时间分辨荧光免疫测定技术在HBV-M 定量检测及临床应用分析
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【摘要】 目的 研究乙肝病毒感染者血清免疫学标志物，利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测其含量结果与ELISA法结果的符合程度、灵敏度、特异性;了解TRFIA测定HBV-M的准确性、可行性及临床应用价值。方法 分别用TRFIA和ELISA法测定260例随机血清标本HBV-M结果及含量。结果 HBsAg(ELISA)阳性36例，TRFIA阳性40例，χ 2 =4，P<0.05，两法符合率98.46%;抗-HBs(ELISA)阳性130例，TRFIA阳性160例，χ 2 =30，P<0.01，两法符合率88.5%;HBeAg(ELISA)阳性17例，TRFIA阳性18例，χ 2 =1，P>0.05，两法符合率99.6%;抗-HBe(ELISA)阳性86例，TRFIA阳性73例，χ 2 =6.76，P<0.01，两法符合率90.4%;抗-HBc(ELISA)阳性54例，TRFIA阳性72例，χ 2 =15.6，P<0.01，两法符合率91.5%。结论TRFIA法与ELISA法比较，特异性、敏感性都高，TRFIA作用于HBV-M含量检测可为临床间接反映病毒的感染状况，同时也为临床疗效提供动力学观察及接种乙肝疫苗提供依据。
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关键词 HBV-M 时间分辨荧光免疫分析技术 酶联免疫吸附试验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)06-0486-02
The time-resolved fluoroimmunoassay TRFIA used in the
HBV-M ration test and the analysis on clinical application
Cai Yihe
Department of Laboratory，Chaozhou Central Hospital，Guangdong521021.
【Abstract】 Objective To study the substance of blood immunity HBV-M，Applying the technology of TRFIˉA to test the result and then compare itwith the result of the ELISA in fixness，sensivity and specificity and to compreˉhcnd the accuracy，feasibility and the value of clinical application in testing HBV-M by TRFIA.Methods To deterˉminate the result and content of260and HBV-M by TRFIA and ELISA respectirely.Results HBsAg positre is36by ELISA and40by TRFIA，χ 2 =4，P<0.05，the fix rate is98.46%;anti-HBs positve is130by ELISA，and160by TRFIA，χ 2=30，P<0.01;the fix rate is88.5%;HBeAg positive is17by ELISA，and18by TRFIA，χ2 =1，P>0.05;the fix rate is99.6%;Anti-HBe positve is86by ELISA，and73by TRFIA，χ 2 =6.76，P<0.01，the fix rate is90.4%;Anti-HBc positve is54by ELISA，and72by TRFIA，χ 2 =15.6，P<0.01，the fix rate is91.5%.Conˉclusion TRFIA has higher specificity and sensitivity than ELISA，TRFIA in testing HBV-M content may indirectly neflect the virus infection in clinical and offer dynamics observation in the clinical effects and basis in inoculation aˉgainst HBV.
, 百拇医药
Key words HBV-M TRFIA ELISA
目前国内临床实验室最常用的乙型肝炎病毒(HBV)感染者的血清学标志物检测主要靠ELISA法，由于ELISA法简单、方便、快速的优点在临床得到广泛应用，但受方法学本身的限制，它不能提供HBV-M的具体含量，只能作为阴阳性判断，故不可能完成HBV感染的动力学观察，而时间分辨荧光免疫技术的出现提供了对HBV-M进行定量检测的手段。本文采用TRFIA法对260份血清标本进行HBV-M检测，并与ELISA法结果进行比较和分析。现报告如下。
1 对象与方法
1.1 对象 血液标本均来自本院门诊及住院病人260例，无年龄性别要求。早晨空腹抽取静脉血，分离血清后立即检测。
1.2 检测试剂 ELISA试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司提供。TRFIA试剂盒由上海新波生物技术有限公司提供。
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1.3 仪器 EL-312e酶标仪。Anytest2000时间分辨荧光分析仪。Egate2310全自动洗涤。2510变频振荡器。
1.4 质控物 由卫生部临床检验中心提供。
1.5 方法 ELISA法和TRFIA法测定HBV-M，严格按照试剂操作规程操作，同时加入相应质控物监测。
1.6 统计学方法 采用配对χ 2 检验。
2 结果
2.1 HBsAg ELISA法 结果阳性36例，阳性率13.8%;TRˉFIA法结果阳性40例，阳性率15.4%;两法都阳性36例，两法都阴性220例，TRFIA阳性而ELISA阴性4例，TRFIA阴性而ELISA阳性无，采用配对χ 2 检验，χ 2 =4，P<0.05，差异有显著性，两法比较符合率为256/260=98.46%;其中HBˉsAg含量0.5～5ng/ml占4例，6～25ng/ml占7例，26～50ng/ml占8例，51～150ng/ml占8例，150ng/ml以上占13例。
, 百拇医药
2.2 抗-HBs ELISA法 结果阳性130例，阳性率50%;TRFIA法结果阳性160例，阳性率61.5%;两法都阳性130例，两法都阴性100例，TRFIA阳性而ELISA阴性30例，TRˉFIA阴性而ELISA阳性无，采用配对χ 2 检验，χ 2 =30，P<0.01，差异有非常显著性，两法比较符合率为230/260=88.5%;其中抗-HBs含量10～100mIU/ml占79例，101～200mIU/ml占16例，201～1000mIU/ml占46例，1000mIU/ml以上占19例。
2.3 HBeAg ELISA法 结果阳性17例，阳性率6.5%;TRˉFIA法结果阳性18例，阳性率6.9%;两法都阳性17例，两法都阴性242例，TRFIA阳性而ELISA阴性1例，TRFIA阴性而ELISA阳性无，采用配对χ 2 检验，χ 2 =1，P>0.05，差异无显著性，两法比较符合率为259/260=99.6%;其中HBeAg含量0.03～0.1NCU/ml占1例，0.11～0.5NCU/ml占4例，0.51～2NCU/ml11例，2.1～8NCU/ml2例。
, 百拇医药
2.4 抗-HBe ELISA法 结果阳性86例，阳性率33%;TRˉFIA法结果阳性73例，阳性率28%;两法都阳性67例，两法都阴性168例，TRFIA阳性而ELISA阴性6例，TRFIA阴性而ELISA阳性19例，采用配对χ 2 检验，χ 2 =6.76，P<0.01，差异有非常显著性，两法比较符合率为235/260=90.4%;其中抗-HBe含量1.5～2NCU/ml4例，2.1～5NCU/ml14例，5.1～10NCU/ml23例，20NCU/ml以上24例。
2.5 抗-HBc ELISA法 结果阳性54例，阳性率20.8%;TRFIA法结果阳性72例，阳性率27.7%;两法都阳性52例，两法都阴性186例，TRFIA阳性而ELISA阴性20例，TRFIA阴性而ELISA阳性2例，采用配对χ 2 检验，χ 2 =15.6P<0.01，差异有非常显著性，两法比较符合率为238/260=91.5%;其中抗-HBc含量0.1～0.5NCU/ml11例，0.51～1NCU/ml1例，1～5NCU/ml10例，5.1～10NCU/ml36例，10NCU/ml以上14例。
, 百拇医药
3 讨论
TRFIA法检测HBV-M与ELISA法相比，其特异性和敏感性都高，特别是能够检测低浓度HBsAg和HBeAg，对减少HBV感染漏诊和误诊具有较高价值。因HBsAg阳性是HBV感染的金标准[1] 。有学者对血清呈低水平存在、血清HBsAg约在5ng/ml以下者做过研究 [2] ，对象是非肝炎患者住院人群，结果是占总人群的2.34%，占HBsAg阳性人群的23.16%。而本文只检测出1.5%和10%。此结果存在一定差异，有待进一步探讨。抗-HBs是对HBV的保护性免疫指标，有学者认为仍有保护作用的最低抗-HBs的浓度为10mIU/ml，提出基础免疫后高度抗体滴度的再接种方案，最后一次接种后4周，如抗-HBs<10mIU/ml立即再接种;10～100mIU/ml，3～6个月后必须再接种 [3] 。实际工作中发现，抗-HBs定量检测对于监测、指导肝移植中乙型肝炎免疫球蛋白的应用具有肯定作用。说明了对抗-HBs定量的检测是很有必要的，同时也可了解人体是否有抗- HBs、是否有足够的量可抵御HBV的侵袭。本文抗-HBs结果显示，160例TRFIA法阳性79例，抗-HBs浓度值在10～100mIU/ml以内，此量因无确切的抵御能力，建议加强预防措施。对于抗-HBs阴性的人群更应做好预防，至于100mIU/ml以上含量的人群，说明他们已有好的抵御能力。另外结果提示，ELISA法的抗-HBe阳性率明显高于TRFIA法，由于本身方法学的限制，最好在发出报告时加以综合分析或提高Cutoff值。
, 百拇医药
从实验结果表明HBV-M各项阳性结果都显示了不同的含量，说明了人体感染HBV后，病毒的复制程度或经抗病毒药物治疗后，HBV-M含量也随之变化，提示了动力学关系。据所掌握的资料观察，患者治疗前及治疗后HBV-M含量变化结果比较。见表1。
表1 2例病人HBV-M治疗前后结果比较 略
可以看出，HBsAg和HBeAg逐渐下降，而所有抗体逐步增高，这说明抗病毒治疗是有效的，同时也给临床预后判断提供了依据。
目前临床上对检测HBV-M的血清学常用方法是血清免疫学检测，也就是检测患者对病毒侵染机体产生的免疫反应，因此免疫血清学指标可间接反映病毒的感染状况。随着检测水平的不断提高，TRFIA技术的问世给免疫自身的研究和发展提供了新的手段。虽然DNA是直接反映病毒本身在机体内的存在情况，而人们越来越意识到两者既相关，又不尽一致，高灵敏准确的HBV-M定量结果可与HBV-DNA的检测相互印证，给临床提供更客观有效的实验报告，临床上需要将两者结合起来对患者进行综合诊断、治疗和预后等判断。如果在没有开展HBV-DNA项目检测的单位，HBV-M含量检测其本身也就是一个很好监测病毒动力学变化的辅助指标。
参考文献
1 陈紫榕.病毒性肝炎.北京:人民卫生出版社，2002，6，191.
2 陈瑜，钟步云，徐根云，等.低水平血清乙肝病毒表面抗原测定及其临床意义.中华检验医学杂志，2001，24:1.
3 Klaus-Peter Maier著，郝连杰等译.肝炎及其后果.第四版.北京:人民卫生出版社，1997，8，35.
作者单位: 521021广东省潮州市中心医院检验科
(编辑 海涛), 百拇医药
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关键词 HBV-M 时间分辨荧光免疫分析技术 酶联免疫吸附试验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)06-0486-02
The time-resolved fluoroimmunoassay TRFIA used in the
HBV-M ration test and the analysis on clinical application
Cai Yihe
Department of Laboratory，Chaozhou Central Hospital，Guangdong521021.
【Abstract】 Objective To study the substance of blood immunity HBV-M，Applying the technology of TRFIˉA to test the result and then compare itwith the result of the ELISA in fixness，sensivity and specificity and to compreˉhcnd the accuracy，feasibility and the value of clinical application in testing HBV-M by TRFIA.Methods To deterˉminate the result and content of260and HBV-M by TRFIA and ELISA respectirely.Results HBsAg positre is36by ELISA and40by TRFIA，χ 2 =4，P<0.05，the fix rate is98.46%;anti-HBs positve is130by ELISA，and160by TRFIA，χ 2=30，P<0.01;the fix rate is88.5%;HBeAg positive is17by ELISA，and18by TRFIA，χ2 =1，P>0.05;the fix rate is99.6%;Anti-HBe positve is86by ELISA，and73by TRFIA，χ 2 =6.76，P<0.01，the fix rate is90.4%;Anti-HBc positve is54by ELISA，and72by TRFIA，χ 2 =15.6，P<0.01，the fix rate is91.5%.Conˉclusion TRFIA has higher specificity and sensitivity than ELISA，TRFIA in testing HBV-M content may indirectly neflect the virus infection in clinical and offer dynamics observation in the clinical effects and basis in inoculation aˉgainst HBV.
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Key words HBV-M TRFIA ELISA
目前国内临床实验室最常用的乙型肝炎病毒(HBV)感染者的血清学标志物检测主要靠ELISA法，由于ELISA法简单、方便、快速的优点在临床得到广泛应用，但受方法学本身的限制，它不能提供HBV-M的具体含量，只能作为阴阳性判断，故不可能完成HBV感染的动力学观察，而时间分辨荧光免疫技术的出现提供了对HBV-M进行定量检测的手段。本文采用TRFIA法对260份血清标本进行HBV-M检测，并与ELISA法结果进行比较和分析。现报告如下。
1 对象与方法
1.1 对象 血液标本均来自本院门诊及住院病人260例，无年龄性别要求。早晨空腹抽取静脉血，分离血清后立即检测。
1.2 检测试剂 ELISA试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司提供。TRFIA试剂盒由上海新波生物技术有限公司提供。
, http://www.100md.com
1.3 仪器 EL-312e酶标仪。Anytest2000时间分辨荧光分析仪。Egate2310全自动洗涤。2510变频振荡器。
1.4 质控物 由卫生部临床检验中心提供。
1.5 方法 ELISA法和TRFIA法测定HBV-M，严格按照试剂操作规程操作，同时加入相应质控物监测。
1.6 统计学方法 采用配对χ 2 检验。
2 结果
2.1 HBsAg ELISA法 结果阳性36例，阳性率13.8%;TRˉFIA法结果阳性40例，阳性率15.4%;两法都阳性36例，两法都阴性220例，TRFIA阳性而ELISA阴性4例，TRFIA阴性而ELISA阳性无，采用配对χ 2 检验，χ 2 =4，P<0.05，差异有显著性，两法比较符合率为256/260=98.46%;其中HBˉsAg含量0.5～5ng/ml占4例，6～25ng/ml占7例，26～50ng/ml占8例，51～150ng/ml占8例，150ng/ml以上占13例。
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2.2 抗-HBs ELISA法 结果阳性130例，阳性率50%;TRFIA法结果阳性160例，阳性率61.5%;两法都阳性130例，两法都阴性100例，TRFIA阳性而ELISA阴性30例，TRˉFIA阴性而ELISA阳性无，采用配对χ 2 检验，χ 2 =30，P<0.01，差异有非常显著性，两法比较符合率为230/260=88.5%;其中抗-HBs含量10～100mIU/ml占79例，101～200mIU/ml占16例，201～1000mIU/ml占46例，1000mIU/ml以上占19例。
2.3 HBeAg ELISA法 结果阳性17例，阳性率6.5%;TRˉFIA法结果阳性18例，阳性率6.9%;两法都阳性17例，两法都阴性242例，TRFIA阳性而ELISA阴性1例，TRFIA阴性而ELISA阳性无，采用配对χ 2 检验，χ 2 =1，P>0.05，差异无显著性，两法比较符合率为259/260=99.6%;其中HBeAg含量0.03～0.1NCU/ml占1例，0.11～0.5NCU/ml占4例，0.51～2NCU/ml11例，2.1～8NCU/ml2例。
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2.4 抗-HBe ELISA法 结果阳性86例，阳性率33%;TRˉFIA法结果阳性73例，阳性率28%;两法都阳性67例，两法都阴性168例，TRFIA阳性而ELISA阴性6例，TRFIA阴性而ELISA阳性19例，采用配对χ 2 检验，χ 2 =6.76，P<0.01，差异有非常显著性，两法比较符合率为235/260=90.4%;其中抗-HBe含量1.5～2NCU/ml4例，2.1～5NCU/ml14例，5.1～10NCU/ml23例，20NCU/ml以上24例。
2.5 抗-HBc ELISA法 结果阳性54例，阳性率20.8%;TRFIA法结果阳性72例，阳性率27.7%;两法都阳性52例，两法都阴性186例，TRFIA阳性而ELISA阴性20例，TRFIA阴性而ELISA阳性2例，采用配对χ 2 检验，χ 2 =15.6P<0.01，差异有非常显著性，两法比较符合率为238/260=91.5%;其中抗-HBc含量0.1～0.5NCU/ml11例，0.51～1NCU/ml1例，1～5NCU/ml10例，5.1～10NCU/ml36例，10NCU/ml以上14例。
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TRFIA法检测HBV-M与ELISA法相比，其特异性和敏感性都高，特别是能够检测低浓度HBsAg和HBeAg，对减少HBV感染漏诊和误诊具有较高价值。因HBsAg阳性是HBV感染的金标准[1] 。有学者对血清呈低水平存在、血清HBsAg约在5ng/ml以下者做过研究 [2] ，对象是非肝炎患者住院人群，结果是占总人群的2.34%，占HBsAg阳性人群的23.16%。而本文只检测出1.5%和10%。此结果存在一定差异，有待进一步探讨。抗-HBs是对HBV的保护性免疫指标，有学者认为仍有保护作用的最低抗-HBs的浓度为10mIU/ml，提出基础免疫后高度抗体滴度的再接种方案，最后一次接种后4周，如抗-HBs<10mIU/ml立即再接种;10～100mIU/ml，3～6个月后必须再接种 [3] 。实际工作中发现，抗-HBs定量检测对于监测、指导肝移植中乙型肝炎免疫球蛋白的应用具有肯定作用。说明了对抗-HBs定量的检测是很有必要的，同时也可了解人体是否有抗- HBs、是否有足够的量可抵御HBV的侵袭。本文抗-HBs结果显示，160例TRFIA法阳性79例，抗-HBs浓度值在10～100mIU/ml以内，此量因无确切的抵御能力，建议加强预防措施。对于抗-HBs阴性的人群更应做好预防，至于100mIU/ml以上含量的人群，说明他们已有好的抵御能力。另外结果提示，ELISA法的抗-HBe阳性率明显高于TRFIA法，由于本身方法学的限制，最好在发出报告时加以综合分析或提高Cutoff值。
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从实验结果表明HBV-M各项阳性结果都显示了不同的含量，说明了人体感染HBV后，病毒的复制程度或经抗病毒药物治疗后，HBV-M含量也随之变化，提示了动力学关系。据所掌握的资料观察，患者治疗前及治疗后HBV-M含量变化结果比较。见表1。
表1 2例病人HBV-M治疗前后结果比较 略
可以看出，HBsAg和HBeAg逐渐下降，而所有抗体逐步增高，这说明抗病毒治疗是有效的，同时也给临床预后判断提供了依据。
目前临床上对检测HBV-M的血清学常用方法是血清免疫学检测，也就是检测患者对病毒侵染机体产生的免疫反应，因此免疫血清学指标可间接反映病毒的感染状况。随着检测水平的不断提高，TRFIA技术的问世给免疫自身的研究和发展提供了新的手段。虽然DNA是直接反映病毒本身在机体内的存在情况，而人们越来越意识到两者既相关，又不尽一致，高灵敏准确的HBV-M定量结果可与HBV-DNA的检测相互印证，给临床提供更客观有效的实验报告，临床上需要将两者结合起来对患者进行综合诊断、治疗和预后等判断。如果在没有开展HBV-DNA项目检测的单位，HBV-M含量检测其本身也就是一个很好监测病毒动力学变化的辅助指标。
参考文献
1 陈紫榕.病毒性肝炎.北京:人民卫生出版社，2002，6，191.
2 陈瑜，钟步云，徐根云，等.低水平血清乙肝病毒表面抗原测定及其临床意义.中华检验医学杂志，2001，24:1.
3 Klaus-Peter Maier著，郝连杰等译.肝炎及其后果.第四版.北京:人民卫生出版社，1997，8，35.
作者单位: 521021广东省潮州市中心医院检验科
(编辑 海涛), 百拇医药