不同膳食结构对幼年大鼠肥胖基因表达的调控(基金项目)
http://www.100md.com
基金项目:陕西省卫生厅科学研究基金资助项目(编号:97013)
【摘要】 目的 不同膳食对幼年大鼠ob基因表达的影响。方法 采用不同含量的脂肪及能量食物分组喂养断奶1周SD大鼠。分别于喂养1、2、3周后测量体重及血清胆固醇、甘油三酯;以免疫组织化学法测定脂肪组织的leptin表达水平。结果 伴随体重、血脂的变化，低能组脂肪组织leptin表达水平较高，而高能组则较低，其差异有显著性意义。结论 生理状态下，肥胖基因(ob基因)的表达产物leptin的分泌水平受摄食能量的调控，膳食能量不足可诱导其水平升高。
关键词 幼年大鼠 膳食 能量 ob基因 leptin
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)04-0289-03
Regulation of ob gene expression by dietary structure in young rats
, 百拇医药
Xiao Yanfeng，Yang Yufeng，Ren Lifen
The Second Hospital of Xi’an Jiao Tong University，Shaanxi710004.
【Abstract】 Objective Study on effect of different dietary structures on ob gene expression in rats.Methods SD young rats were fed with foods of differentfat and energy contents.Concentrations of cholesterol and triglyceride in serum，and weight of the rats were measured after feeding1，2and3weeks respectively，meanwhile，the levels of leptin were examined in adipose tissues of rats with immunohistochemistry.Results The expression of leptin in adiˉpose tissues of low energy and low fat food group was significantly higher than that of high energy and high fat food groups.Conclusion The level of leptin，the product of the ob gene，is regulated by food-fat and energy.Low-enerˉgy and low fat diet can induceincreasoing expression of ob gene.
, 百拇医药
Key words youny rats food fat and energy diet ob gene leptin
自1994年从脂肪组织分离并克隆出肥胖基因(ob基因)以来，ob基因的表达产物———瘦素(leptin)的生物功能受到关注。一些研究发现 [1，2] ，外源性的leptin可使正常或肥胖动物摄食减少、能量消耗增加。已知肥胖的发生与高脂、高能量的膳食摄入密切相关，摄食不同含脂膳食的过程中，肥胖基因的表达如何，内源性leptin是如何参与摄食能量的转化与代谢，目前研究尚少。本文就此问题进行研究。
1 材料与方法
1.1 动物喂养和分组 断乳1周的SD幼年大鼠共78只，随机分为四组，分笼喂养。其中低能饲养组18只，常规饲养组18只，高能饲养Ⅰ组21只，高能饲养Ⅱ组21只。饲料的基本成分见表1。分组前各组幼鼠体重均在80～94g之间，雌雄各半。共喂养3周，试验用动物由西安交大医学院动物中心提供，动物饲养和获取组织均由该中心的专业人员完成。见表1。
, 百拇医药
表1 各组饲料的基本成分
注:能量单位以猪的消化能计算
1.2 方法
1.2.1 标本制作 于喂养的第8、15、22天分别随机断颈处死各组6或7只幼鼠。立即测体重、身长;取尾血3ml置于洁净试管;取肾旁脂肪置于福尔马林溶液固定。脂肪标本经脱水机脱水处理，常规蜡块包埋。肝脏组织10%福尔马林固定，80%酒精3h，95%酒精过夜，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1.5h，正丁醇Ⅰ、Ⅱ各1.5h。之后用软蜡包埋。将蜡块置于Leicu切片机上切片，厚度5μm。
1.2.2 染色 (1)HE染色:脂肪和肝脏标本按HE常规染色步骤进行。(2)抗体和免疫组化:Ob兔多克隆抗体由美国santa cruz公司提供，对脂肪组织做免疫组化分析。免疫组化染色步骤如下:a.切片脱蜡至水。b.0.3%H 2 O 2 甲醇溶液封闭20min，水洗。c.0.02mol/L甘氨酸处理切片10min。d.Tris缓冲液冲洗。e.血清封闭20min。f.加入一抗(Ob兔多克隆抗体和Ob-R山羊多克隆抗体)，4℃冰箱过液。g.Tris缓冲液冲洗。h.加入生物素标记的二抗，37℃30min。Tris缓冲液冲洗。i.加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，37℃30min。Tris缓冲液冲洗。j.DAB显色。k.常规脱水，透明，封片。
, 百拇医药
1.2.3 光镜下观测结果 leptin表达阳性显示在细胞膜外周有棕黄色着色。根据细胞外棕色着色宽度和深度判断结果。均由西安交大第一医院病理科有丰富经验的专业人员完成。
1.2.4 血脂测定 试剂盒由温州东百生物工程有限公司提供。采用免疫透射比浊法测定。
2 结果
2.1 一般情况 低能饲养的大鼠外观较小，毛发缺乏光泽，不活泼;高能饲养大鼠毛色油光发亮，活泼，但其食欲较常规饲养组明显差，考虑与饲料含脂量高有关。大体解剖比较，低能饲养大鼠肾旁的脂肪组织体积很小;高能喂养大鼠肾旁的脂肪组织体积明显大于常规饲养大鼠，腹腔内脂肪及皮下脂肪组织明显多于常规饲养大鼠。高能喂养大鼠肝脏外观红黄色，经肝组织切片，HE染色，显示有肝细胞脂 肪变性。(见图1、图2，见封三)
2.2 各组体重比较 表2显示，低能组体重增长迟缓，显著低于其它三组;高能Ⅰ、Ⅱ组的体重增长与常规组差异无显著性。
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表2 各组大鼠体重比较 (g)
2.3 各组血脂变化 由表3、4可见，高能Ⅰ、Ⅱ组大鼠胆固 醇、甘油三酯明显高于低能组和常规组，其差异有显著性。
表3 各组大鼠血清胆固醇水平比较 (mmol/L)
表4 各组大鼠血清甘油三酯水平比较 (mmol/L))
2.4 脂肪组织leptin免疫组化测定 由表5可见，低能组的脂肪细胞膜外周leptin免疫组化着色带比较宽，提示lepˉtin的表达水平较高，leptin的分泌量较高;而高能组脂肪细 胞膜外周leptin免疫组化着色呈细线状，显示leptin表达水平则较低，其差异有显著性。
表5 各组大鼠脂肪组织leptin免疫组化结果
, 百拇医药
3 讨论
体重的增减取决于能量摄入与消耗的平衡。能量摄入增加或消耗减少可导致体重的增加，这可能是目前肥胖在全世界流行的重要原因。有关调节能量平衡及体重的基因研究，近年来倍受关注的是来自脂肪组织的肥胖基因及其产物leptin。在leptin与摄食及能量消耗的研究中，许多学者 [1，2] 采用外源性leptin脑室注射，使肥胖的ob/ob小鼠和瘦鼠食物摄入减少、能量消耗增加，体重减轻，并且认为leptin调控下丘脑释放神经肽Y和黑色素皮质素实现对摄食活动的调节。另外，在培养的30A5前脂肪细胞中加入leptin可抑制脂肪合成酶———乙酰辅酶A羧化酶(acety1-CoA carboxylase)基因表达，提示leptin可直接抑制脂肪组织中脂类的合成 [3] 。
但是，生理状态下内源性的leptin分泌与摄食、膳食结构、能量代谢和体重的调节关系尚未明了。本研究采用同类型幼年大鼠，于断奶1周后分组喂养含不同脂肪和能量的饲料。实验结果显示，低脂低能喂养组体重生长较慢、肾旁脂肪块小;血甘油三酯和胆固醇水平较低，脂肪细胞体积较小，细胞膜外周leptin免疫组化着色带比较宽，提示leptin的分泌量较高;而在高脂高能喂养的大鼠情况恰好相反，脂肪细胞的leptin分泌量明显减低，统计学处理差异有显著性。本研究结果表明，膳食中脂肪及能量成分对年幼大鼠内源性的leptin分泌水平有明显影响。较长期摄入低脂低能膳食使机体ob基因的表达增强，leptin分泌增加;相反，低脂低能膳食可使机体ob基因的表达减低，leptin分泌减少。有关饮食对ob基因表达调节机制目前尚未明了。有实验发现 [4，5] ，大鼠长期过度饮食时可使ob mRNA水平明显增高;长期高脂、高碳水化合物的摄入，可使leptin生成增 加，这与本文结果不一致。但另有学者认为 [6] ，leptin的原始功能并不是防治肥胖，而是作为能量摄入不足的信号，本文实验结果符合此观点。在低脂低能膳食喂养中，幼年大鼠的能量摄入明显不足，作为一种信号可使leptin分泌增加。由于leptin的基本功能是减少食欲、增加能量消耗，因此，leptin水平提高可使机体内脂肪及能量分解代谢代偿性增加，以满足机体的基本生理需求。反之，高脂高能量膳食时，机体生理所需能源充足;因此，反馈性抑制leptin分泌。随之，使膳食摄入的过多脂类得以在体内储存。leptin分泌降低可反馈性地使下丘脑神经肽Y的分泌增加，进而提高食欲，这可能是肥胖人群普遍食欲旺盛的原因之一。
, 百拇医药
参考文献
1 Ramsey JJ，Kemmitz JW，Colman，et al.Different central and peripheral responses to leptin in rhesus monkeys，brain transport may be limited.J Clin Endocrinol Metab，1998，83(9):3230-3235.
2 Mistry AM，Swick AG，Romsos DR，et al.Lepin rapidly lowers foodinˉtake and elevates metabolic rates in lean and ob/ob mice.J Nutr，1997，127(12):2065-2060.
3 Bai Y，Zhang S，Kim KS，et al.Obese gene experession alters the ability of30A5preadipocytes to respond to lipogene hormones.J Biol Chem，1996，271(24):13939-13942.
, 百拇医药
4 Harris RB，Ramasy TG，Smith SR，et al.Early and late stimulation of obmRNAexpression in meal-fed and overfed rat.J Clin Invest，1996，97(9):2020-2026.
5 李秋平，封志纯.Leptin研究进展.国外医学儿科学分册，2000，27(4):192-195.3 Yanovski JA，Yanovski SZ.Recent advance in basic obesity research.JAMA，1999，282(16):1504-1506.
作者单位:710004西安交通大学第二医院儿科
(收稿日期:2003-11-07)
(编辑曲 全), http://www.100md.com
【摘要】 目的 不同膳食对幼年大鼠ob基因表达的影响。方法 采用不同含量的脂肪及能量食物分组喂养断奶1周SD大鼠。分别于喂养1、2、3周后测量体重及血清胆固醇、甘油三酯;以免疫组织化学法测定脂肪组织的leptin表达水平。结果 伴随体重、血脂的变化，低能组脂肪组织leptin表达水平较高，而高能组则较低，其差异有显著性意义。结论 生理状态下，肥胖基因(ob基因)的表达产物leptin的分泌水平受摄食能量的调控，膳食能量不足可诱导其水平升高。
关键词 幼年大鼠 膳食 能量 ob基因 leptin
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)04-0289-03
Regulation of ob gene expression by dietary structure in young rats
, 百拇医药
Xiao Yanfeng，Yang Yufeng，Ren Lifen
The Second Hospital of Xi’an Jiao Tong University，Shaanxi710004.
【Abstract】 Objective Study on effect of different dietary structures on ob gene expression in rats.Methods SD young rats were fed with foods of differentfat and energy contents.Concentrations of cholesterol and triglyceride in serum，and weight of the rats were measured after feeding1，2and3weeks respectively，meanwhile，the levels of leptin were examined in adipose tissues of rats with immunohistochemistry.Results The expression of leptin in adiˉpose tissues of low energy and low fat food group was significantly higher than that of high energy and high fat food groups.Conclusion The level of leptin，the product of the ob gene，is regulated by food-fat and energy.Low-enerˉgy and low fat diet can induceincreasoing expression of ob gene.
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Key words youny rats food fat and energy diet ob gene leptin
自1994年从脂肪组织分离并克隆出肥胖基因(ob基因)以来，ob基因的表达产物———瘦素(leptin)的生物功能受到关注。一些研究发现 [1，2] ，外源性的leptin可使正常或肥胖动物摄食减少、能量消耗增加。已知肥胖的发生与高脂、高能量的膳食摄入密切相关，摄食不同含脂膳食的过程中，肥胖基因的表达如何，内源性leptin是如何参与摄食能量的转化与代谢，目前研究尚少。本文就此问题进行研究。
1 材料与方法
1.1 动物喂养和分组 断乳1周的SD幼年大鼠共78只，随机分为四组，分笼喂养。其中低能饲养组18只，常规饲养组18只，高能饲养Ⅰ组21只，高能饲养Ⅱ组21只。饲料的基本成分见表1。分组前各组幼鼠体重均在80～94g之间，雌雄各半。共喂养3周，试验用动物由西安交大医学院动物中心提供，动物饲养和获取组织均由该中心的专业人员完成。见表1。
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表1 各组饲料的基本成分
注:能量单位以猪的消化能计算
1.2 方法
1.2.1 标本制作 于喂养的第8、15、22天分别随机断颈处死各组6或7只幼鼠。立即测体重、身长;取尾血3ml置于洁净试管;取肾旁脂肪置于福尔马林溶液固定。脂肪标本经脱水机脱水处理，常规蜡块包埋。肝脏组织10%福尔马林固定，80%酒精3h，95%酒精过夜，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1.5h，正丁醇Ⅰ、Ⅱ各1.5h。之后用软蜡包埋。将蜡块置于Leicu切片机上切片，厚度5μm。
1.2.2 染色 (1)HE染色:脂肪和肝脏标本按HE常规染色步骤进行。(2)抗体和免疫组化:Ob兔多克隆抗体由美国santa cruz公司提供，对脂肪组织做免疫组化分析。免疫组化染色步骤如下:a.切片脱蜡至水。b.0.3%H 2 O 2 甲醇溶液封闭20min，水洗。c.0.02mol/L甘氨酸处理切片10min。d.Tris缓冲液冲洗。e.血清封闭20min。f.加入一抗(Ob兔多克隆抗体和Ob-R山羊多克隆抗体)，4℃冰箱过液。g.Tris缓冲液冲洗。h.加入生物素标记的二抗，37℃30min。Tris缓冲液冲洗。i.加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，37℃30min。Tris缓冲液冲洗。j.DAB显色。k.常规脱水，透明，封片。
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1.2.3 光镜下观测结果 leptin表达阳性显示在细胞膜外周有棕黄色着色。根据细胞外棕色着色宽度和深度判断结果。均由西安交大第一医院病理科有丰富经验的专业人员完成。
1.2.4 血脂测定 试剂盒由温州东百生物工程有限公司提供。采用免疫透射比浊法测定。
2 结果
2.1 一般情况 低能饲养的大鼠外观较小，毛发缺乏光泽，不活泼;高能饲养大鼠毛色油光发亮，活泼，但其食欲较常规饲养组明显差，考虑与饲料含脂量高有关。大体解剖比较，低能饲养大鼠肾旁的脂肪组织体积很小;高能喂养大鼠肾旁的脂肪组织体积明显大于常规饲养大鼠，腹腔内脂肪及皮下脂肪组织明显多于常规饲养大鼠。高能喂养大鼠肝脏外观红黄色，经肝组织切片，HE染色，显示有肝细胞脂 肪变性。(见图1、图2，见封三)
2.2 各组体重比较 表2显示，低能组体重增长迟缓，显著低于其它三组;高能Ⅰ、Ⅱ组的体重增长与常规组差异无显著性。
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表2 各组大鼠体重比较 (g)
2.3 各组血脂变化 由表3、4可见，高能Ⅰ、Ⅱ组大鼠胆固 醇、甘油三酯明显高于低能组和常规组，其差异有显著性。
表3 各组大鼠血清胆固醇水平比较 (mmol/L)
表4 各组大鼠血清甘油三酯水平比较 (mmol/L))
2.4 脂肪组织leptin免疫组化测定 由表5可见，低能组的脂肪细胞膜外周leptin免疫组化着色带比较宽，提示lepˉtin的表达水平较高，leptin的分泌量较高;而高能组脂肪细 胞膜外周leptin免疫组化着色呈细线状，显示leptin表达水平则较低，其差异有显著性。
表5 各组大鼠脂肪组织leptin免疫组化结果
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3 讨论
体重的增减取决于能量摄入与消耗的平衡。能量摄入增加或消耗减少可导致体重的增加，这可能是目前肥胖在全世界流行的重要原因。有关调节能量平衡及体重的基因研究，近年来倍受关注的是来自脂肪组织的肥胖基因及其产物leptin。在leptin与摄食及能量消耗的研究中，许多学者 [1，2] 采用外源性leptin脑室注射，使肥胖的ob/ob小鼠和瘦鼠食物摄入减少、能量消耗增加，体重减轻，并且认为leptin调控下丘脑释放神经肽Y和黑色素皮质素实现对摄食活动的调节。另外，在培养的30A5前脂肪细胞中加入leptin可抑制脂肪合成酶———乙酰辅酶A羧化酶(acety1-CoA carboxylase)基因表达，提示leptin可直接抑制脂肪组织中脂类的合成 [3] 。
但是，生理状态下内源性的leptin分泌与摄食、膳食结构、能量代谢和体重的调节关系尚未明了。本研究采用同类型幼年大鼠，于断奶1周后分组喂养含不同脂肪和能量的饲料。实验结果显示，低脂低能喂养组体重生长较慢、肾旁脂肪块小;血甘油三酯和胆固醇水平较低，脂肪细胞体积较小，细胞膜外周leptin免疫组化着色带比较宽，提示leptin的分泌量较高;而在高脂高能喂养的大鼠情况恰好相反，脂肪细胞的leptin分泌量明显减低，统计学处理差异有显著性。本研究结果表明，膳食中脂肪及能量成分对年幼大鼠内源性的leptin分泌水平有明显影响。较长期摄入低脂低能膳食使机体ob基因的表达增强，leptin分泌增加;相反，低脂低能膳食可使机体ob基因的表达减低，leptin分泌减少。有关饮食对ob基因表达调节机制目前尚未明了。有实验发现 [4，5] ，大鼠长期过度饮食时可使ob mRNA水平明显增高;长期高脂、高碳水化合物的摄入，可使leptin生成增 加，这与本文结果不一致。但另有学者认为 [6] ，leptin的原始功能并不是防治肥胖，而是作为能量摄入不足的信号，本文实验结果符合此观点。在低脂低能膳食喂养中，幼年大鼠的能量摄入明显不足，作为一种信号可使leptin分泌增加。由于leptin的基本功能是减少食欲、增加能量消耗，因此，leptin水平提高可使机体内脂肪及能量分解代谢代偿性增加，以满足机体的基本生理需求。反之，高脂高能量膳食时，机体生理所需能源充足;因此，反馈性抑制leptin分泌。随之，使膳食摄入的过多脂类得以在体内储存。leptin分泌降低可反馈性地使下丘脑神经肽Y的分泌增加，进而提高食欲，这可能是肥胖人群普遍食欲旺盛的原因之一。
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参考文献
1 Ramsey JJ，Kemmitz JW，Colman，et al.Different central and peripheral responses to leptin in rhesus monkeys，brain transport may be limited.J Clin Endocrinol Metab，1998，83(9):3230-3235.
2 Mistry AM，Swick AG，Romsos DR，et al.Lepin rapidly lowers foodinˉtake and elevates metabolic rates in lean and ob/ob mice.J Nutr，1997，127(12):2065-2060.
3 Bai Y，Zhang S，Kim KS，et al.Obese gene experession alters the ability of30A5preadipocytes to respond to lipogene hormones.J Biol Chem，1996，271(24):13939-13942.
, 百拇医药
4 Harris RB，Ramasy TG，Smith SR，et al.Early and late stimulation of obmRNAexpression in meal-fed and overfed rat.J Clin Invest，1996，97(9):2020-2026.
5 李秋平，封志纯.Leptin研究进展.国外医学儿科学分册，2000，27(4):192-195.3 Yanovski JA，Yanovski SZ.Recent advance in basic obesity research.JAMA，1999，282(16):1504-1506.
作者单位:710004西安交通大学第二医院儿科
(收稿日期:2003-11-07)
(编辑曲 全), http://www.100md.com