改进技术的大鼠异位节段性小肠移植模型
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)08-0710-02
自1971年Monchik GJ [1] 成功地建立大鼠小肠移植模型以来，大鼠成为小肠移植实验研究中最常用的动物模型。该模型不断被改进，由于大鼠腹腔空间有限且为了减少排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD)的发生，提高大鼠存活率，Kaplan S [2] 建立了大鼠异位节段性小肠移植模型。我们使用cuff套管技术 [3] ，自2001年起建立改良大鼠异位节段性小肠移植模型共180例，用于移植肠急性排斥反应及缺血再灌注损伤方面的研究。由于小肠移植是一项难度较大的实验外科技术，影响模型建立成功的因素很多，现将我们建立模型进行的一些技术改进讨论如下。
1 材料与方法
1.1 材料 封闭群SD、Wistar/A雄性大鼠，体重280～320g，由第四军医大学实验动物中心提供，根据实验设计选择品系，供受体按体重相近的原则随机配对。手术器械采用上海医疗器械厂生产的显微外科器械，缝线为宁波医用缝针厂的6-0、9-0双针缝线，实验药品由西京医院药剂科提供。
, http://www.100md.com
1.2 方法 大鼠异位节段性小肠移植模型的建立:供受体术前12h置于代谢笼中禁食，饲以5%糖盐水。麻醉采用5%氯胺酮按80mg/kg腹腔注射，术前阿托品0.15mg/kg，肌肉注射，实验期间照明与黑暗12h交替。(1)供肠切取与灌洗:供体取腹部正中切口，进腹后先行全结肠及末端回肠切除;于屈氏韧带下方2cm处结扎横断空肠，沿肠系膜上血管游离近段空肠，分离出脾静脉、胃幽门静脉，游离门静脉至肝门处;游离并结扎腹主动脉远端，结扎并切断右肾动脉、左肾动脉及腰动脉分支，游离出左肾动脉至腹腔干起始部的一段腹主动脉，游离肠系膜上动脉至根部，剪断肠系膜上动、静脉之间的组织，充分游离出移植物血管蒂。6-0丝线结扎门静脉的幽门静脉和脾静脉分支;经肾下腹主动脉行小肠原位灌洗，灌洗液为含肝素100U/ml的4℃乳酸林格氏液，压力为35cmH 2 O，同时腹腔内充满冰盐水降温;灌洗过程中，于肝门部剪断门静脉，引入外径2.0mm、内径1.5mm、长2mm聚乙烯套管，翻转静脉壁包绕套管并固定;灌洗至小肠壁及系膜苍白，门静脉断端流出液清亮时，迅速取下小肠移植物;结扎供肠腹主动脉段远端，近端修理平整后放于4℃肝素乳酸林格氏液内低温保存。(2)受体手术:先行颈静脉置管，1:100肝素盐水封管。取腹部正中切口，显露左肾并结扎左输尿管，游离左肾动、静脉，于左肾动脉根部结扎剪断，肾门处结扎剪断左肾静脉，移除肾脏;游离肾下腹主动脉1.5cm左右，无损伤血管夹阻断腹主动脉上下两端，在其前壁剪一长径约2.0mm纵行椭圆形孔;移植肠放入腹腔，以冰盐水纱布保护，用9-0无损伤缝合线行带蒂肠系膜上动脉的腹主动脉段与受体的腹主动脉端侧吻合;无损伤血管夹阻断左肾静脉根部，近肾端剪开，将移植肠门静脉套管插入左肾静脉，顶端不超过左肾上腺静脉汇入平面，结扎固定;开放血流，腹腔内倒入37℃温盐水复温、观察，若有渗血则间断缝合修补;将移植肠置于左侧腹腔，近端关闭、末端于左下腹造瘘。受体于开腹前、血管吻合后及关腹后各补含头孢唑啉钠4g/L的平衡盐液2～3ml，共6～8ml，术后前3天予以氨苄青霉素200mg/kg，肌注，1次/d，受体存活超过3天列为手术成功。
, 百拇医药
2 结果
自2001年起共建立180例大鼠小肠异位节段性小肠移植模型，其中预实验88次，正式实验92次，手术成功率为80.6%。手术总时间为(150±10)min，供体手术(50±5)min，受体手术(90±10)min，其中动脉吻合时间(20±3)min，静脉吻合时间1min，手术总时间约2.5h。供肠热缺血时间为1min，冷缺血时间控制在60min以内，在不用任何抗排异反应药物的情况下，受体平均存活时间为12.8天。
3 讨论
3.1 麻醉 麻醉药物及剂量选择要合适，起初我们选用2%戊巴比妥腹腔注射麻醉，但该药起效较慢且药物剂量不好掌握，个体化差异较大，剂量过大容易抑制呼吸造成大鼠死亡，过小则大鼠躁动不安，影响手术操作。后来我们选用5%氯胺酮按80mg/kg腹腔注射，该药起效快，剂量容易掌握，但药物持续时间较短，需严格根据手术时间选用，必要时可追加最初剂量的1/3。腹腔注射时注射部位通常选左下腹部，注药前需回抽防止麻药误入血管造成大鼠死亡。
, http://www.100md.com
3.2 供体手术 供肠切取过程中要尽量避免对肠管的挤压、钳夹，用盐水棉球覆盖肠管，保持湿润。进腹后先分离、切除全结肠及部分回肠，使手术野显露良好。沿肠系膜上血管游离近段空肠时，先分离出脾静脉、胃幽门静脉暂下结扎，以防止内脏淤血造成休克。游离门静脉时尽量剥除周围的胰腺组织，防止移植术后发生胰腺液化造成腹腔感染。结扎肾下腹主动脉远端，增加供肠的血供。分离腹主动脉时要仔细结扎细小的腰动脉分支，减少术中出血。门静脉分支选用6-0丝线结扎，防止静脉腔狭窄。肠管原位灌注时压力应当≤35cmH 2 O，压力过大容易造成小肠粘膜灌注损伤，一般灌注5～6ml即可。静脉套管时应防止静脉扭转，保持管腔通畅。移植肠取下后腹主动脉近端要修剪平整并仔细检查有无遗漏的细小分支，如有需仔细结扎防止动脉吻合后渗血。Zhong R [4] 提出供体术中也需补充晶体液维持血压稳定，我们的体会是只要小心操作避免出血不用补液也可获取高质量的供肠。
3.3 受体手术 大鼠的血容量仅为其体重的7.4%，资料证实术中出血2～3ml即可造成大鼠休克、死亡 [5] ，而且移植后血液大量流入移植肠血管床，受体很容易发生低血容量性休克，因而补液就显得尤为重要。关于静脉通路我们曾选择过阴茎背静脉及尾静脉，但通道不能保持确切有效及稳定，效果均不理想。后选用颈静脉置管，熟练后仅需5～8min，补液效果可靠并可长期留管，方便药物的给予。受体手术最关键的步骤是血管吻合，我们的体会是游离肾下腹主动脉时要注意此段腹主动脉后方有一小分支，一定要结扎，防止动脉剪口后渗血，影响术野清晰。腹主动脉前壁剪口要居中，大小合适，使略大于供体的腹主动脉，吻合时先缝吻合口上、下两端，然后再行两侧的连续外翻缝合，注意血管内膜对内膜，每针均要收紧，针距要均匀，一般每侧只需缝合8～10针即可，操作熟练后在不借助显微镜的情况下动脉吻合成功率在90%以上且吻合时间仅为20min左右。注意用肝素盐水冲洗吻合口，防止发生血栓。动脉吻合时间需控制在30min以内，过久则可造成大鼠下肢缺血瘫痪，受体不能长期存活。Cuff套管技术与传统手工吻合相比可简化手术操作，明显缩短缺血时间，提高移植成功率 [6] ，套入时应摆好位置，防止扭转造成静脉回流不畅。开放血流的顺序为先松静脉血管夹，再松腹主动脉远端，最后松近端血管夹。如有少量渗血可用棉球轻轻压迫，一般1～2min即可止住。关腹前可用37℃温盐水及甲硝唑液冲洗腹腔，既可复温又可预防腹腔感染。
, 百拇医药
3.4 术后管理 手术后禁食24h;术后前3天，氨苄青霉素200mg/kg，肌注，1次/d，预防感染。可从造瘘口用生理盐水冲洗肠腔，利于移植肠分泌物的排出。不需采取特殊的保 温措施，如天气较冷，可用日光灯泡照射保温。
参考文献
1 Monchik GJ，Russell PS.Transplantation of small bowel in the rat:techˉnical and immunological considerations.Surgery，1971，70(5):693-702.
2 Kaplan S，Racelis D，Martinelli GP，et al.Orthotopic，segmental small-bowel transplantation in the rat.Mt Sinai J Med，1986，53(2):94-98.
, 百拇医药
3 Wallander J，Holtz A，Larsson E，et al.Small-bowel transplantation in the rat with a nonsuture cuff technique.Technical and immunological considerations.Transpl Int，1988，1(3):135.
4 Zhong R，Grant D，Sutherland F，Wang PZ，Chen HF，Lo S，Stiller C，Duff J.Refined technique for intestinal transplantation in the rat.Microˉsurgery，1991，12(4):268-274.
5 伍晓汀，黎介寿.改进技术的大鼠异体全小肠移植术.医学研究生学报，1998，(01):51-54.
6 Nakao A，Mitsukoa N，Shen SD，et al.Rat small intestinal transplantaˉtion:a comparsion of the cuff and hand-suture methods.Acta Med Okayama，2000，54(6):259-264.
作者单位:1 250031山东济南解放军第456医院普外科
2 西安第四军医大学西京医院胃肠外科
(编辑 海涛), 百拇医药
自1971年Monchik GJ [1] 成功地建立大鼠小肠移植模型以来，大鼠成为小肠移植实验研究中最常用的动物模型。该模型不断被改进，由于大鼠腹腔空间有限且为了减少排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD)的发生，提高大鼠存活率，Kaplan S [2] 建立了大鼠异位节段性小肠移植模型。我们使用cuff套管技术 [3] ，自2001年起建立改良大鼠异位节段性小肠移植模型共180例，用于移植肠急性排斥反应及缺血再灌注损伤方面的研究。由于小肠移植是一项难度较大的实验外科技术，影响模型建立成功的因素很多，现将我们建立模型进行的一些技术改进讨论如下。
1 材料与方法
1.1 材料 封闭群SD、Wistar/A雄性大鼠，体重280～320g，由第四军医大学实验动物中心提供，根据实验设计选择品系，供受体按体重相近的原则随机配对。手术器械采用上海医疗器械厂生产的显微外科器械，缝线为宁波医用缝针厂的6-0、9-0双针缝线，实验药品由西京医院药剂科提供。
, http://www.100md.com
1.2 方法 大鼠异位节段性小肠移植模型的建立:供受体术前12h置于代谢笼中禁食，饲以5%糖盐水。麻醉采用5%氯胺酮按80mg/kg腹腔注射，术前阿托品0.15mg/kg，肌肉注射，实验期间照明与黑暗12h交替。(1)供肠切取与灌洗:供体取腹部正中切口，进腹后先行全结肠及末端回肠切除;于屈氏韧带下方2cm处结扎横断空肠，沿肠系膜上血管游离近段空肠，分离出脾静脉、胃幽门静脉，游离门静脉至肝门处;游离并结扎腹主动脉远端，结扎并切断右肾动脉、左肾动脉及腰动脉分支，游离出左肾动脉至腹腔干起始部的一段腹主动脉，游离肠系膜上动脉至根部，剪断肠系膜上动、静脉之间的组织，充分游离出移植物血管蒂。6-0丝线结扎门静脉的幽门静脉和脾静脉分支;经肾下腹主动脉行小肠原位灌洗，灌洗液为含肝素100U/ml的4℃乳酸林格氏液，压力为35cmH 2 O，同时腹腔内充满冰盐水降温;灌洗过程中，于肝门部剪断门静脉，引入外径2.0mm、内径1.5mm、长2mm聚乙烯套管，翻转静脉壁包绕套管并固定;灌洗至小肠壁及系膜苍白，门静脉断端流出液清亮时，迅速取下小肠移植物;结扎供肠腹主动脉段远端，近端修理平整后放于4℃肝素乳酸林格氏液内低温保存。(2)受体手术:先行颈静脉置管，1:100肝素盐水封管。取腹部正中切口，显露左肾并结扎左输尿管，游离左肾动、静脉，于左肾动脉根部结扎剪断，肾门处结扎剪断左肾静脉，移除肾脏;游离肾下腹主动脉1.5cm左右，无损伤血管夹阻断腹主动脉上下两端，在其前壁剪一长径约2.0mm纵行椭圆形孔;移植肠放入腹腔，以冰盐水纱布保护，用9-0无损伤缝合线行带蒂肠系膜上动脉的腹主动脉段与受体的腹主动脉端侧吻合;无损伤血管夹阻断左肾静脉根部，近肾端剪开，将移植肠门静脉套管插入左肾静脉，顶端不超过左肾上腺静脉汇入平面，结扎固定;开放血流，腹腔内倒入37℃温盐水复温、观察，若有渗血则间断缝合修补;将移植肠置于左侧腹腔，近端关闭、末端于左下腹造瘘。受体于开腹前、血管吻合后及关腹后各补含头孢唑啉钠4g/L的平衡盐液2～3ml，共6～8ml，术后前3天予以氨苄青霉素200mg/kg，肌注，1次/d，受体存活超过3天列为手术成功。
, 百拇医药
2 结果
自2001年起共建立180例大鼠小肠异位节段性小肠移植模型，其中预实验88次，正式实验92次，手术成功率为80.6%。手术总时间为(150±10)min，供体手术(50±5)min，受体手术(90±10)min，其中动脉吻合时间(20±3)min，静脉吻合时间1min，手术总时间约2.5h。供肠热缺血时间为1min，冷缺血时间控制在60min以内，在不用任何抗排异反应药物的情况下，受体平均存活时间为12.8天。
3 讨论
3.1 麻醉 麻醉药物及剂量选择要合适，起初我们选用2%戊巴比妥腹腔注射麻醉，但该药起效较慢且药物剂量不好掌握，个体化差异较大，剂量过大容易抑制呼吸造成大鼠死亡，过小则大鼠躁动不安，影响手术操作。后来我们选用5%氯胺酮按80mg/kg腹腔注射，该药起效快，剂量容易掌握，但药物持续时间较短，需严格根据手术时间选用，必要时可追加最初剂量的1/3。腹腔注射时注射部位通常选左下腹部，注药前需回抽防止麻药误入血管造成大鼠死亡。
, http://www.100md.com
3.2 供体手术 供肠切取过程中要尽量避免对肠管的挤压、钳夹，用盐水棉球覆盖肠管，保持湿润。进腹后先分离、切除全结肠及部分回肠，使手术野显露良好。沿肠系膜上血管游离近段空肠时，先分离出脾静脉、胃幽门静脉暂下结扎，以防止内脏淤血造成休克。游离门静脉时尽量剥除周围的胰腺组织，防止移植术后发生胰腺液化造成腹腔感染。结扎肾下腹主动脉远端，增加供肠的血供。分离腹主动脉时要仔细结扎细小的腰动脉分支，减少术中出血。门静脉分支选用6-0丝线结扎，防止静脉腔狭窄。肠管原位灌注时压力应当≤35cmH 2 O，压力过大容易造成小肠粘膜灌注损伤，一般灌注5～6ml即可。静脉套管时应防止静脉扭转，保持管腔通畅。移植肠取下后腹主动脉近端要修剪平整并仔细检查有无遗漏的细小分支，如有需仔细结扎防止动脉吻合后渗血。Zhong R [4] 提出供体术中也需补充晶体液维持血压稳定，我们的体会是只要小心操作避免出血不用补液也可获取高质量的供肠。
3.3 受体手术 大鼠的血容量仅为其体重的7.4%，资料证实术中出血2～3ml即可造成大鼠休克、死亡 [5] ，而且移植后血液大量流入移植肠血管床，受体很容易发生低血容量性休克，因而补液就显得尤为重要。关于静脉通路我们曾选择过阴茎背静脉及尾静脉，但通道不能保持确切有效及稳定，效果均不理想。后选用颈静脉置管，熟练后仅需5～8min，补液效果可靠并可长期留管，方便药物的给予。受体手术最关键的步骤是血管吻合，我们的体会是游离肾下腹主动脉时要注意此段腹主动脉后方有一小分支，一定要结扎，防止动脉剪口后渗血，影响术野清晰。腹主动脉前壁剪口要居中，大小合适，使略大于供体的腹主动脉，吻合时先缝吻合口上、下两端，然后再行两侧的连续外翻缝合，注意血管内膜对内膜，每针均要收紧，针距要均匀，一般每侧只需缝合8～10针即可，操作熟练后在不借助显微镜的情况下动脉吻合成功率在90%以上且吻合时间仅为20min左右。注意用肝素盐水冲洗吻合口，防止发生血栓。动脉吻合时间需控制在30min以内，过久则可造成大鼠下肢缺血瘫痪，受体不能长期存活。Cuff套管技术与传统手工吻合相比可简化手术操作，明显缩短缺血时间，提高移植成功率 [6] ，套入时应摆好位置，防止扭转造成静脉回流不畅。开放血流的顺序为先松静脉血管夹，再松腹主动脉远端，最后松近端血管夹。如有少量渗血可用棉球轻轻压迫，一般1～2min即可止住。关腹前可用37℃温盐水及甲硝唑液冲洗腹腔，既可复温又可预防腹腔感染。
, 百拇医药
3.4 术后管理 手术后禁食24h;术后前3天，氨苄青霉素200mg/kg，肌注，1次/d，预防感染。可从造瘘口用生理盐水冲洗肠腔，利于移植肠分泌物的排出。不需采取特殊的保 温措施，如天气较冷，可用日光灯泡照射保温。
参考文献
1 Monchik GJ，Russell PS.Transplantation of small bowel in the rat:techˉnical and immunological considerations.Surgery，1971，70(5):693-702.
2 Kaplan S，Racelis D，Martinelli GP，et al.Orthotopic，segmental small-bowel transplantation in the rat.Mt Sinai J Med，1986，53(2):94-98.
, 百拇医药
3 Wallander J，Holtz A，Larsson E，et al.Small-bowel transplantation in the rat with a nonsuture cuff technique.Technical and immunological considerations.Transpl Int，1988，1(3):135.
4 Zhong R，Grant D，Sutherland F，Wang PZ，Chen HF，Lo S，Stiller C，Duff J.Refined technique for intestinal transplantation in the rat.Microˉsurgery，1991，12(4):268-274.
5 伍晓汀，黎介寿.改进技术的大鼠异体全小肠移植术.医学研究生学报，1998，(01):51-54.
6 Nakao A，Mitsukoa N，Shen SD，et al.Rat small intestinal transplantaˉtion:a comparsion of the cuff and hand-suture methods.Acta Med Okayama，2000，54(6):259-264.
作者单位:1 250031山东济南解放军第456医院普外科
2 西安第四军医大学西京医院胃肠外科
(编辑 海涛), 百拇医药