ELISA检测抗A族链球菌C多糖抗体及意义
【摘要】 目的 建立测定人体血清抗链球菌C多糖(ACHO，ASP)抗体的酶联免疫(ELISA)方法，探讨其临床价值。方法 以胰蛋白酶消化后的整个链球菌细胞作包被抗原，建立测定血清抗-ACHO抗体的ELISA方法;用该法测定58例风湿热和复发风湿活动患者，56例风心病静止期和48例对照组病人血清抗-ACHO抗体，其中58例风心活动患者同时用Barˉrett法测定;以Barrett法作标准，对该法进行初步评价。结果 (1)该法的敏感性为93.5%、特异性为86.7%、准确性为93.1%、阳性预测值为95.3%、阴性预测值为86.7%、批内差异6.7%、批间差异12.8%。(2)风湿活动期组病人血清抗-AˉCHO水平P/N值(2.58±1.26)和阳性率(74.1%)明显高于风心病静止期组和对照组病人(P<0.01)。结论 该法检测血清抗-ACHO抗体具有较高的敏感性和特异性，方法简便，抗原易获得，容易在临床和科研中推广应用。
关键词 链球菌 酿脓 C多糖 酶联免疫吸附测定 风湿热
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【文献标识码】 A 【文章编号】1609-6614(2004)06-0511-03
Detection of antibody group A streptococcal C carbohydrate by
ELISA and its clinical significance
Chen Jianguang，Dong Taiming，Su Jian，et al.
Rheumatic Fever Laboratory，Guangdong Provincial Cardiovascular Disease Institute，Guangzhou510100.
【Abstract】 Objective To establish an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)method for group A streptococcus cell wall carbohydrate(ACHO)antibody in human sera and to evaluate its clinical significance.Methˉods Group A streptococcal whole cell with trypsin-treated were used as coating antigen to develop and ELISA for the detection of anti-ACHO antibody in human sera.Anti-ACHO antibodies of58patients with active rheumatic heart disease，56patients with inactive rheumatic heart disease and48non-rheumatic heart disease patients were deˉtectedby this method.The58patients with active rheumatic heart disease were also underwent Barrett’s test that with purified ACHO as antigen.Barrett’s was regardedas a gold standard，and this method was evaluated.Results (1)The sensitivity and specificity of our method were93.5%and86.7%respective;the accuracy was92.3%;the posiˉtive and negative predictive values were94.3%and89.6%respectively;the intra-assay coefficient of variation(CV)was6.7%;and the inter-assay CV was12.8%.(2)Levels P value(2.58±1.26)and positive rates(74.1%)of serum anti-ACHO antibody in patients with active rheumatic heart disease group are much higher than those of inactive rheumatic disease group and non-rheumatic heart disease patients(P<0.01).Conclusion The ELISA method that we have established for anti-ACHO antibody can be used in clinical and experimental study on the group A streptococcal infection，because the method is simple，sensitive and specific and the antigen can be prepared easily.
, 百拇医药
Key words streptococcus pyogenesis C carbohydrate enzyme-linked immunosorbent assay rheumatic fever
风湿热(RF)活动在临床诊断上仍是一个难题。有研究表明，测定血清抗-ACHO抗体对诊断风湿热活动有很高的临床价值 [1，2] 。但由于测定抗-ACHO抗体的方法目前尚在试验阶段 [2] ，而且方法繁杂，试剂昂贵，难以在临床推广。我们建立了一种简易、经济、特异性高的ELISA方法测定抗-ACHO抗体，以期有助于RF的诊断和抗-ACHO抗体的进一步研究。
1 材料与方法
1.1 研究对象 共162例，均为1998～2002年本院住院病人。其中风心活动期病人58例，年龄8～67岁(平均21±12岁)，符合最新修订的风湿热诊断Jone氏标准 [3] ;风心病静止期病人56例，年龄8～51岁(平均34±11岁)，经心脏听诊、心脏B超、X线胸片、心电图等确诊，实验室检查无风湿活动证据;对照组病人48例，年龄2～60岁(平均23±19岁)，均为排除风湿性心脏病的其他心脏病病人。所有病人清晨空腹静脉取血3ml，新鲜分离血清置-20℃，备用。
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1.2 主要试剂 A族链球菌(GAS)标准菌标(32132A)，美国明尼苏达大学世界卫生组织链球菌协作和参考研究中心提供;碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体(二抗)，SIGMA公司产，效价1:5000;对硝基苯磷酸酯(底物)，SIGMA公司产;聚乙烯醇，广州医药公司进口分装;牛血清蛋白，北京双旋微生物培养基制品厂。
1.3 实验方法
1.3.1 抗原的制备 从血平板上选择纯的GAS(标准菌株)于托氏肉汤中扩大培养(37℃，18h)，然后将培养液置56℃水浴30min灭活细菌，1500r离心15min，收集沉淀物，用消毒过的PBS(pH7.4)洗涤5次，收集沉淀物置4℃备用。
1.3.2 ELISA方法的建立 (1)包被:以50mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9)将上述抗原稀释成3×10 8 /ml(细菌数)，包被96孔聚乙烯板(50μl/孔)，37℃温箱烘干，用0.05%的Tween-20PBS洗涤3次。(2)封闭:每孔加入含1%聚乙烯醇PBS(pH7.4)200μl，37℃1h，洗涤3次。(3)加样:每孔加入待测血清50μl(1:4000稀释)，每板设一正常对照、阳性对照及空白(PBS)，37℃1h，洗涤3次。(4)加入酶标二抗每孔100μl，37℃1h，洗涤3次。(5)显色:每孔加入底物100μl，37℃1h。(6)比色:以空白调零，405nm波长测定光密度(O.D)。(7)结果判断:P/N=测定标本O.D均值/阴性血清O.D均值，以P/N≥2.1为阳性。
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1.3.3 方法学质控 同一标本同次重复20孔，计算批内差异;同一标本不同批次连续检测20次，计算批间差异。
1.3.4 Barrett法(以纯化的ACHO作抗原) 按文献资料报告进行 [4] 。
1.4 统计方法 以Barrett法作标准，按照诊断实验评价方法采用四格表分析，计算敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值。两法比较用配对计算资料X 2 检验和直线相关分析。均值的比较用U检验，率的比较用X 2 检验。
2 结果
2.1 实验条件 包被抗原的浓度、血清稀释度、反应温度、 反应时间等均由棋盘试验确定。
2.2 本法与Barrett法结果比较 见表1，两法检测结果差异无显著性。(X 2 =0.25，P>0.05)，且存在正相关(r=0.95，P<0.01)。本法检测抗-ACHO抗体的敏感性为95.3%、特异性为86.7%、准确性为93.1%、阳性预测值为95.3%、阴性预测值为86.7%。
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表1 本法检测与Barrett方法检测结果的比较
注:两法比较，r=0.95，P<0.01，X 2 =0.25，P>0.05
2.3 本法的差异比较 本法测定的批内差异为6.7%，批间差异为12.8%。
2.4 临床应用 风湿热活动期病人抗-ACHO水平及阳性率(2.58±1.26;74.1%)明显高于静止期病人(1.75±1.15;28.6%)(P<0.01)，而静止期病人亦明显高于对照组病人(0.99±0.665;8.3%)(P<0.01)，见表2。
表2 风湿活动期组、风心病静止组和对照组血清抗-ACHO结果比较
注: ˇ①和②比较， ˇˇ ②和③比较， ˇˇˇ ①和③比较
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3 讨论
传统的咽拭子培养、ASO和抗DNA酶B检测对支持链球菌感染是很有帮助的，但ASO和抗DNA酶B均为链球菌胞外产物的抗体，而链球菌胞外产物不能引起自身免疫反应，故不能提示风湿热自身免疫反应是否存在。A族链球菌细胞壁多糖抗原(ACHO)位于A族链球菌细胞壁的中层，具有族特异性，与人心脏瓣膜糖蛋白有交叉免疫反应。国内外研究结果表明，抗-ACHO抗体是反映风湿热活动的主要性能指标，此抗体不但能支持先前有过链球菌感染和当前有ARF自身免疫反应的存在，还能显示风湿热的预后，在临床上有较大的诊断价值 [2] 。
多年来国内外对抗-ACHO抗体的测定方法进行了广泛的研究，但尚未能找到一种可以被临床接受的方法，这大大阻碍了人们对抗-ACHO抗体的研究进程。国外先后应用凝集法、凝胶免疫抗散法和放免法测定抗-ACHO抗体 [4] 。但由于前二者特异性及灵敏度较差，各实验室的结果大相径庭;后者存在放射性污染，难以被接受。
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随着研究的深入，人们证实，ACHO的主要成分是鼠李糖和乙酰葡萄糖胺。在此基础上建立了ELISA法测定抗-ACHO抗体 [4，6] ，特异性及灵敏度大大提高。但由于抗原提取及纯化较困难，难以推广应用。Todome [5] 等对ELISA方 法进行了改良，以胰蛋白酶、链霉蛋白酶等处理后的整个链球菌细胞作抗原，代替纯化的ACHO抗原，发现两者相关性良好，因此认为整个链球菌细胞作为抗原完全能够代替AˉCHO抗原。但由于步骤繁杂、试剂昂贵，仍难以被推广。我们在Todome的基础上对ELISA方法进一步改良，在国内率先应用整个链球菌细胞作为抗原代替纯化的ACHO抗原，建立了新的ELISA方法测定抗-ACHO抗体，大大简化了操作程序。用我们的方法和Barrett法同时对58例病人标本进行检测，发现两者相关性良好(r=0.95，P<0.01)，敏感性(95.3%)、特异性(87.7%)及准确性(93.1%)较高，重复性(批内差异为8.7%，批间差异为10.8%)较好。由于抗原容易获得，操作简便，可望在国内推广应用。
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研究显示 [1，2，4，6] ，风湿活动时，血清抗-ACHO抗体的水平显著升高。但其机制目前尚不清楚，有人推测可能与受损的心脏瓣膜组织不断释放与ACHO有交叉反应的糖蛋白，从而不断刺激机体产生大量的抗-ACHO抗体有关。新近国内有研究进一步提示 [7] ，血清抗-ACHO抗体能高度反映心瓣膜风湿性炎症的病理变化，其特异性和敏感性较传统的化验室指标为优，尤其是对临床最难判断的风心病伴低度风湿活动意义更大。用我们的方法测定不同病人的标本，结果显示风湿热活动期病人抗-ACHO抗体水平明显高于静止期病人，而静止期病人抗-ACHO抗体水平亦明显高于一般病人(对照组)，与上述结论相符。
整个链球菌细胞作为抗原代替ACHO抗原的机制尚不清楚，有待进一步研究。
参考文献
1 Appletio RS，Victorrica BE，Tamer D，et al.Specitity of peristence of anˉtibody to the streptococcal group A Carbohydrate in rheumatic valvular heart disease.J Lab Med，1985，105:114-119.
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2 余步云.链球菌感染在风湿热中的地位.中华风湿病学杂志，1998，2:3-4.
3 American Heart Association Writing Group.Guideline for the diagnosisof rheumatic fever:Jone criteria，updated，1992.Circularion，1993，87: 303-307.
4 Barrett DJ.Triggiang M，Ayoub EM.Assay of antibody to group A strepˉtococcal carbohydrate by eneyme-linked immunosorbent assay.J Clin Microbiol，1983，18:622-627.
5 Todome Y，Ohkuni H，Yokomuro K，et al.Enzyne Immunosorbent Assay of Antibody to Group A Streptococcus-Specifis C Carbohydrate with Trypin-pronase-Treated Whole Cell as Antigen.J Clin Microbiol，1988，26:464-470.
6 彭朝权，余步云，陈国庆，等.风湿热性能指标的初步探讨.中华风湿病学杂志，1998，2(2):97-100.
7 余步云，张汉伟，黄建林，等.风心病风湿活动诊断的探讨.岭南心血管病杂志，2000，6:293-294.
作者单位:510100广东省人民医院
(编辑罗 彬), http://www.100md.com
关键词 链球菌 酿脓 C多糖 酶联免疫吸附测定 风湿热
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【文献标识码】 A 【文章编号】1609-6614(2004)06-0511-03
Detection of antibody group A streptococcal C carbohydrate by
ELISA and its clinical significance
Chen Jianguang，Dong Taiming，Su Jian，et al.
Rheumatic Fever Laboratory，Guangdong Provincial Cardiovascular Disease Institute，Guangzhou510100.
【Abstract】 Objective To establish an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)method for group A streptococcus cell wall carbohydrate(ACHO)antibody in human sera and to evaluate its clinical significance.Methˉods Group A streptococcal whole cell with trypsin-treated were used as coating antigen to develop and ELISA for the detection of anti-ACHO antibody in human sera.Anti-ACHO antibodies of58patients with active rheumatic heart disease，56patients with inactive rheumatic heart disease and48non-rheumatic heart disease patients were deˉtectedby this method.The58patients with active rheumatic heart disease were also underwent Barrett’s test that with purified ACHO as antigen.Barrett’s was regardedas a gold standard，and this method was evaluated.Results (1)The sensitivity and specificity of our method were93.5%and86.7%respective;the accuracy was92.3%;the posiˉtive and negative predictive values were94.3%and89.6%respectively;the intra-assay coefficient of variation(CV)was6.7%;and the inter-assay CV was12.8%.(2)Levels P value(2.58±1.26)and positive rates(74.1%)of serum anti-ACHO antibody in patients with active rheumatic heart disease group are much higher than those of inactive rheumatic disease group and non-rheumatic heart disease patients(P<0.01).Conclusion The ELISA method that we have established for anti-ACHO antibody can be used in clinical and experimental study on the group A streptococcal infection，because the method is simple，sensitive and specific and the antigen can be prepared easily.
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Key words streptococcus pyogenesis C carbohydrate enzyme-linked immunosorbent assay rheumatic fever
风湿热(RF)活动在临床诊断上仍是一个难题。有研究表明，测定血清抗-ACHO抗体对诊断风湿热活动有很高的临床价值 [1，2] 。但由于测定抗-ACHO抗体的方法目前尚在试验阶段 [2] ，而且方法繁杂，试剂昂贵，难以在临床推广。我们建立了一种简易、经济、特异性高的ELISA方法测定抗-ACHO抗体，以期有助于RF的诊断和抗-ACHO抗体的进一步研究。
1 材料与方法
1.1 研究对象 共162例，均为1998～2002年本院住院病人。其中风心活动期病人58例，年龄8～67岁(平均21±12岁)，符合最新修订的风湿热诊断Jone氏标准 [3] ;风心病静止期病人56例，年龄8～51岁(平均34±11岁)，经心脏听诊、心脏B超、X线胸片、心电图等确诊，实验室检查无风湿活动证据;对照组病人48例，年龄2～60岁(平均23±19岁)，均为排除风湿性心脏病的其他心脏病病人。所有病人清晨空腹静脉取血3ml，新鲜分离血清置-20℃，备用。
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1.2 主要试剂 A族链球菌(GAS)标准菌标(32132A)，美国明尼苏达大学世界卫生组织链球菌协作和参考研究中心提供;碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体(二抗)，SIGMA公司产，效价1:5000;对硝基苯磷酸酯(底物)，SIGMA公司产;聚乙烯醇，广州医药公司进口分装;牛血清蛋白，北京双旋微生物培养基制品厂。
1.3 实验方法
1.3.1 抗原的制备 从血平板上选择纯的GAS(标准菌株)于托氏肉汤中扩大培养(37℃，18h)，然后将培养液置56℃水浴30min灭活细菌，1500r离心15min，收集沉淀物，用消毒过的PBS(pH7.4)洗涤5次，收集沉淀物置4℃备用。
1.3.2 ELISA方法的建立 (1)包被:以50mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9)将上述抗原稀释成3×10 8 /ml(细菌数)，包被96孔聚乙烯板(50μl/孔)，37℃温箱烘干，用0.05%的Tween-20PBS洗涤3次。(2)封闭:每孔加入含1%聚乙烯醇PBS(pH7.4)200μl，37℃1h，洗涤3次。(3)加样:每孔加入待测血清50μl(1:4000稀释)，每板设一正常对照、阳性对照及空白(PBS)，37℃1h，洗涤3次。(4)加入酶标二抗每孔100μl，37℃1h，洗涤3次。(5)显色:每孔加入底物100μl，37℃1h。(6)比色:以空白调零，405nm波长测定光密度(O.D)。(7)结果判断:P/N=测定标本O.D均值/阴性血清O.D均值，以P/N≥2.1为阳性。
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1.3.3 方法学质控 同一标本同次重复20孔，计算批内差异;同一标本不同批次连续检测20次，计算批间差异。
1.3.4 Barrett法(以纯化的ACHO作抗原) 按文献资料报告进行 [4] 。
1.4 统计方法 以Barrett法作标准，按照诊断实验评价方法采用四格表分析，计算敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值。两法比较用配对计算资料X 2 检验和直线相关分析。均值的比较用U检验，率的比较用X 2 检验。
2 结果
2.1 实验条件 包被抗原的浓度、血清稀释度、反应温度、 反应时间等均由棋盘试验确定。
2.2 本法与Barrett法结果比较 见表1，两法检测结果差异无显著性。(X 2 =0.25，P>0.05)，且存在正相关(r=0.95，P<0.01)。本法检测抗-ACHO抗体的敏感性为95.3%、特异性为86.7%、准确性为93.1%、阳性预测值为95.3%、阴性预测值为86.7%。
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表1 本法检测与Barrett方法检测结果的比较
注:两法比较，r=0.95，P<0.01，X 2 =0.25，P>0.05
2.3 本法的差异比较 本法测定的批内差异为6.7%，批间差异为12.8%。
2.4 临床应用 风湿热活动期病人抗-ACHO水平及阳性率(2.58±1.26;74.1%)明显高于静止期病人(1.75±1.15;28.6%)(P<0.01)，而静止期病人亦明显高于对照组病人(0.99±0.665;8.3%)(P<0.01)，见表2。
表2 风湿活动期组、风心病静止组和对照组血清抗-ACHO结果比较
注: ˇ①和②比较， ˇˇ ②和③比较， ˇˇˇ ①和③比较
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3 讨论
传统的咽拭子培养、ASO和抗DNA酶B检测对支持链球菌感染是很有帮助的，但ASO和抗DNA酶B均为链球菌胞外产物的抗体，而链球菌胞外产物不能引起自身免疫反应，故不能提示风湿热自身免疫反应是否存在。A族链球菌细胞壁多糖抗原(ACHO)位于A族链球菌细胞壁的中层，具有族特异性，与人心脏瓣膜糖蛋白有交叉免疫反应。国内外研究结果表明，抗-ACHO抗体是反映风湿热活动的主要性能指标，此抗体不但能支持先前有过链球菌感染和当前有ARF自身免疫反应的存在，还能显示风湿热的预后，在临床上有较大的诊断价值 [2] 。
多年来国内外对抗-ACHO抗体的测定方法进行了广泛的研究，但尚未能找到一种可以被临床接受的方法，这大大阻碍了人们对抗-ACHO抗体的研究进程。国外先后应用凝集法、凝胶免疫抗散法和放免法测定抗-ACHO抗体 [4] 。但由于前二者特异性及灵敏度较差，各实验室的结果大相径庭;后者存在放射性污染，难以被接受。
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随着研究的深入，人们证实，ACHO的主要成分是鼠李糖和乙酰葡萄糖胺。在此基础上建立了ELISA法测定抗-ACHO抗体 [4，6] ，特异性及灵敏度大大提高。但由于抗原提取及纯化较困难，难以推广应用。Todome [5] 等对ELISA方 法进行了改良，以胰蛋白酶、链霉蛋白酶等处理后的整个链球菌细胞作抗原，代替纯化的ACHO抗原，发现两者相关性良好，因此认为整个链球菌细胞作为抗原完全能够代替AˉCHO抗原。但由于步骤繁杂、试剂昂贵，仍难以被推广。我们在Todome的基础上对ELISA方法进一步改良，在国内率先应用整个链球菌细胞作为抗原代替纯化的ACHO抗原，建立了新的ELISA方法测定抗-ACHO抗体，大大简化了操作程序。用我们的方法和Barrett法同时对58例病人标本进行检测，发现两者相关性良好(r=0.95，P<0.01)，敏感性(95.3%)、特异性(87.7%)及准确性(93.1%)较高，重复性(批内差异为8.7%，批间差异为10.8%)较好。由于抗原容易获得，操作简便，可望在国内推广应用。
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研究显示 [1，2，4，6] ，风湿活动时，血清抗-ACHO抗体的水平显著升高。但其机制目前尚不清楚，有人推测可能与受损的心脏瓣膜组织不断释放与ACHO有交叉反应的糖蛋白，从而不断刺激机体产生大量的抗-ACHO抗体有关。新近国内有研究进一步提示 [7] ，血清抗-ACHO抗体能高度反映心瓣膜风湿性炎症的病理变化，其特异性和敏感性较传统的化验室指标为优，尤其是对临床最难判断的风心病伴低度风湿活动意义更大。用我们的方法测定不同病人的标本，结果显示风湿热活动期病人抗-ACHO抗体水平明显高于静止期病人，而静止期病人抗-ACHO抗体水平亦明显高于一般病人(对照组)，与上述结论相符。
整个链球菌细胞作为抗原代替ACHO抗原的机制尚不清楚，有待进一步研究。
参考文献
1 Appletio RS，Victorrica BE，Tamer D，et al.Specitity of peristence of anˉtibody to the streptococcal group A Carbohydrate in rheumatic valvular heart disease.J Lab Med，1985，105:114-119.
, http://www.100md.com
2 余步云.链球菌感染在风湿热中的地位.中华风湿病学杂志，1998，2:3-4.
3 American Heart Association Writing Group.Guideline for the diagnosisof rheumatic fever:Jone criteria，updated，1992.Circularion，1993，87: 303-307.
4 Barrett DJ.Triggiang M，Ayoub EM.Assay of antibody to group A strepˉtococcal carbohydrate by eneyme-linked immunosorbent assay.J Clin Microbiol，1983，18:622-627.
5 Todome Y，Ohkuni H，Yokomuro K，et al.Enzyne Immunosorbent Assay of Antibody to Group A Streptococcus-Specifis C Carbohydrate with Trypin-pronase-Treated Whole Cell as Antigen.J Clin Microbiol，1988，26:464-470.
6 彭朝权，余步云，陈国庆，等.风湿热性能指标的初步探讨.中华风湿病学杂志，1998，2(2):97-100.
7 余步云，张汉伟，黄建林，等.风心病风湿活动诊断的探讨.岭南心血管病杂志，2000，6:293-294.
作者单位:510100广东省人民医院
(编辑罗 彬), http://www.100md.com