血清肽促伤口愈合及修复细胞增殖的实验研究
【摘要】 目的 研究血清肽对创伤伤口的促愈合作用，并探讨其对伤口修复细胞增殖的影响。方法 将血清肽50μl(5mg/ml)注入小鼠皮下埋置的聚乙烯醇海绵“死腔伤口”中，自致伤当日起，每日1次，连续5天给药;对照组“死腔伤口”内注入50μl牛血清白蛋白(5mg/ml)。同时分离伤口修复细胞，进行细胞培养，通过MTT法检测不同浓度的血清肽对修复细胞增殖的影响。结果 伤后7、10天治疗组海绵中总DNA、蛋白质及羟脯氨酸含量明显高于对照组，差异有显著性(P<0.05)，伤后14天两组间差异无显著性(P>0.05)。体外实验发现，与对照基质1%胎牛血清1640液相比，含0.2%血清肽组可明显促进伤口修复细胞增殖，经统计学处理差异有显著性(P<0.05)。结论 由猪血清制备的多肽，具有促伤口愈合的活性，直接促进伤口修复细胞生长是其发挥作用的机制之一。
关键词 血清肽 伤口愈合 细胞增殖
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)06-0481-03
, 百拇医药
The experimental study of enhancement effect of serum peptides on
wound healing and wound fibroblast proliferation
Cheng Yu，Zhang Yan，Zhu Xudong.
Drug Department，The Daping Hospital，3rd Millitary Medical University，Chongqing400042.
【Abstract】 Objective It was studied in this article that serum peptides could exert enhancement effect on wound healing and wound fibroblast proliferation.Methods Two pieces of polyvinyl alcohol(PVA)sponge respectiveˉly implanted in rat dorsal both sides subcutaneous of40mice were selected as the wound model.The subcutaneous pouch having one piece of sponge was taken as the experimental group and the other as the control.Injection of50μL of serum peptides into the test sponge was performed once a day from the time of injury for5consecutive times，while50μL of BSA(bovine serum albumin，5mg/ml)into the control sponge in the same way.The effect of serum peptides on proliferation of wound fibroblast cultured in vitro was also detected by MTT.Results The levels of total DNA，protein and hydroproline in serum peptides treated sponge were observed significantly higher than those in the control sponge on the7th and10th days after wounding(P<0.05).No significant difference was seen on the14th postinjury day(P>0.05).The serum petides could accelerate the proliferation of wound fibroblast.Conclusion The serum petides from pig serum had the activity to accelerate wound healing and its direct stimulation of the proliferation of wound fibroblast was probably one of the ways which serum peptides exerted its action.
, 百拇医药
Key words serum peptideswound healing cell proliferation
Solcoseryl为牛血清除去大分子蛋白质后的多肽成分，用于治疗临床难愈合伤口，在国外取得了良好效果 [1～3] ，而国内少见相关的研究报道。血清肽系从猪血清中分离获得的一种稳定的肽类物质，无抗原性、无毒副作用，通过测定血清肽对小鼠皮下“死腔伤口”肉芽组织生长过程中有关生化代谢的改变及其对体外培养伤口修复细胞增殖的量效关系，探讨血清肽促伤口愈合的机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 血清肽的多肽制剂方法 [4] 猪血清经酸、热，有机试剂沉淀及其透析处理，研制而成血清肽 [5] ，含量为5mg/ml的注射剂。
, 百拇医药
1.1.2 聚乙烯醇海绵 四川省维尼龙厂实验室研制。
1.2 实验方法
1.2.1 伤口模型及血清肽的治疗 随机取18～20g，不分性别40只小鼠，麻醉脱毛。在无菌条件下，沿脊柱中央垂直方向切一长0.5～1.0cm、深至筋膜的切口，钝性剥离伤口上下两侧的皮肤，造成皮下囊袋，放入2块消毒的聚乙烯醇海绵，直径为1.2cm，厚0.2cm。按Nimikoski等 [6] 方法给予血清肽治疗，术后当日及以后连续4天，实验组每日注入海绵中血清肽50μl(5mg/ml)，对照组海绵注入50μl牛血清白蛋白液(5mg/ml)。术后5、9、10及14天，随机取8只小鼠活杀，取出海绵待检测。
1.2.2 海绵中总蛋白质、DNA及羟脯氨酸含量测定 取3/4的海绵称重，剪成碎块，加入0.1mol/ml NaOH1ml，4℃过夜。取出浸出液混匀，取10μl和500μl，分别按考马斯亮蓝法和二联苯胺法测定蛋白质及DNA。余下1/4海绵称重，剪成碎块，用适量的10mol/ml NaOH水解30min，按氯胺-T法测定羟脯氨酸含量 [7] 。
, 百拇医药
1.2.3 血清肽对伤口修复细胞增殖的量效关系 按本研究所建立的方法培养修复细胞 [6] ，原代细胞生长融合后，经0.25%胰酶消化，用1%(5mg/ml)胎牛血清1640培养液调成浓度为1×10 4 /ml细胞悬液，点接100μl到96孔培养皿中、37℃，5%CO 2 条件孵育12h，吸去培养液。按加入的培养液不同，将培育细胞分为两大组:对照组，加入100μl，1%胎牛血清1640液(基本基质basic medium，BM)100μl;血清肽组，分别在BM中加0.2%，0.5%，1%，3%及5%，37℃，5%CO 2 条件下培育48h，加入10μl(5mg/ml)溴化四氮唑蓝(MTT)，保育4h，再加入SDS100μl，37℃放置18h后，在酶标仪上570nm波长处测定每孔溶液的吸光度，每种待测液平行测定8份样品(n=8)。
2 结果
2.1 海绵中总DNA、总蛋白质及羟脯氨酸含量 海绵中上述物质的测定结果见表1。伤后第5天，实验组海绵中总 DNA、总蛋白质量显著高于对照组，统计学处理差异有显著性(P<0.01)，但两组间羟脯氨酸含量差异无显著性(P>0.05)，伤后第7、10天，实验组各项指标均明显高于对照组，差异有显著性(P<0.05)。伤后第14天，各项指标两组间差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
2.2 血清肽对伤口修复细胞的增殖关系 含血清肽0.2%的组与对照组比较，具有明显的刺激作用，差异具有非常显著性(P<0.01)，血清肽浓度为0.5%时，刺激作用更强，两种剂量的作用效果差异有显著性(P<0.05)。但当血清肽浓度>0.5%以上，对其修复细胞生长的刺激作用不再随浓度升高而加强，见表2。
表1 伤后两组海绵中总DNA、蛋白质、羟脯氨酸的含量
注: ˇ P<0.01; # P<0.05.
表2 不同浓度的血清肽对伤口修复细胞增殖的影响
3 讨论
海绵中总DNA含量反映了肉芽组织细胞数量的多少;总蛋白质和羟脯氨酸值与细胞代谢及胶原合成能力相关。总结以前我们的实验，光镜检测结果发现:伤后早期，即第5天，治疗组伤口处有较多的细胞聚集，而两组间胶原合成能力相近似，提示血清肽中多肽类促进伤口愈合作用主要在于加速细胞迁移率，而对其细胞分化程度，在愈合早期并无显著影响。随着愈合进程的发展，治疗组各项检定指标明显优于对照组，表明血清肽具有促进伤口愈合的生物活性。从最终基质沉积角度衡量，治疗组较对照组提前3天愈合。术后14天，两组间反映肉芽生长状况及生化指标不再有显著差异，提示血清肽在促进伤口愈合的同时，不会导致过度生长发生，这可能是机体的自身调控和药品有双向效应或是二者的共同作用，但具体机制不清楚。
, 百拇医药
近年来的研究已确认，牛血清低分子多肽具有多种生长因子样活性，可直接刺激伤口修复细胞的迁移，增生:刺激单核细胞的生长和分化;刺激内皮细胞生长，有利于新血管生长;改善伤口局部微循环和营养物质供应 [8～12] 。至今未见Solcoseryl直接促进细胞基质合成的研究报道。一般认为，肉芽组织胶原合成能力增强与修复细胞增多和巨噬细胞分泌功能改善相关。除直接刺激伤口修复细胞增殖外，血清肽(小分子多肽)在伤口愈合中的作用及其机制是否与Solcoseryl类同，尚待进一步研究。
参考文献
1 Terve NI，Krasnykn AM.Therapeutic endoscopy in the complex treatˉ ment of patients with chronic gastroduodenal ulcer.Vestn Khir，1989，142(3):28.
, 百拇医药
2 Mosicnko VS，Kuzmcnko AP，Toodor IN.The combined use of cryosurgery and solcoseryl in treating malignant neoplasmai.Ekap Onkol，1989，11(2):69.
3 Isler H，Bauen A，Baschong W.Tropical treatment of standardized bruns witha protein-free hemodiatysate.Bruns，1991，17(2):96.
4 陈荣德，任忠文.无蛋白血清(血清肽)的研制及其动物实验.中国药学通报，1983，18(1):17.
5 陈荣德，侯金泉.无蛋白血清(血清肽)的成份探讨.中国药学杂志，1992，27(12):79.
, 百拇医药
6 Niinikoski J，Renvall S，Laato M.Effect of the haemodialysate on exˉperiment granulation tissue.Surg Res，1986，10:58.
7 Bucley A，Jeffrey M.Sustained release of epidermal growth factor acˉcelerates wound repair.Proc Natl Acad Sci USA，1985，142(3):28.
8 朱旭东，张艳.伤口修复细胞的简易培养方法.中国修复重建外科杂志，1993，7(3):157.
9 Konturek SJ，Brzozowski T，Denbinskl A.Comparison of solcoseryl and epidermal growth factor in healing of chronic gastroduodenat ulceration and mucosal growth in rats.Hapatogastroenterology，1988，35(1):25.
, 百拇医药
10 Milenburger HG，Baschong W，Horner V.Cooperative effects in vitro on fibroblast and keratinocyte functiohs related to wound healing by transforming growth factor beta and a low molecular weight fraction from hemodialyzed blood.Arzneimittelforschung，1994，44(7):872.
11 SchreierT，Denge E，Baschong W.Fibrobtast migration and proliferaˉtion during in vitro wound heating.a quantitative comparison between various growth factors and a low molecular weight blood diatysate used in the clinic imparied wound healing.Res Exp Med Berl，1993，193(4):195.
12 Spessotto P，Dripz Baschong W.Effect of protein-free dialysate from calf blood on human monocyte differentiation in vitro.Arzneimitˉtelforschung，1993，43(7):747.
作者单位:400042重庆第三军医大学大坪医院野战外科研究所药剂科
(编辑依 依), http://www.100md.com
关键词 血清肽 伤口愈合 细胞增殖
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)06-0481-03
, 百拇医药
The experimental study of enhancement effect of serum peptides on
wound healing and wound fibroblast proliferation
Cheng Yu，Zhang Yan，Zhu Xudong.
Drug Department，The Daping Hospital，3rd Millitary Medical University，Chongqing400042.
【Abstract】 Objective It was studied in this article that serum peptides could exert enhancement effect on wound healing and wound fibroblast proliferation.Methods Two pieces of polyvinyl alcohol(PVA)sponge respectiveˉly implanted in rat dorsal both sides subcutaneous of40mice were selected as the wound model.The subcutaneous pouch having one piece of sponge was taken as the experimental group and the other as the control.Injection of50μL of serum peptides into the test sponge was performed once a day from the time of injury for5consecutive times，while50μL of BSA(bovine serum albumin，5mg/ml)into the control sponge in the same way.The effect of serum peptides on proliferation of wound fibroblast cultured in vitro was also detected by MTT.Results The levels of total DNA，protein and hydroproline in serum peptides treated sponge were observed significantly higher than those in the control sponge on the7th and10th days after wounding(P<0.05).No significant difference was seen on the14th postinjury day(P>0.05).The serum petides could accelerate the proliferation of wound fibroblast.Conclusion The serum petides from pig serum had the activity to accelerate wound healing and its direct stimulation of the proliferation of wound fibroblast was probably one of the ways which serum peptides exerted its action.
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Key words serum peptideswound healing cell proliferation
Solcoseryl为牛血清除去大分子蛋白质后的多肽成分，用于治疗临床难愈合伤口，在国外取得了良好效果 [1～3] ，而国内少见相关的研究报道。血清肽系从猪血清中分离获得的一种稳定的肽类物质，无抗原性、无毒副作用，通过测定血清肽对小鼠皮下“死腔伤口”肉芽组织生长过程中有关生化代谢的改变及其对体外培养伤口修复细胞增殖的量效关系，探讨血清肽促伤口愈合的机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 血清肽的多肽制剂方法 [4] 猪血清经酸、热，有机试剂沉淀及其透析处理，研制而成血清肽 [5] ，含量为5mg/ml的注射剂。
, 百拇医药
1.1.2 聚乙烯醇海绵 四川省维尼龙厂实验室研制。
1.2 实验方法
1.2.1 伤口模型及血清肽的治疗 随机取18～20g，不分性别40只小鼠，麻醉脱毛。在无菌条件下，沿脊柱中央垂直方向切一长0.5～1.0cm、深至筋膜的切口，钝性剥离伤口上下两侧的皮肤，造成皮下囊袋，放入2块消毒的聚乙烯醇海绵，直径为1.2cm，厚0.2cm。按Nimikoski等 [6] 方法给予血清肽治疗，术后当日及以后连续4天，实验组每日注入海绵中血清肽50μl(5mg/ml)，对照组海绵注入50μl牛血清白蛋白液(5mg/ml)。术后5、9、10及14天，随机取8只小鼠活杀，取出海绵待检测。
1.2.2 海绵中总蛋白质、DNA及羟脯氨酸含量测定 取3/4的海绵称重，剪成碎块，加入0.1mol/ml NaOH1ml，4℃过夜。取出浸出液混匀，取10μl和500μl，分别按考马斯亮蓝法和二联苯胺法测定蛋白质及DNA。余下1/4海绵称重，剪成碎块，用适量的10mol/ml NaOH水解30min，按氯胺-T法测定羟脯氨酸含量 [7] 。
, 百拇医药
1.2.3 血清肽对伤口修复细胞增殖的量效关系 按本研究所建立的方法培养修复细胞 [6] ，原代细胞生长融合后，经0.25%胰酶消化，用1%(5mg/ml)胎牛血清1640培养液调成浓度为1×10 4 /ml细胞悬液，点接100μl到96孔培养皿中、37℃，5%CO 2 条件孵育12h，吸去培养液。按加入的培养液不同，将培育细胞分为两大组:对照组，加入100μl，1%胎牛血清1640液(基本基质basic medium，BM)100μl;血清肽组，分别在BM中加0.2%，0.5%，1%，3%及5%，37℃，5%CO 2 条件下培育48h，加入10μl(5mg/ml)溴化四氮唑蓝(MTT)，保育4h，再加入SDS100μl，37℃放置18h后，在酶标仪上570nm波长处测定每孔溶液的吸光度，每种待测液平行测定8份样品(n=8)。
2 结果
2.1 海绵中总DNA、总蛋白质及羟脯氨酸含量 海绵中上述物质的测定结果见表1。伤后第5天，实验组海绵中总 DNA、总蛋白质量显著高于对照组，统计学处理差异有显著性(P<0.01)，但两组间羟脯氨酸含量差异无显著性(P>0.05)，伤后第7、10天，实验组各项指标均明显高于对照组，差异有显著性(P<0.05)。伤后第14天，各项指标两组间差异无显著性(P>0.05)。
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2.2 血清肽对伤口修复细胞的增殖关系 含血清肽0.2%的组与对照组比较，具有明显的刺激作用，差异具有非常显著性(P<0.01)，血清肽浓度为0.5%时，刺激作用更强，两种剂量的作用效果差异有显著性(P<0.05)。但当血清肽浓度>0.5%以上，对其修复细胞生长的刺激作用不再随浓度升高而加强，见表2。
表1 伤后两组海绵中总DNA、蛋白质、羟脯氨酸的含量
注: ˇ P<0.01; # P<0.05.
表2 不同浓度的血清肽对伤口修复细胞增殖的影响
3 讨论
海绵中总DNA含量反映了肉芽组织细胞数量的多少;总蛋白质和羟脯氨酸值与细胞代谢及胶原合成能力相关。总结以前我们的实验，光镜检测结果发现:伤后早期，即第5天，治疗组伤口处有较多的细胞聚集，而两组间胶原合成能力相近似，提示血清肽中多肽类促进伤口愈合作用主要在于加速细胞迁移率，而对其细胞分化程度，在愈合早期并无显著影响。随着愈合进程的发展，治疗组各项检定指标明显优于对照组，表明血清肽具有促进伤口愈合的生物活性。从最终基质沉积角度衡量，治疗组较对照组提前3天愈合。术后14天，两组间反映肉芽生长状况及生化指标不再有显著差异，提示血清肽在促进伤口愈合的同时，不会导致过度生长发生，这可能是机体的自身调控和药品有双向效应或是二者的共同作用，但具体机制不清楚。
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近年来的研究已确认，牛血清低分子多肽具有多种生长因子样活性，可直接刺激伤口修复细胞的迁移，增生:刺激单核细胞的生长和分化;刺激内皮细胞生长，有利于新血管生长;改善伤口局部微循环和营养物质供应 [8～12] 。至今未见Solcoseryl直接促进细胞基质合成的研究报道。一般认为，肉芽组织胶原合成能力增强与修复细胞增多和巨噬细胞分泌功能改善相关。除直接刺激伤口修复细胞增殖外，血清肽(小分子多肽)在伤口愈合中的作用及其机制是否与Solcoseryl类同，尚待进一步研究。
参考文献
1 Terve NI，Krasnykn AM.Therapeutic endoscopy in the complex treatˉ ment of patients with chronic gastroduodenal ulcer.Vestn Khir，1989，142(3):28.
, 百拇医药
2 Mosicnko VS，Kuzmcnko AP，Toodor IN.The combined use of cryosurgery and solcoseryl in treating malignant neoplasmai.Ekap Onkol，1989，11(2):69.
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5 陈荣德，侯金泉.无蛋白血清(血清肽)的成份探讨.中国药学杂志，1992，27(12):79.
, 百拇医药
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8 朱旭东，张艳.伤口修复细胞的简易培养方法.中国修复重建外科杂志，1993，7(3):157.
9 Konturek SJ，Brzozowski T，Denbinskl A.Comparison of solcoseryl and epidermal growth factor in healing of chronic gastroduodenat ulceration and mucosal growth in rats.Hapatogastroenterology，1988，35(1):25.
, 百拇医药
10 Milenburger HG，Baschong W，Horner V.Cooperative effects in vitro on fibroblast and keratinocyte functiohs related to wound healing by transforming growth factor beta and a low molecular weight fraction from hemodialyzed blood.Arzneimittelforschung，1994，44(7):872.
11 SchreierT，Denge E，Baschong W.Fibrobtast migration and proliferaˉtion during in vitro wound heating.a quantitative comparison between various growth factors and a low molecular weight blood diatysate used in the clinic imparied wound healing.Res Exp Med Berl，1993，193(4):195.
12 Spessotto P，Dripz Baschong W.Effect of protein-free dialysate from calf blood on human monocyte differentiation in vitro.Arzneimitˉtelforschung，1993，43(7):747.
作者单位:400042重庆第三军医大学大坪医院野战外科研究所药剂科
(编辑依 依), http://www.100md.com