黄芪对柯萨奇B 3 病毒性心肌炎小鼠白介素12水平的影响
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【摘要】 目的 探讨黄芪干预柯萨奇B 3 (CVB 3 )病毒性心肌炎小鼠动物模型白介素12水平的影响。方法 CVB 3 诱导Balb/c小鼠心肌炎为研究对象，给予黄芪进行干预，分别于用药后第3、7和14天测定小鼠血清IL-12水平。同时测定心脏组织中病毒滴度，心肌病理学检查。结果 黄芪组小鼠血清IL-12水平明显升高，早期提高宿主对病毒免疫应答能力，能有效提高CVB 3 感染小鼠VMC血清IL-12水平，小鼠心脏组织中病毒滴度下降，心肌损害较轻。结论 黄芪干预病毒性心肌炎(VMC)小鼠在免疫损伤中起到一定的保护作用，早期降低心脏组织中病毒滴度，减轻心脏损伤程度，有效改善预后。
关键词 黄芪 病毒性心肌炎 IL-12
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)08-0695-03
, 百拇医药 Influences of astragulas injection on interleukin-12content
of mice with myocarditis induced by coxsackie virus B 3
Han Qingrong，Huang Xingyuan，Jiang Zhongyan
Department of Pediatric，Yiling Hospital，Yichang443100.
【Abstract】 Objective To investigate the influences of astragulas injection
on interleukin-12(IL-12)conˉtent of mice with myocarditis induced by coxsackie virus B 3 (CVB 3 ).Methods CVB 3 induced myocarditis on Balb/C mice，and treament started on day0with astragulas injection for14days.We determined IL-12on mice on day3，7，and14.The viral titer of the heart and the pathologic examination were examined concurrently.Results Serum IL-12was siginificantly elevated in the spleen in group stragulas.The viral titer of heart was lower and mice in group stragulas had less myocarditis necrosis and cellular infiltration.Conclusion Stragulas injection is beneficial to mice with CVBS 3 induced myocardotis，it promotes early innate immune responses of the host.Stragulas injection can effiˉciently enhance IL-12content，reduce the viral titer of heart and myocarditis necrosis.
, 百拇医药
Key words stragulas injection myocarditis interleukin-12
病毒性心肌炎(VMC)的发病率近年来表现为增长趋势，其主要为柯萨奇B 3 (CVB 3 )病毒感染所致。动物实验证明，病毒性心肌炎发病包括2个阶段:感染后第一周以病毒对心肌的直接损伤为主;第二周开始以免疫反应对心肌的损伤为主，表现为更广泛的心肌坏死和间质单核细胞的浸润 [1]。IL-12是一个具有多种生物功能的细胞因子，在细胞免疫应答过程中具有重要作用，通过调节NK细胞，巨噬细胞介导的非特异性免疫和Th细胞，细胞毒性T细胞介导的特异性免疫作用。IL-12在VMC早期的非特异性免疫和随后的抗原性适应性免疫过程均扮演了极其重要的角色，它是一个多功能的免疫调节因子 [2] 。黄芪中有效成分黄芪多糖具有多方面免疫调节和免疫增强作用，增强小鼠NK细胞活性，提高机体抗病毒能力，减轻病毒对机体的炎症损伤[3] 。本实验旨在观察黄芪对CVB 3 病毒性心肌炎小鼠IL-12水平的影响，为黄芪治疗VMC提供另一理论依据。
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1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂
1.1.1 动物 近交系Balb/c雄性4～6周龄小鼠，体重12g左右。由湖北省医学实验动物中心提供。
1.1.2 病毒 柯萨奇病毒B 3 亲心肌M株(CVB 3m )，由武汉大学医学院病毒研究所提供，病毒滴度:3×10 8 PFU/ml，Hela细胞传代。
1.1.3 试剂 由晶美生物工程有限公司提供小鼠IL-12(P40)ELISA试剂盒。黄芪注射液为成都地奥九泓制药厂生产。
1.2 实验方法和步骤
1.2.1 动物分组 雄性Balb/c小鼠90只，随机分成3组，每组30只，A组(黄芪组):小鼠接种CVB 3m 病毒1h后开始连续14天经腹腔注射黄芪注射液，剂量为每只每天0.15ml，均定时给药;B组(对照组):小鼠接种CVB 3m 病毒1h后开始连续14天注射等体积生理盐水。C组(空白组):小鼠接种CVB 3m 病毒后不予任何处理。
, 百拇医药
1.2.2 病毒性心肌炎动物模型的建立 全部Balb/c小鼠实验当天腹腔注射CVB 3m ，每只0.2ml，滴度为3×10 8 PFU/ml。
1.2.3 小鼠接种病毒后分别于第3，7，14天每次每组8只小鼠，眼球取血后分离血清，-20℃低温保存待检。取心脏中下1/3处，用10%甲醛固定待用。取其余心室组织于-70℃保存备用。
1.2.4 病毒滴度检测 病毒接种后第3天心肌标本每组各8份，采用空斑测定。
1.2.5 血清IL-12(P40)检测 病毒接种第3、7和14天，A、B、C各组每次8只小鼠取血，分离血清，-20℃低温保存待检。采用双抗体夹心ELISA法。
1.2.6 心肌组织病理学检测 病毒接种后第3、14天每组各4只取心肌标本固定于10%甲醛72h，脱水，石蜡包埋，切片，苏木素、伊红(HE)染色光镜下观察。心脏坏死的范围和细胞浸润范围用对照双盲法评分，心脏病理评分标准 [4] :0分:无心肌损害;1级(mild):1至2个小病灶，2级(sight):数个小病灶;3级(moclerate):多个大病灶或严重的大病灶心肌损害;4级(severe):多个大病灶，弥漫性浸润或坏死。
, 百拇医药
1.3 统计学方法 实验结果均以均数±标准差表示，心肌病毒滴度、心肌病理评分、血清IL-12水平采用Kruskal-Wallis检验(即成组设计多个样本比较的秩和检验)。P<0.05认为差异有显著性。
2 结果
2.1 心脏重量/体重之比 在病毒接种后第7天作心肌组织病理学检查前称取小鼠体重(BW)和心脏重量(HW)。心脏重量/体重(HW/BW)之比，黄芪组较对照组低，差异有显著性(n=8，P<0.05)。见表1。
表1 各组小鼠心脏重量/体重之比(略)
2.2 心肌病毒滴度 病毒接种第3天作心肌病毒滴度测定，B组(生理盐水对照组)为3.77±0.281gTCID 50 /mg，C组(空白组)为3.86±0.361gTCID 50 /mg，而A组(黄芪组)为1.76±0.181gTCID 50 /mg，较B组和C组显著为低(P<0.01)，说明黄芪可抑制CVB 3m 复制(见图1)。
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图1 略
2.3 心肌病理改变 在病毒接种后第3和第14天作心肌组织病理学检查，观察心肌坏死和细胞浸润程度并评分。在A组14天时心肌坏死和细胞浸润程度评分均较B组和C组低(n=4，P<0.05)。见表2。
表2 病毒接种14天各组小鼠心肌组织病理学评分 (略)
2.4 血清IL-12水平 与B组(对照组)相比，A组(黄芪组)的血清IL-12水平在病毒接种后的第3和第7天为高(n=8，P<0.05)，血清IL-12水平峰值出现在第7天，而在第14天时，两组差异无显著性(n=8，P>0.05)。见表3。
表3 病毒接种3、7和14天各组小鼠血清IL-12水平(略)
3 讨论
近来研究表明柯萨奇B 3 (CVB 3 )感染后，其RNA可长期存在于心肌细胞内，病毒本身或(和)病毒所致心肌病理损伤可引发病毒性心肌炎后期免疫损伤，而细胞因子在免疫损伤过程中的作用近年来备受关注。
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白介素IL-12，又名细胞毒淋巴细胞成熟因子或自然杀伤细胞刺激因子，它由P40、P35两个亚基组成异源二聚体，由不相关的基因编码。编码鼠P40和P35的基因尚未精确定位，与人的这些基因分别具有60%～70%的序列同源性。IL-12能促进CD 4 T分化辅助细胞(Th1)的增殖，诱导NK细胞和T细胞产生细胞因子;提高NK细胞的细胞毒性;促进细胞毒性T(CTL)细胞的形成等。IL-12在机体病毒感染早期的非特异性免疫和随后的抗原特异性的适应性免疫过程中均扮演重要的角色，它是一个多功能的免疫调节因子。Hill SL [5] 实验表明，在CVB 3感染所致病毒性心肌炎小鼠早期感染至随后的自动免疫损伤过程，NO在早期阶段起保护作用，而使用IL-12治疗能明显减轻自动免疫性心肌的损害。而Erikssou [6] 等发现，IL-12P 40 缺陷老鼠在病毒感染的背景下，不易感染病毒性心肌炎，IL-12/INF-γ轴对自动免疫性心肌炎的发展具有双重效应。近来OKuˉra [7] 等研究指出:IL-12与IL-2通过刺激CD4+ T细胞可造成病毒性自体免疫性心肌损伤，同时通过免疫系统内在调节机制IL-12可调控Th1/Th2平衡来影响免疫性心肌炎的临床过程。
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黄芪具有多方面的免疫调节和免疫增强作用，它既能促进抗体的生成，又能增加巨噬细胞吞噬病毒能力，还能增强NK细胞的活性，从而提高机体抵抗病毒能力，减轻病毒对机体的炎症损伤 [8] 。山东医科大学董杰德等证实黄芪能降低细胞对CVB 3m 病毒的敏感性，同时通过诱导产生干扰素(IFN)，增强心肌细胞抗病毒能力。本实验结果发现，用黄芪干预的CVB 3m 病毒性心肌炎Balb/c小鼠，其黄芪组小鼠血清IL-12的水平在VMC早期和晚期比对照组(盐水组)明显增高，特别在VMC早期IL-12水平两组存在显著差异。IL-12在VMC晚期增高不明显，两组无显著差异，这可能是感染早期由于黄芪干预后，早期随着小鼠IL-12水平的上升、NK细胞活性增强，在感染早期病毒得以被宿主部分清除，病毒滴度下降，减弱了病毒相关抗原或被改变的自身抗原的持续暴露，并可避免由此诱导出的针对这些抗原的体液免疫和细胞免疫的产生，从而避免了因此而造成的心肌渐进性损害。
黄芪可明显提高CVB 3 病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型早期血清IL-12水平，从而提高小鼠对病毒感染应答反应，发挥机体清除病毒作用，调节机体免疫功能，对病毒性心肌炎的后期心肌免疫损伤起到明显保护作用。心肌切片HE病理评分和早期心肌病毒滴度的测定亦证实了黄芪对病毒性心肌炎的保护和修复作用。
, 百拇医药
总之，黄芪可通过提高小鼠血清IL-12水平和NK细胞活性这对VMC具有较好的治疗作用和对心肌免疫性损伤的保护作用，具有良好的临床应用前景。
参考文献
1 Wolfgram LJ.Variation in the susceptibility to coxsakie-virus B 3 inˉduced myocarditis among different strains of mice.JImunol，1986，136(5):1846-1849.
2 Hilkens GM，snijders A，Snijdewint FG.Modulation of T-cell cytokine secretion by accessory cell-derived product.Eur respir J suppl，1996，22.90-94.
, http://www.100md.com
3 张晓明，扬景山.白细胞介素-12和黄芪多糖对小鼠NK细胞活性增强及形态的影响.北京医科大学学报，1991，23(3):208-210
4 Chiharu K，Yoshitok，Hiraoka YJ，et al.Cytokine and murine Coxsachievirus B 3 myocarditis:Interleukin-2Suppressed myocarditis in the early Stage bat enbanced the condition in the subgueut stage.Circuˉlation，1994，2228:247-250.
5 Hill SL，Rose NR.The transition from Vral to autoimmune myocarditc.Autoimm unity，2001，34(3):169-176.
, 百拇医药 6 Eriksson U，KunerMO，sebald W.et al.Dual role of the IL-12/LFN-gamma axis in the davelopment of autoimmune myocarditis.induction by IL-12and production by IFN-gamma.J Immunol，2001，167(9):5464-5469.
7 Okura Yuji，Takrda，Kazuyoshi，et al.Recombinant murine InterleuKin-12faci litates Induction ofcardiac myosin-sepecific Type1Helper T cell in Rats.Cardiac Biology，1998，82(10):1035-1042.
8 张晓明，杨景山.白细胞介素-2和黄芪多糖对小鼠NK细胞活性和增殖及形态的影响.北京医科大学学报，1991，23(3):176-178.
作者单位:1 443100湖北省宜昌市夷陵医院儿科
2 430060武汉大学人民医院儿科
(编辑 秋实), 百拇医药
关键词 黄芪 病毒性心肌炎 IL-12
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)08-0695-03
, 百拇医药 Influences of astragulas injection on interleukin-12content
of mice with myocarditis induced by coxsackie virus B 3
Han Qingrong，Huang Xingyuan，Jiang Zhongyan
Department of Pediatric，Yiling Hospital，Yichang443100.
【Abstract】 Objective To investigate the influences of astragulas injection
on interleukin-12(IL-12)conˉtent of mice with myocarditis induced by coxsackie virus B 3 (CVB 3 ).Methods CVB 3 induced myocarditis on Balb/C mice，and treament started on day0with astragulas injection for14days.We determined IL-12on mice on day3，7，and14.The viral titer of the heart and the pathologic examination were examined concurrently.Results Serum IL-12was siginificantly elevated in the spleen in group stragulas.The viral titer of heart was lower and mice in group stragulas had less myocarditis necrosis and cellular infiltration.Conclusion Stragulas injection is beneficial to mice with CVBS 3 induced myocardotis，it promotes early innate immune responses of the host.Stragulas injection can effiˉciently enhance IL-12content，reduce the viral titer of heart and myocarditis necrosis.
, 百拇医药
Key words stragulas injection myocarditis interleukin-12
病毒性心肌炎(VMC)的发病率近年来表现为增长趋势，其主要为柯萨奇B 3 (CVB 3 )病毒感染所致。动物实验证明，病毒性心肌炎发病包括2个阶段:感染后第一周以病毒对心肌的直接损伤为主;第二周开始以免疫反应对心肌的损伤为主，表现为更广泛的心肌坏死和间质单核细胞的浸润 [1]。IL-12是一个具有多种生物功能的细胞因子，在细胞免疫应答过程中具有重要作用，通过调节NK细胞，巨噬细胞介导的非特异性免疫和Th细胞，细胞毒性T细胞介导的特异性免疫作用。IL-12在VMC早期的非特异性免疫和随后的抗原性适应性免疫过程均扮演了极其重要的角色，它是一个多功能的免疫调节因子 [2] 。黄芪中有效成分黄芪多糖具有多方面免疫调节和免疫增强作用，增强小鼠NK细胞活性，提高机体抗病毒能力，减轻病毒对机体的炎症损伤[3] 。本实验旨在观察黄芪对CVB 3 病毒性心肌炎小鼠IL-12水平的影响，为黄芪治疗VMC提供另一理论依据。
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1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂
1.1.1 动物 近交系Balb/c雄性4～6周龄小鼠，体重12g左右。由湖北省医学实验动物中心提供。
1.1.2 病毒 柯萨奇病毒B 3 亲心肌M株(CVB 3m )，由武汉大学医学院病毒研究所提供，病毒滴度:3×10 8 PFU/ml，Hela细胞传代。
1.1.3 试剂 由晶美生物工程有限公司提供小鼠IL-12(P40)ELISA试剂盒。黄芪注射液为成都地奥九泓制药厂生产。
1.2 实验方法和步骤
1.2.1 动物分组 雄性Balb/c小鼠90只，随机分成3组，每组30只，A组(黄芪组):小鼠接种CVB 3m 病毒1h后开始连续14天经腹腔注射黄芪注射液，剂量为每只每天0.15ml，均定时给药;B组(对照组):小鼠接种CVB 3m 病毒1h后开始连续14天注射等体积生理盐水。C组(空白组):小鼠接种CVB 3m 病毒后不予任何处理。
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1.2.2 病毒性心肌炎动物模型的建立 全部Balb/c小鼠实验当天腹腔注射CVB 3m ，每只0.2ml，滴度为3×10 8 PFU/ml。
1.2.3 小鼠接种病毒后分别于第3，7，14天每次每组8只小鼠，眼球取血后分离血清，-20℃低温保存待检。取心脏中下1/3处，用10%甲醛固定待用。取其余心室组织于-70℃保存备用。
1.2.4 病毒滴度检测 病毒接种后第3天心肌标本每组各8份，采用空斑测定。
1.2.5 血清IL-12(P40)检测 病毒接种第3、7和14天，A、B、C各组每次8只小鼠取血，分离血清，-20℃低温保存待检。采用双抗体夹心ELISA法。
1.2.6 心肌组织病理学检测 病毒接种后第3、14天每组各4只取心肌标本固定于10%甲醛72h，脱水，石蜡包埋，切片，苏木素、伊红(HE)染色光镜下观察。心脏坏死的范围和细胞浸润范围用对照双盲法评分，心脏病理评分标准 [4] :0分:无心肌损害;1级(mild):1至2个小病灶，2级(sight):数个小病灶;3级(moclerate):多个大病灶或严重的大病灶心肌损害;4级(severe):多个大病灶，弥漫性浸润或坏死。
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1.3 统计学方法 实验结果均以均数±标准差表示，心肌病毒滴度、心肌病理评分、血清IL-12水平采用Kruskal-Wallis检验(即成组设计多个样本比较的秩和检验)。P<0.05认为差异有显著性。
2 结果
2.1 心脏重量/体重之比 在病毒接种后第7天作心肌组织病理学检查前称取小鼠体重(BW)和心脏重量(HW)。心脏重量/体重(HW/BW)之比，黄芪组较对照组低，差异有显著性(n=8，P<0.05)。见表1。
表1 各组小鼠心脏重量/体重之比(略)
2.2 心肌病毒滴度 病毒接种第3天作心肌病毒滴度测定，B组(生理盐水对照组)为3.77±0.281gTCID 50 /mg，C组(空白组)为3.86±0.361gTCID 50 /mg，而A组(黄芪组)为1.76±0.181gTCID 50 /mg，较B组和C组显著为低(P<0.01)，说明黄芪可抑制CVB 3m 复制(见图1)。
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图1 略
2.3 心肌病理改变 在病毒接种后第3和第14天作心肌组织病理学检查，观察心肌坏死和细胞浸润程度并评分。在A组14天时心肌坏死和细胞浸润程度评分均较B组和C组低(n=4，P<0.05)。见表2。
表2 病毒接种14天各组小鼠心肌组织病理学评分 (略)
2.4 血清IL-12水平 与B组(对照组)相比，A组(黄芪组)的血清IL-12水平在病毒接种后的第3和第7天为高(n=8，P<0.05)，血清IL-12水平峰值出现在第7天，而在第14天时，两组差异无显著性(n=8，P>0.05)。见表3。
表3 病毒接种3、7和14天各组小鼠血清IL-12水平(略)
3 讨论
近来研究表明柯萨奇B 3 (CVB 3 )感染后，其RNA可长期存在于心肌细胞内，病毒本身或(和)病毒所致心肌病理损伤可引发病毒性心肌炎后期免疫损伤，而细胞因子在免疫损伤过程中的作用近年来备受关注。
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白介素IL-12，又名细胞毒淋巴细胞成熟因子或自然杀伤细胞刺激因子，它由P40、P35两个亚基组成异源二聚体，由不相关的基因编码。编码鼠P40和P35的基因尚未精确定位，与人的这些基因分别具有60%～70%的序列同源性。IL-12能促进CD 4 T分化辅助细胞(Th1)的增殖，诱导NK细胞和T细胞产生细胞因子;提高NK细胞的细胞毒性;促进细胞毒性T(CTL)细胞的形成等。IL-12在机体病毒感染早期的非特异性免疫和随后的抗原特异性的适应性免疫过程中均扮演重要的角色，它是一个多功能的免疫调节因子。Hill SL [5] 实验表明，在CVB 3感染所致病毒性心肌炎小鼠早期感染至随后的自动免疫损伤过程，NO在早期阶段起保护作用，而使用IL-12治疗能明显减轻自动免疫性心肌的损害。而Erikssou [6] 等发现，IL-12P 40 缺陷老鼠在病毒感染的背景下，不易感染病毒性心肌炎，IL-12/INF-γ轴对自动免疫性心肌炎的发展具有双重效应。近来OKuˉra [7] 等研究指出:IL-12与IL-2通过刺激CD4+ T细胞可造成病毒性自体免疫性心肌损伤，同时通过免疫系统内在调节机制IL-12可调控Th1/Th2平衡来影响免疫性心肌炎的临床过程。
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黄芪具有多方面的免疫调节和免疫增强作用，它既能促进抗体的生成，又能增加巨噬细胞吞噬病毒能力，还能增强NK细胞的活性，从而提高机体抵抗病毒能力，减轻病毒对机体的炎症损伤 [8] 。山东医科大学董杰德等证实黄芪能降低细胞对CVB 3m 病毒的敏感性，同时通过诱导产生干扰素(IFN)，增强心肌细胞抗病毒能力。本实验结果发现，用黄芪干预的CVB 3m 病毒性心肌炎Balb/c小鼠，其黄芪组小鼠血清IL-12的水平在VMC早期和晚期比对照组(盐水组)明显增高，特别在VMC早期IL-12水平两组存在显著差异。IL-12在VMC晚期增高不明显，两组无显著差异，这可能是感染早期由于黄芪干预后，早期随着小鼠IL-12水平的上升、NK细胞活性增强，在感染早期病毒得以被宿主部分清除，病毒滴度下降，减弱了病毒相关抗原或被改变的自身抗原的持续暴露，并可避免由此诱导出的针对这些抗原的体液免疫和细胞免疫的产生，从而避免了因此而造成的心肌渐进性损害。
黄芪可明显提高CVB 3 病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型早期血清IL-12水平，从而提高小鼠对病毒感染应答反应，发挥机体清除病毒作用，调节机体免疫功能，对病毒性心肌炎的后期心肌免疫损伤起到明显保护作用。心肌切片HE病理评分和早期心肌病毒滴度的测定亦证实了黄芪对病毒性心肌炎的保护和修复作用。
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总之，黄芪可通过提高小鼠血清IL-12水平和NK细胞活性这对VMC具有较好的治疗作用和对心肌免疫性损伤的保护作用，具有良好的临床应用前景。
参考文献
1 Wolfgram LJ.Variation in the susceptibility to coxsakie-virus B 3 inˉduced myocarditis among different strains of mice.JImunol，1986，136(5):1846-1849.
2 Hilkens GM，snijders A，Snijdewint FG.Modulation of T-cell cytokine secretion by accessory cell-derived product.Eur respir J suppl，1996，22.90-94.
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3 张晓明，扬景山.白细胞介素-12和黄芪多糖对小鼠NK细胞活性增强及形态的影响.北京医科大学学报，1991，23(3):208-210
4 Chiharu K，Yoshitok，Hiraoka YJ，et al.Cytokine and murine Coxsachievirus B 3 myocarditis:Interleukin-2Suppressed myocarditis in the early Stage bat enbanced the condition in the subgueut stage.Circuˉlation，1994，2228:247-250.
5 Hill SL，Rose NR.The transition from Vral to autoimmune myocarditc.Autoimm unity，2001，34(3):169-176.
, 百拇医药 6 Eriksson U，KunerMO，sebald W.et al.Dual role of the IL-12/LFN-gamma axis in the davelopment of autoimmune myocarditis.induction by IL-12and production by IFN-gamma.J Immunol，2001，167(9):5464-5469.
7 Okura Yuji，Takrda，Kazuyoshi，et al.Recombinant murine InterleuKin-12faci litates Induction ofcardiac myosin-sepecific Type1Helper T cell in Rats.Cardiac Biology，1998，82(10):1035-1042.
8 张晓明，杨景山.白细胞介素-2和黄芪多糖对小鼠NK细胞活性和增殖及形态的影响.北京医科大学学报，1991，23(3):176-178.
作者单位:1 443100湖北省宜昌市夷陵医院儿科
2 430060武汉大学人民医院儿科
(编辑 秋实), 百拇医药