Wenyong，et al.
Department of General Surgery，Shanghai9th People’s Hospital，Shanghai200011.
【Abstract】 Objective To study the significance of diagnosing and treating cancer metastasis by enriching and quantifying carcinoma cells in portal vein of coloric cancer patients using MACS(Magnetic activated cell soring).Methods Blood samples were collected from34patients with coloric cancer and11volunteers without cancer，then labeled with anti-cytokeratin(anti-CK);CK + carcinoma cells were separated from the samples through magnetic columns，and quantified by flow cytometry.Results CK + CD45 - cells could not be detected from the samples without MACS;in the sample undergone MACS，the concentrations of CK + CD45 - cellswere significantly higher in patient group than in control group，and lower in Dukes A-B patients than in Dukes C-D patients.Conclusion The techˉnique can effectively enrich epithelial tumor cells and detect micro-metastases occurring in the portal vein of coloric cancer patients.and could become a novel tool to guideevaluation of cancer metastasis risk，and the strategy of chemiˉcal therapy.
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Key words coloric carcinoma tumor cell magnetic activated cell sorting flow cytometry
转移是造成恶性肿瘤治疗失败以及患者死亡最根本的原因，结肠癌最主要的远处转移是发生在经门静脉的肝脏转移。门静脉有无细胞水平的微转移是判断肿瘤病人预后的重要指标，并对手术后的进一步治疗提供重要的参考依据。近来用rt-PCR或磁激活细胞分选(Magnetic activated cell sorting，MACS)检测并富集外周血中播散的肿瘤细胞已获得极大进展。本课题是采用MACS结合流式细胞仪定量分析技术对结肠癌患者的门静脉血中可能存在的肿瘤细胞进行富集和检测，从而预估结肠癌肝转移发生的可能性，为手术后的治疗提供指导。
1 对象与方法
1.1 对象 随机抽取2001年9月～2003年4月间我院普外科手术治疗的结直肠癌患者34例，平均年龄64.6(51～87)岁，依据Dukes标准进行临床分期:A期2例、B期8例、C期15例、D期9例。均经手术治疗，其中29例病人行根治性或姑息性肿瘤切除，并获术后病理证实;有5例Dukes D期患者未能切除肿瘤，但有术前或术后病理证实;另有9例胆囊切除术、2例结肠息肉患者自愿为对照组。术后根据病理报告和术中所见判断临床分期。
, 百拇医药
1.2 方法 获取门静脉血:按结肠癌根治性手术标准，先解剖肿瘤所在肠段回流的静脉主干，从中抽取静脉血20～30ml，或在肝十二指肠韧带中暴露部分门静脉前壁穿刺抽取等量的血液，立即进行磁激活细胞分选和流式细胞仪的检测。MACS:实验采用MACS癌细胞富集试剂盒(德国Milˉtenyi Biotec公司)。将门静脉血标本20～30ml，400g离心30min，吸出血清与红细胞间约5ml白细胞层，加缓冲液至40ml，加入能破坏红细胞的细胞裂解液5ml，5min后加入细胞固定液5ml，放入30min以终止反应。300g离心10min，移去上清，悬浮于MACS细胞染剂(cell stain)，加免疫球蛋白恒定链受体阻断剂和MACS磁珠，放置45min，加CK抗体(标记FITC)及CD45抗体(标PE)，避光放置15min。再加MACS细胞染剂离心10min，取细胞悬浮于1ml MACS细胞染剂内。将细胞悬液经滤器加入磁柱(先经缓冲液冲洗)，然后用1ml缓冲液反复冲洗3次，冲出未标记磁珠的细胞并收集1号管;另加1ml缓冲液，用针芯快速推挤，压出标记有磁珠细胞入2号管。流式细胞仪分析:将上述两管细胞悬液分别送EPICSXL流式细胞仪(美国COULTER公司)分析，以1号管细胞为基准，计数2号管中的CK + CD45 - 细胞。
, http://www.100md.com
1.3 统计分析 四格表精确计算法和t检验，使用SPSS统计软件分析。
2 结果
患者组未经MACS富集的标本用流式细胞仪进行检测，未发现CK + CD45 - 细胞。经MACS后，11例对照组中CK + CD45 - 细胞占检测细胞总数的比例为0～0.1%，1例结肠息肉患者的CK + CD45 - 细胞为0.1%，其余对照组成员的门静脉血中未发现CD + CD45 - 细胞。结肠癌患者门静脉血中都发现CK + CD45 - 细胞，其比例为0.1%～1.45%，Dukes A-B期患者CK +CD45 - 细胞的比例为0.1%～0.25%， Dukes C-D期患者CK + CD45 - 细胞的比例为0.07%～1.45%。将CK + CD45 - 细胞比例大于或等于0.2%定为阳性标本，小于0.2%的定为阴性标本，将对照组与实验组之间用四格表精确计算法进行比较，差别有非常显著性(P<0.005)，见表1，将Dukes A-B期与Dukes C-D期间CK + CD45 - 细胞比例以均数t检验进行比较，差异也有非常显著性(P<0.01)，见表2。
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表1 患者组与对照组阳性标本比率的差异
3 讨论
最新的研究发现在消化道肿瘤患者的外周血以及淋巴液存在游离的肿瘤细胞，并已成为判断肿瘤转移性复发的独立预后指标之一 [1] 。为此已开发出多种检测细胞水平的微转移手段，主要有PCR和流式细胞仪检测等 [2] ，其中单独使用流式细胞仪检测，则其灵敏度不稳定;而RT-PCR则有较多的假阳性。而MACS技术是通过外胚层的正常或肿瘤细胞都表达CK抗原，因而标记上包被了CK抗体的磁珠后，即可被磁柱富集，从而可以提高流式细胞仪检测骨髓、淋巴结等组织中的肿瘤细胞的灵敏度和分析能力。运用这种方法一种肿瘤患者的外周血中富集并检测出了肿瘤细胞 [3] 。由于我们认为结肠癌最主要的转移途径是通过门静脉的肝转移，因而在手术中检测门静脉血中是否存在细胞水平的微转移对患者的预后判断和手术后治疗手段的选择有重要的意义，因而，我们运用MACS技术结合流式细胞仪检测结肠癌患者门静脉血中的肿瘤细胞。采取门静脉回流血的部位可以选在局部肠系膜回流静脉主干也可以直接在门静脉主干，前者由于手术正常的步骤就是首先解剖并结扎此处血管，因此采血基本不增加手 术时间、创伤和并发症，但有时因静脉血流不足而不能抽得足够的血量;而在门静脉主干采血需要简单解剖肝十二指肠韧带，增加了手术的创伤、时间和出血量，尤其是对下腹部手术而言，但都能采到足够的血量，若采用细针穿刺通过压迫都能止血，并不明显增加出血量和并发症发生率。不论采用何处采血部位，都要避免挤压肿瘤灶，以免使检测结果不准确。
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实验结果发现结肠癌患者与对照组患者相比门静脉血中CK + CD45 - 细胞数量明显增多，说明结肠癌患者门静脉血中上皮来源的细胞明显增多，因而可以解释为这些可能就是播散的肿瘤细胞。同时说明，结肠癌患者的门静脉血中普遍存在游离的肿瘤细胞。实验中发现1例结肠息肉患者CD + CD45 - 细胞比例为0.1%，可能说明结肠非恶性肿瘤的上皮细胞在病理状态下也可能进入血流中 [4] 。实验中发现在结肠癌淋巴结转移前的Dukes A-B期患者的门静脉血中CK + CD45 - 细胞的数量明显少于已出现了淋巴结转移的Dukes C-D期患者，这说明随着结肠癌的进展，由门静脉转移的肿瘤细胞数量也逐渐增加，这符合结肠癌肝转移发生的一般规律;同时也说明门静脉中CK + CD45 - 细胞数量可反映肿瘤细胞向肝脏播散的情况。所以，我们根据术中门静脉CD +CD45 - 细胞的多少来决定是否给予术中的门静脉化疗或置泵用于术后的门静脉化疗。在实验中我们也对患者组的未经MACS富集的标本用流式细胞仪进行了检测，均未发现CK + CD45 -细胞，而这些标本经MACS富集后均发现了CK + CD45 - 细胞。所以通过MACS富集标记了CK抗原的癌细胞可以被流式细胞仪检测并计数，这种技术有望成为一种特异且简便、有效的检测血液中单细胞水平肿瘤转移的方法。
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肝转移是结肠癌的最常见的转移方式，约40%～60%的结肠癌患者最后死于与肝转移相关的并发症。因此尽早发现并治疗肝转移是改善结肠癌预后的重要环节。由于造成肝转移的肿瘤细胞都是通过门静脉血扩散的，因而在手术中获取门静脉血进行肿瘤细胞的检测是预测术后肝转移的最直接的手段。我们采用的MACS富集结合流式细胞仪检测能发现门静脉血中细胞水平的微小转移。从而可提示我们对一些高危患者在术中就进行门静脉灌注化疗和置门静脉化疗泵，以及术后的密切随访和介入化疗。为预防和尽早治疗可能出现的肝转移提供指导。
参考文献
1 Lindemann F，Schlimok G，Dirschedl P，et al.Prognostic significance of micrometastatic tumour cells in bone marrow of colorectal cancer paˉtients.Lancet，1992，340:685-689.
, 百拇医药
2 Pantel K，Izbicki JR，AngstwurmM，et al.Immunocytological detection of bone marrow micrometastasis in operable non-small cell lung cancer.Cancer Res，1993，53:1027-1031.
3 彭志海，张放，凌云，等.磁激活细胞分选技术用于结直肠癌外周血癌细胞富集的研究.中华普通外科杂志，2002，17(1):43-44.
4 Hardingham JE，Hewett PJ，Sage RE，et al.Molecular detection if blood-borne epithelial cells in colorectal cancer patients and in patients with benign bowel disease.Int J Cancer，2000，89:8-13.
作者单位:200011上海市第九人民医院普外科
(收稿日期:2004-03-01)
(编辑晓 勇), http://www.100md.com