人参皂甙Rg1和Rb1对脐血CD34+细胞凋亡的影响
【摘要】 目的 探讨人参皂甙Rg1和Rb1对体外培养体系中撤除细胞因子引起的脐血CD34 + 细胞凋亡的干预作用。方法 免疫磁珠法纯化获得脐血CD34 + 细胞，在含有TPO(50μg/L)、SCF(50μg/L)的StemSpan TM SFEM无血清液体培养基中培养7天后，撤除细胞因子实验组加入不同浓度Rg1、Rb1，24h和72h后收集细胞，流式细胞仪FITC-Annexin-V/PI双色荧光标记检测细胞凋亡率，比色法检测Caspase-3活性。结果 撤除细胞因子24h后，撤因子组细胞凋亡率为(24.79±2.80)%，Rgl(2.5mg/L、5mg/L、10mg/L)各组细胞凋亡率均降低，分别为(12.35±2.07)%、(11.87±1.20)%和(13.91±0.50)%(P<0.01);Rb1各组(5mg/L、10mg/L)的细胞凋亡率分别为(17.88±0.65)%、(20.61±0.85)%(P<0.01);撤除细胞因子24h和72h对照组，Caspase-3活性设为1.00，Rg1-2.5组(0.72±0.09，0.57±0.22，P<0.01)，Rg1-5组(0.51±0.11，0.42±0.10，P<0.01)，Rg1-10组(0.63±0.06，P<0.01;0.83±0.12，P>0.05)，Rb1-5组(0.54±0.18，0.32±0.18，P<0.01)Rb1-10组(0.87±0.07，P>0.05;0.55±0.03，P<0.01)，Caspase-3活性均低于对照组。结论 人参皂甙Rg1、Rb1能拮抗因撤除细胞因子诱导脐血CD34 + 细胞凋亡，此作用与Caspase-3信号通路有关。
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关键词 细胞凋亡 脐血CD34 + 细胞 Caspase-3 人参皂甙
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)04-0385-03
Effects of ginsenosides Rg1and Rb1 on the
apoptosis of CD34 + cells isolated from umbilical cordal blood
Guo Ruolin，Wan Xiaohua，Chen Xiaojian，et al.
Tianjin Hospital，Tianjin300211.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of ginsenosides Rg1and Rb1during umbilical cordal blood hematopoietic cells apoptosis induced by growth factors withdrawal.Methods Human umbilical cordal blood CD34 + stem cells were purified and obtained steriley.CD34 + cells were cultured in StemSpan TM SFEM serum-free medium containing cytokines TPO(50μg/L)and SCF(50μg/L)for7days.Then cells were collected and maintained in the same medium with the growth factors deprivation for24h and72h.The experimental groups were respectively treated with Rg1or Rb1with different concentrations.FITC-Annmexin-V/PI flow cyloanalyzer and Caspase-3colorimetˉric assay were respectively used to determine cell apoptosis rate and the activity of Caspase-3.Results 24hours afˉter the cytokines withdrawal，the apoptosis rate in control cells was(24.79±2.80)%;the apoptosis rate in Rg1(2.5 mg/L，5mg/L，10mg/L)groups were(12.35±2.07)%，(11.87±1.20)%and(13.91±0.50)%(P<0.01);in Rb1groups(5mg/L，10mg/L)were(17.88±0.65)%，(20.61±0.85%)(P<0.01)respectively.24hours and72hours after cytokines deprivation，Caspase-3activities in control groups were taken as1.00，the values in Rg1-2.5group were0.72±0.09and0.57±0.22(P<0.01)，in Rg1-5group were0.51±0.11and0.42±0.10(P<0.01)，in Rg1-10group were0.63±0.06(P<0.01)and0.83±0.12(P>0.05);in Rb1-5group were0.54±0.18and0.32±0.18(P<0.01)，in Rbl-10group were0.87±0.07(P>0.05)，0.55±0.03(P<0.01).Conclusion These results demonstrated that apoptosis induced by growth factors withdrawal of umbilical cordal blood hematopoietic cells can be inhibited by Rg1and Rb1and this effect was involved with Caspase-3signal pathway.
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Key words apoptosis umbilical cordal blood CD34 + cells caspase-3 ginsenosides
细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序的一种主动性的死亡过程，它涉及细胞内一系列的信号转导和调控过程。在造血过程中，细胞凋亡在调控细胞增殖、分化的平衡中起重要作用。人参“补气养血”的功效虽然已经在临床上应用已久，但机理并未阐明。近年来对人参的主要成分人参皂甙的研究很多，多集中在促进 ˇ 基金项目:天津市科委自然科学基金资助项目(编号:013608511)造血祖细胞增殖，诱导髓性白血病细胞凋亡，增强机体免疫功能等方面。国内学者研究发现人参皂甙不但能促进造血干/祖细胞增殖，并且能诱导定向分化 [1] 。但人参皂甙Rg1和Rb1对造血干细胞凋亡的影响尚未见报道。本研究观察了人参皂甙Rg1和Rb1对撤除细胞因子引起的脐血造血细胞凋亡的拮抗作用，以期在细胞水平上为人参皂甙“补气养血”功效的作用机制提供更多的实验室证据。
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1 材料与方法
1.1 标本来源 脐血采自天津医科大学第二附属医院和天津市中心妇产科医院，无菌条件下采集正常足月分娩的胎儿脐带血，母亲和新生儿均应健康，肝素抗凝。采集后4h内用相对密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞(MNC)，洗涤，计数备用。
1.2 CD34 + 细胞的分离及纯度分析 利用德国Miltenyi Biotec公司CD34 + 细胞单克隆抗体免疫磁珠分离系统(MACS)分离富集CD34 + 细胞备用。分离方法依试剂盒说明书进行。流式细胞仪检测CD34 + 细胞纯度:取纯化后细胞3×10 4 加入10μl FITC-CD34荧光抗体，阴性对照为FITC-IgG荧光抗体(BD公司产品)，用FACScan(BDIS公司)流式细胞仪分析，结果用LysisⅡ软件处理。
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1.3 CD34 + 细胞液体培养扩增 取24孔板，StemSpan TM SFEM无血清液体培养基建立1ml/孔培养体系，CD34 + 细胞5×10 4 个/孔，每孔加入细胞因子TPO50μg/L、SCF50μg/L，置于37℃、5%CO 2 、100%饱和湿度的CO 2 孵箱中，培养7天。收集细胞，PBS洗涤2遍后悬浮于MACS缓冲液中，台盼蓝染色计数细胞总数。
1.4 人参皂甙Rg1和Rb1撤除细胞因子引起脐血细胞凋亡的干预作用 24孔板中，取扩增7天后脐血细胞5×10 4 个/孔，1ml/孔，撤因子组不加任何细胞因子;人参皂甙干预组加入不同浓度的Rg1(2.5mg/L、5mg/L、10mg/L)，分别设为Rg1-2.5组，Rg1-5组，Rg1-10组;不用浓度的Rb1(5mg/L、10mg/L)，分别设为Rb1-5组，Rb1-10组，混匀，撤因子组设6个复孔，其他每组设3个复孔。置于37℃、5%CO 2 、100%饱和湿度的CO 2 孵箱中，分别取培养24h和72h的适量细胞，以备用于细胞凋亡检测。
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1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 撤除细胞因子培养24h后，各取1×10 6 个细胞，PBS洗涤，并用1×Binding Buffer(试剂盒中提供)使浓度为1×10 6 个/ml;转移1×10 5 个细胞(100μl)到5ml流式专用管，另取等量3管细胞做对照管;实验管加入5μl FITC-Annexin-Ⅴ和5μl PI，3个对照管:(1)只加5μl FITC-Annexin-Ⅴ;(2)只加5μl PI;(3)两者都不加;混匀，25℃避光孵育15～30min;各管加入400μl1×Bindˉing Buffer，1h之内用流式细胞仪CellQuest软件分析，观察Annexin V + /PI - 早期凋亡细胞群，检测细胞凋亡率。
1.6 Caspase-3活性测定 撤除细胞因子培养24h、72h后，取1×10 5 个细胞，洗涤，加100μl细胞裂解液;冰浴10min，离心10000×g，1min，移上清入另一新管，取出20μl以测总蛋白值;其余上清移入96孔酶标，加入50μl细胞裂解液，50μl2×反应缓冲液工作液，5μlCaspase-3鄙色底物(DEVD-pNA);37℃孵育1～2h;用酶标分析仪读取450nm吸光度值;以总蛋白值校正，设定撤除细胞因子组Caspase-3相对活性为1.00。
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1.7 统计学方法 数据用SPSS10.0统计软件分析，用均数±标准差(ˉx±s)表示，多组均数之间比较用方差分析，进一步两两比较用q检验。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 脐血CD34 + 细胞的分离和纯化 实验处理的10份新鲜脐血标本中，体积平均为(78.6±21.7)ml(范围为59～134ml)，经Ficoll分离后，MNC为(5.03±1.94)×10 8 个(范围为2.8×10 8 ～8.9×10 8 个)。经MACS分离系统纯化后，CD34 + 细胞为(5.9±2.4)×10 5 个(范围为3.9×10 5 ～1.53×10 6 )，经流式细胞仪检测，CD34 + 细胞纯度为(97.65± 2.28)%(范围为93.27%～98.85%)。
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2.2 Rg1、Rb1对撤除细胞因子24h细胞凋亡率及Caspase-3蛋白相对表达的影响 表1的结果显示，撤除细胞因子24h后，撤除细胞因子组细胞凋亡率明显高于各Rg1、Rb1实验组(P<0.01)，Caspase-3活性也较各实验组明显增加。说明Rg1和Rb1对撤除细胞因子引起的细胞凋亡有抑制作用，并可减少Caspase-3蛋白的激活。
表1 Rg1、Rb1对撤除细胞因子24h细胞凋亡率及Caspase-3蛋白活性的影响 (略)
2.3 Rg1、Rb1对撤除细胞因子72h后细胞Caspase-3蛋白活性的影响 如表2所示，撤除细胞因子72h后，除Rg1-10组外，其他各Rg1、Rb1实验组细胞中Caspase-3活性明显低于撤除细胞因子组(P<0.01)，说明Rg1和Rb1对撤除细胞因子引起的Caspase-3蛋白的激活有抑制作用。
表2 Rg1、Rb1对撤除细胞因子72h后细胞Caspase-3蛋白活性的影响 (略)
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3 讨论
人参为我国传统中药中的滋补珍品，经临床应用证实人参具有明显的抗应激作用，可增强机体对各种有害刺激的防御能力，促进红细胞生成素的生成，提高机体免疫力等。人参总皂甙(ginsenosides，GS)按单体皂甙元所含羟基量的不同分为人参二醇组皂甙(Panaxadiols，PDGS，包括Rb1、Rb2等)和人参三醇组皂甙(Panaxtriols，PTGS，包括Rg1、Rg2等) [1] 。
本实验研究表明，人参皂甙Rg1和Rb1对脐血细胞撤除细胞因子后诱发的凋亡有抑制作用，经各浓度Rg1(2.5 mg/L、5mg/L、10mg/L);Rb1(5mg/L、10mg/L)处理后，撤除细胞因子培养24h后，用流式细胞仪检测，Annexin V + /PI - 早期凋亡细胞群明显减少，细胞凋亡率均明显下降，提示Rg1和Rb1对此凋亡有很好的细胞保护作用。
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目前公认，天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶(Casˉpase)在细胞凋亡调节中过程中起着关键作用。正常情况下，胞质中的Caspase-3(CPP32/Apopain/Yama)以无活性的酶原形式存在，只有当细胞凋亡时，才被激活为有活性的Caspase-3。Caspase-3激活后可诱导多种细胞死亡，又称其为“死亡蛋白”，是介导细胞凋亡的重要的下游效应因子 [2，3] 。
Ohta等 [4] 的研究表明，撤除细胞因子，可使造血干细胞Caspase-3/CPP32表达上调，反映撤除细胞因子诱导的造血干细胞凋亡与Caspase-3/CPP32途径有关;本实验研究发现，Rg1或Rb1抗撤除细胞因子诱导的脐血细胞凋亡作用与降低Caspase-3的表达有密切关系，并且此种拮抗凋亡的作用与浓度有一定关系。经一定浓度的Rg1，Rb1处理后，撤除细胞因子培养24h和72h后，较撤除细胞因子组，Caspase-3相对活性明显降低。
, http://www.100md.com 细胞凋亡是一种受基因调控的主动性细胞死亡，表现为凋亡信号通路的启动及相关基因的表达。许多研究显示，人参皂甙有拮抗细胞凋亡的作用 [5，6] 。江雁等 [7] 研究发现人参皂甙可拮抗由于去除血清而引起的细胞凋亡，促进脐血细胞存活。陈晓春等 [8]研究发现，Rg1抗凋亡的作用与Caspase-3的激活及Bcl-2和Bax蛋白的参与有密切关系。Bcl-2是其中一种关键的细胞凋亡的抑制基因，Bax，Bad则是细胞凋亡的促进基因，近年来的研究证实，人参皂甙GS和Rb1具有抑制缺血再灌注心肌细胞凋亡的作用，机制之一 [9] 是通过促进Bcl-2蛋白表达而实现的。有报道显示 [10，11] 人参皂甙Rb1通过下调缺血再灌注时心肌细胞中的促凋亡基因Bax，Bad，Fas的表达，并增加Bcl-2/Bax，Bcl-2/Bad以及Bcl-2/Fas比值，这一机制可能具有抑制缺血再灌注心肌细胞凋亡的作用，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。
我们的研究表明，Rg1和Rb1抗撤除细胞因子诱导的脐血细胞凋亡作用与Caspase-3的表达有密切关系。细胞凋亡是一个非常复杂，而且涉及许多因素共同作用的过程，细胞凋亡的具体机制及影响因素目前依然是国内外学者研究的热门课题。我们的实验研究了人参皂甙Rg1，Rb1拮抗撤除细胞因子引起的脐血细胞凋亡的作用，并初步分析了细胞凋亡的下游效应因子Caspase-3蛋白的相对活性。当然，这一拮抗凋亡作用的确切机制仍需要进一步研究探讨。如在Rg1和Rb1抗凋亡的过程中，Bcl-2，Bax，Bad，Fas等基因在此过程中的表达如何，以及与下游效应因子Caspase-3或其他Caspase表达的关系如何。
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由此可见，人参皂甙(包括人参总皂甙，人参皂甙Rg1，Rb1等)在体外培养体系中能够抑制撤除细胞因子诱导的细胞凋亡。作用机制与抑制Caspase-3的被激活有关。在证实了人参总皂甙及单体有促进脐血CD34 + 细胞体外扩增的作用之后 [12] ，我们又从其拮抗细胞凋亡的功效上作了探讨，再次证实了人参皂甙具有类似于细胞因子支持脐血造血干细胞体外扩增的作用。我们的研究不仅对传统中药的作用机制进行了探讨，也为找到中药中的适宜于现代化开发的有效成分提供了实验证据。
参考文献
1 金锦梅，Tao Helen，高瑞兰，等.人参皂甙对CD34 + 造血干/祖细胞的增殖和分化作用.中国中西医结合杂志，2000，20(9):673-676.
2 马艳萍，邹萍，肖娟，等.Caspase-3在脐血CD34 + 造血干/祖细胞中的表达及意义.临床血液学杂志，2002，15(2):62-66.
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3 Widmann C，Gibson S，Johnson GL.Caspase-dependent cleavage of signaling proteins during apoptosis.J Bio Chem，1998，273:7141-7147.
4 Wang LS，Liu HJ，Xia ZB，et al.Expression and activation of caspse-3/CPP32in CD34 + cord blood is linked to apoptosis after growth factor withdrawal.Experimental Hematology，2000，28，907-915.
5 陈立波，赵洪序，张秀和，等.体外循环中人参二醇组皂甙的心肌保护作用.中华胸心血管外科杂志，1998，14:366-368.
6 刘晓春，刘正湘，施静.人参对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响的实验研究.中国组织化学与细胞化学杂志，2000，9:261-263.
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7 江雁.人参皂甙拮抗脐血细胞凋亡作用的初步探索.天津医科大学学报，2000，5(2)
:163-164.
8 陈晓春，朱元贵，王小众，等.人参皂甙Rg1对PC12细胞凋亡保护作用的可能机制.药学学报，2001，36(6):411-414.
9 Maffei-Facino R，Carini M，Aldini G，et al.Panax pinseng administraˉtion in the rat prevents myocardial ischemia-reperfusion damage inˉduced by hyperbaric oxygen:evidence for an antioxidant intervention.Planta Med，1999，65:614-619.
10 蓝荣芳，李志刚，刘正湘.人参皂甙Rb-1对大鼠缺血再灌注心肌细胞Bcl-2、Bax、Bad、Fas基因表达的影响.中国组织化学与细胞化学杂志，2002，11(2):228-232.
11 刘正湘，胡丽春，刘晓春，等.人参对大鼠缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡及bcl-2基因表达的影响.华中科技大学学报(医学版)，2002，31(4):376-378.
12 陈晓建，郭若霖，万晓华，等.人参总皂甙及单体对脐血CD34 + 细胞体外扩增的影响.中国综合临床，2003，19(7):587-589.
作者单位:300211天津医院骨研所
(收稿日期:2003-12-25)
(编辑 小川), 百拇医药
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关键词 细胞凋亡 脐血CD34 + 细胞 Caspase-3 人参皂甙
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)04-0385-03
Effects of ginsenosides Rg1and Rb1 on the
apoptosis of CD34 + cells isolated from umbilical cordal blood
Guo Ruolin，Wan Xiaohua，Chen Xiaojian，et al.
Tianjin Hospital，Tianjin300211.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of ginsenosides Rg1and Rb1during umbilical cordal blood hematopoietic cells apoptosis induced by growth factors withdrawal.Methods Human umbilical cordal blood CD34 + stem cells were purified and obtained steriley.CD34 + cells were cultured in StemSpan TM SFEM serum-free medium containing cytokines TPO(50μg/L)and SCF(50μg/L)for7days.Then cells were collected and maintained in the same medium with the growth factors deprivation for24h and72h.The experimental groups were respectively treated with Rg1or Rb1with different concentrations.FITC-Annmexin-V/PI flow cyloanalyzer and Caspase-3colorimetˉric assay were respectively used to determine cell apoptosis rate and the activity of Caspase-3.Results 24hours afˉter the cytokines withdrawal，the apoptosis rate in control cells was(24.79±2.80)%;the apoptosis rate in Rg1(2.5 mg/L，5mg/L，10mg/L)groups were(12.35±2.07)%，(11.87±1.20)%and(13.91±0.50)%(P<0.01);in Rb1groups(5mg/L，10mg/L)were(17.88±0.65)%，(20.61±0.85%)(P<0.01)respectively.24hours and72hours after cytokines deprivation，Caspase-3activities in control groups were taken as1.00，the values in Rg1-2.5group were0.72±0.09and0.57±0.22(P<0.01)，in Rg1-5group were0.51±0.11and0.42±0.10(P<0.01)，in Rg1-10group were0.63±0.06(P<0.01)and0.83±0.12(P>0.05);in Rb1-5group were0.54±0.18and0.32±0.18(P<0.01)，in Rbl-10group were0.87±0.07(P>0.05)，0.55±0.03(P<0.01).Conclusion These results demonstrated that apoptosis induced by growth factors withdrawal of umbilical cordal blood hematopoietic cells can be inhibited by Rg1and Rb1and this effect was involved with Caspase-3signal pathway.
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Key words apoptosis umbilical cordal blood CD34 + cells caspase-3 ginsenosides
细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序的一种主动性的死亡过程，它涉及细胞内一系列的信号转导和调控过程。在造血过程中，细胞凋亡在调控细胞增殖、分化的平衡中起重要作用。人参“补气养血”的功效虽然已经在临床上应用已久，但机理并未阐明。近年来对人参的主要成分人参皂甙的研究很多，多集中在促进 ˇ 基金项目:天津市科委自然科学基金资助项目(编号:013608511)造血祖细胞增殖，诱导髓性白血病细胞凋亡，增强机体免疫功能等方面。国内学者研究发现人参皂甙不但能促进造血干/祖细胞增殖，并且能诱导定向分化 [1] 。但人参皂甙Rg1和Rb1对造血干细胞凋亡的影响尚未见报道。本研究观察了人参皂甙Rg1和Rb1对撤除细胞因子引起的脐血造血细胞凋亡的拮抗作用，以期在细胞水平上为人参皂甙“补气养血”功效的作用机制提供更多的实验室证据。
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1 材料与方法
1.1 标本来源 脐血采自天津医科大学第二附属医院和天津市中心妇产科医院，无菌条件下采集正常足月分娩的胎儿脐带血，母亲和新生儿均应健康，肝素抗凝。采集后4h内用相对密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞(MNC)，洗涤，计数备用。
1.2 CD34 + 细胞的分离及纯度分析 利用德国Miltenyi Biotec公司CD34 + 细胞单克隆抗体免疫磁珠分离系统(MACS)分离富集CD34 + 细胞备用。分离方法依试剂盒说明书进行。流式细胞仪检测CD34 + 细胞纯度:取纯化后细胞3×10 4 加入10μl FITC-CD34荧光抗体，阴性对照为FITC-IgG荧光抗体(BD公司产品)，用FACScan(BDIS公司)流式细胞仪分析，结果用LysisⅡ软件处理。
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1.3 CD34 + 细胞液体培养扩增 取24孔板，StemSpan TM SFEM无血清液体培养基建立1ml/孔培养体系，CD34 + 细胞5×10 4 个/孔，每孔加入细胞因子TPO50μg/L、SCF50μg/L，置于37℃、5%CO 2 、100%饱和湿度的CO 2 孵箱中，培养7天。收集细胞，PBS洗涤2遍后悬浮于MACS缓冲液中，台盼蓝染色计数细胞总数。
1.4 人参皂甙Rg1和Rb1撤除细胞因子引起脐血细胞凋亡的干预作用 24孔板中，取扩增7天后脐血细胞5×10 4 个/孔，1ml/孔，撤因子组不加任何细胞因子;人参皂甙干预组加入不同浓度的Rg1(2.5mg/L、5mg/L、10mg/L)，分别设为Rg1-2.5组，Rg1-5组，Rg1-10组;不用浓度的Rb1(5mg/L、10mg/L)，分别设为Rb1-5组，Rb1-10组，混匀，撤因子组设6个复孔，其他每组设3个复孔。置于37℃、5%CO 2 、100%饱和湿度的CO 2 孵箱中，分别取培养24h和72h的适量细胞，以备用于细胞凋亡检测。
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1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 撤除细胞因子培养24h后，各取1×10 6 个细胞，PBS洗涤，并用1×Binding Buffer(试剂盒中提供)使浓度为1×10 6 个/ml;转移1×10 5 个细胞(100μl)到5ml流式专用管，另取等量3管细胞做对照管;实验管加入5μl FITC-Annexin-Ⅴ和5μl PI，3个对照管:(1)只加5μl FITC-Annexin-Ⅴ;(2)只加5μl PI;(3)两者都不加;混匀，25℃避光孵育15～30min;各管加入400μl1×Bindˉing Buffer，1h之内用流式细胞仪CellQuest软件分析，观察Annexin V + /PI - 早期凋亡细胞群，检测细胞凋亡率。
1.6 Caspase-3活性测定 撤除细胞因子培养24h、72h后，取1×10 5 个细胞，洗涤，加100μl细胞裂解液;冰浴10min，离心10000×g，1min，移上清入另一新管，取出20μl以测总蛋白值;其余上清移入96孔酶标，加入50μl细胞裂解液，50μl2×反应缓冲液工作液，5μlCaspase-3鄙色底物(DEVD-pNA);37℃孵育1～2h;用酶标分析仪读取450nm吸光度值;以总蛋白值校正，设定撤除细胞因子组Caspase-3相对活性为1.00。
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1.7 统计学方法 数据用SPSS10.0统计软件分析，用均数±标准差(ˉx±s)表示，多组均数之间比较用方差分析，进一步两两比较用q检验。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 脐血CD34 + 细胞的分离和纯化 实验处理的10份新鲜脐血标本中，体积平均为(78.6±21.7)ml(范围为59～134ml)，经Ficoll分离后，MNC为(5.03±1.94)×10 8 个(范围为2.8×10 8 ～8.9×10 8 个)。经MACS分离系统纯化后，CD34 + 细胞为(5.9±2.4)×10 5 个(范围为3.9×10 5 ～1.53×10 6 )，经流式细胞仪检测，CD34 + 细胞纯度为(97.65± 2.28)%(范围为93.27%～98.85%)。
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2.2 Rg1、Rb1对撤除细胞因子24h细胞凋亡率及Caspase-3蛋白相对表达的影响 表1的结果显示，撤除细胞因子24h后，撤除细胞因子组细胞凋亡率明显高于各Rg1、Rb1实验组(P<0.01)，Caspase-3活性也较各实验组明显增加。说明Rg1和Rb1对撤除细胞因子引起的细胞凋亡有抑制作用，并可减少Caspase-3蛋白的激活。
表1 Rg1、Rb1对撤除细胞因子24h细胞凋亡率及Caspase-3蛋白活性的影响 (略)
2.3 Rg1、Rb1对撤除细胞因子72h后细胞Caspase-3蛋白活性的影响 如表2所示，撤除细胞因子72h后，除Rg1-10组外，其他各Rg1、Rb1实验组细胞中Caspase-3活性明显低于撤除细胞因子组(P<0.01)，说明Rg1和Rb1对撤除细胞因子引起的Caspase-3蛋白的激活有抑制作用。
表2 Rg1、Rb1对撤除细胞因子72h后细胞Caspase-3蛋白活性的影响 (略)
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3 讨论
人参为我国传统中药中的滋补珍品，经临床应用证实人参具有明显的抗应激作用，可增强机体对各种有害刺激的防御能力，促进红细胞生成素的生成，提高机体免疫力等。人参总皂甙(ginsenosides，GS)按单体皂甙元所含羟基量的不同分为人参二醇组皂甙(Panaxadiols，PDGS，包括Rb1、Rb2等)和人参三醇组皂甙(Panaxtriols，PTGS，包括Rg1、Rg2等) [1] 。
本实验研究表明，人参皂甙Rg1和Rb1对脐血细胞撤除细胞因子后诱发的凋亡有抑制作用，经各浓度Rg1(2.5 mg/L、5mg/L、10mg/L);Rb1(5mg/L、10mg/L)处理后，撤除细胞因子培养24h后，用流式细胞仪检测，Annexin V + /PI - 早期凋亡细胞群明显减少，细胞凋亡率均明显下降，提示Rg1和Rb1对此凋亡有很好的细胞保护作用。
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目前公认，天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶(Casˉpase)在细胞凋亡调节中过程中起着关键作用。正常情况下，胞质中的Caspase-3(CPP32/Apopain/Yama)以无活性的酶原形式存在，只有当细胞凋亡时，才被激活为有活性的Caspase-3。Caspase-3激活后可诱导多种细胞死亡，又称其为“死亡蛋白”，是介导细胞凋亡的重要的下游效应因子 [2，3] 。
Ohta等 [4] 的研究表明，撤除细胞因子，可使造血干细胞Caspase-3/CPP32表达上调，反映撤除细胞因子诱导的造血干细胞凋亡与Caspase-3/CPP32途径有关;本实验研究发现，Rg1或Rb1抗撤除细胞因子诱导的脐血细胞凋亡作用与降低Caspase-3的表达有密切关系，并且此种拮抗凋亡的作用与浓度有一定关系。经一定浓度的Rg1，Rb1处理后，撤除细胞因子培养24h和72h后，较撤除细胞因子组，Caspase-3相对活性明显降低。
, http://www.100md.com 细胞凋亡是一种受基因调控的主动性细胞死亡，表现为凋亡信号通路的启动及相关基因的表达。许多研究显示，人参皂甙有拮抗细胞凋亡的作用 [5，6] 。江雁等 [7] 研究发现人参皂甙可拮抗由于去除血清而引起的细胞凋亡，促进脐血细胞存活。陈晓春等 [8]研究发现，Rg1抗凋亡的作用与Caspase-3的激活及Bcl-2和Bax蛋白的参与有密切关系。Bcl-2是其中一种关键的细胞凋亡的抑制基因，Bax，Bad则是细胞凋亡的促进基因，近年来的研究证实，人参皂甙GS和Rb1具有抑制缺血再灌注心肌细胞凋亡的作用，机制之一 [9] 是通过促进Bcl-2蛋白表达而实现的。有报道显示 [10，11] 人参皂甙Rb1通过下调缺血再灌注时心肌细胞中的促凋亡基因Bax，Bad，Fas的表达，并增加Bcl-2/Bax，Bcl-2/Bad以及Bcl-2/Fas比值，这一机制可能具有抑制缺血再灌注心肌细胞凋亡的作用，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。
我们的研究表明，Rg1和Rb1抗撤除细胞因子诱导的脐血细胞凋亡作用与Caspase-3的表达有密切关系。细胞凋亡是一个非常复杂，而且涉及许多因素共同作用的过程，细胞凋亡的具体机制及影响因素目前依然是国内外学者研究的热门课题。我们的实验研究了人参皂甙Rg1，Rb1拮抗撤除细胞因子引起的脐血细胞凋亡的作用，并初步分析了细胞凋亡的下游效应因子Caspase-3蛋白的相对活性。当然，这一拮抗凋亡作用的确切机制仍需要进一步研究探讨。如在Rg1和Rb1抗凋亡的过程中，Bcl-2，Bax，Bad，Fas等基因在此过程中的表达如何，以及与下游效应因子Caspase-3或其他Caspase表达的关系如何。
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由此可见，人参皂甙(包括人参总皂甙，人参皂甙Rg1，Rb1等)在体外培养体系中能够抑制撤除细胞因子诱导的细胞凋亡。作用机制与抑制Caspase-3的被激活有关。在证实了人参总皂甙及单体有促进脐血CD34 + 细胞体外扩增的作用之后 [12] ，我们又从其拮抗细胞凋亡的功效上作了探讨，再次证实了人参皂甙具有类似于细胞因子支持脐血造血干细胞体外扩增的作用。我们的研究不仅对传统中药的作用机制进行了探讨，也为找到中药中的适宜于现代化开发的有效成分提供了实验证据。
参考文献
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作者单位:300211天津医院骨研所
(收稿日期:2003-12-25)
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