不同地区冬虫夏草的RAPD分析
【摘要】 目的 从分子水平研究不同地区冬虫夏草的遗传差异，以期为不同地区冬虫夏草药理学差异及品性鉴定打下基础。方法 本文对来自不同地区的4种冬虫夏草样本进行了RAPD分析。结果 筛选出了扩增谱带清晰并呈现多态性的6个随机引物，每个引物能产生1～10条RAPD片段。根据该6个引物的RAPD谱带分析菌株间的相似系数在50%～80%之间。结论 冬虫夏草具有遗传多样性，不同地理群体间存在着遗传差异。
关键词 冬虫夏草 RAPD 遗传多样性
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)08-0685-02
Study on the cordyceps sinensis from different
areas by analysis of RAPD
, http://www.100md.com
Li Li，Yu Jia，Zhu Zhaojing，et al.
Department of Biochemistry，Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing400016.
【Abstract】 Objective To study the genetic variability of cordyceps sinensis we made some experiments on the molecular level.Methods In this paper，the species of cordyceps sinensis from four different areas were studied by random amplified polymorphisms DNA(RAPD).Results The selected six primers generated clearRAPD profiles，each one produced1～10bands.The similarity coefficients obtained from profiles generated by six primers among cordyceps sinensis were about50%～80%.Conclusion These results showed the genetic variability among the species of
, http://www.100md.com
cordyceps sinensis from different areas.
Key words cordyceps sinensis RAPD genetic variability
冬虫夏草(Cordyceps sinensis[Berk.]Sacc.)亦称夏草冬虫、虫草，产于我国四川、云南、青海、西藏等地，具有重要的药用价值。不同地区冬虫夏草的品质药性存在一定的差异。但目前市场上的药材产地复杂，常相互混杂或以假充真。为了确保中药的安全和有效性，用可靠的方法对药材进行准确鉴定显得十分必要。由于传统中药鉴定学所依赖的特征有一定的局限性，因而有必要在分子水平上用能够稳定遗传的遗传标记进行鉴定。
随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphisms DNA，RAPD)是由Williams(1990)和Welsh(1990)同时发展起来的新型遗传标记技术，无须了解DNA的任何信息，通过分析DNA片段长度的多态性可以得到相应的DNA遗传、分类、进化等信息。此技术为真菌遗传多样性分析及种性鉴定等研究提供了分子生物学证据。
, http://www.100md.com
本文拟对来自4个不同地区的冬虫夏草样本进行RAPD分析，以期探讨不同地理来源的冬虫夏草样本间是否具有遗传多样性。
1 实验材料
1.1 药材 受试的冬虫夏草样本分别来自康定、西藏、云南、马尔康。并由重庆医科大学药学系朱照静副教授鉴定。经洗涤、烘干、液氮冷冻、研磨至粉状备用。
1.2 主要试剂 琼脂糖、细胞裂解液、沉淀液、dNTP、TaqDˉNA聚合酶、随机引物为上海生工生物工程公司产品，其它试剂为国产分析纯。
2 方法
2.1 基因组DNA的提取 取冬虫夏草样品50mg，加0.2ml TE悬浮，在0.4ml细胞裂解液中混匀，65℃10min。加0.6ml氯仿混匀，10000r/min离心2min。取上层液加0.5ml沉淀液，混匀，10000r/min离心2min。吸掉溶液，立即加入0.1ml1.2mol/L NaCl，加0.3ml冰乙醇，-20℃放置10min，10000r/min离心4min。70%乙醇清洗沉淀，干燥后用TE缓冲液溶解，保存于4℃备用。
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2.2 PCR扩增 PCR扩增在PCR反应仪(美国PE公司)上进行。反应总体积为20μl，含2mmol/L MgCl 2 ，20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L KCl，0.2mmol/L dNTP，0.5%TriˉtonX-100，1μmol/L引物，2UTaqDNA聚合酶，加50μl石蜡油覆盖。扩增过程为95℃预变性5min;循环40次，每次循环包括94℃变性30s，37℃退火30s，72℃延伸1min;最后一次循环后在72℃延伸10min。每次PCR反应均设置空白对照。
2.3 扩增产物检测 RAPD产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后于紫外灯下观察拍照。
2.4 相似系数分析 两个样本相似系数S=[(2×Nab)/(Na+Nb)]×100%(其中，Nab为样本a和b共有DNA扩增片段数，Na为样本a具有的DNA扩增片段数，Nb为样本b具有的DNA扩增片段数)。
, 百拇医药
3 结果与分析
3.1 RAPD结果 我们用10bp随机引物进行扩增，筛选出条带清晰并呈现多态性的6个引物。每个引物RAPD扩增的DNA片段数为1～10条，该6个引物共扩增52条DNA片段(见表1)。
表1RAPD引物及其PCR扩增结果略
3.2 相似系数分析 对6个引物的RAPD结果进行分析，得到相似系数矩阵(见表2)。不同地区的冬虫夏草样本间相似系数在50%～80%之间。样本间相似系数不高，说明冬虫夏草具有遗传多样性，不同地区的样本间存在着较大的遗传差异。
表2 不同地区冬虫夏草样本间相似系数略
4 讨论
随着分子生物学技术的发展，DNA水平上的遗传标记 技术在中药材的鉴定方面得到了广泛应用。RAPD分析是一种有效可行的中药材鉴定方法，可反映出不同药材品种、品系之间的差异，是进行遗传多样性和品质药性等研究的实验技术之一 [1～5] 。
, 百拇医药
不同地区冬虫夏草样本不仅外型上可能存在着差异，而且寄主的种类也可能有差异，因此不同地区的冬虫夏草存在着遗传差异是合理的。本实验通过RAPD分析证明不同地区的冬虫夏草样本间具有遗传多样性，有特异性的RAPD标记，为冬虫夏草的鉴定和分析提供了分子生物学依据，并为探讨冬虫夏草居群水平生态遗传变异与品质药性之间的关系打下了基础。
在同种菌物中，不同菌株的RAPD相似系数范围可在80%～100%之间。本实验得到的不同地区冬虫夏草样本间相似系数在50%～80%，说明不同地区冬虫夏草存在着较大的遗传差异。对于存在着遗传差异的样本是否属于不同的亚种，还有待于从分类学上作进一步的研究。
参考文献
1 曹晖，刘玉萍.DNA分析技术在中药质量研究中的应用.中药新药与临床药理，1997，8(2):112-115.
2 黄勃，李振刚，樊美珍，等.粉拟青霉种内RAPD多态性分析.菌物系统，2001，20(1):62-67.
, 百拇医药
3 陈永久，王文，杨跃雄，等.冬虫夏草的随机扩增多态及其遗传分化.遗传学报，1997，24(5):410-416.
4 李增智，黄勃，李春如，等.确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据Ⅰ.中国被毛孢与冬虫夏草之间的关系.菌物系统，2000，19(1):60-64.
5 Raina SN，Rani V，Kojima T，et al.RAPD and ISSR fingerprints as useˉful genetic markers for analysis of genetic diversity，variety identificaˉtion，and polygenetic relationships in peanut(Arachis hypogaea)cultivars and wild species.Genome，2001，44(5):763-772.
作者单位:400016重庆医科大学生物化学教研室
(编辑 小川), 百拇医药
关键词 冬虫夏草 RAPD 遗传多样性
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)08-0685-02
Study on the cordyceps sinensis from different
areas by analysis of RAPD
, http://www.100md.com
Li Li，Yu Jia，Zhu Zhaojing，et al.
Department of Biochemistry，Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing400016.
【Abstract】 Objective To study the genetic variability of cordyceps sinensis we made some experiments on the molecular level.Methods In this paper，the species of cordyceps sinensis from four different areas were studied by random amplified polymorphisms DNA(RAPD).Results The selected six primers generated clearRAPD profiles，each one produced1～10bands.The similarity coefficients obtained from profiles generated by six primers among cordyceps sinensis were about50%～80%.Conclusion These results showed the genetic variability among the species of
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cordyceps sinensis from different areas.
Key words cordyceps sinensis RAPD genetic variability
冬虫夏草(Cordyceps sinensis[Berk.]Sacc.)亦称夏草冬虫、虫草，产于我国四川、云南、青海、西藏等地，具有重要的药用价值。不同地区冬虫夏草的品质药性存在一定的差异。但目前市场上的药材产地复杂，常相互混杂或以假充真。为了确保中药的安全和有效性，用可靠的方法对药材进行准确鉴定显得十分必要。由于传统中药鉴定学所依赖的特征有一定的局限性，因而有必要在分子水平上用能够稳定遗传的遗传标记进行鉴定。
随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphisms DNA，RAPD)是由Williams(1990)和Welsh(1990)同时发展起来的新型遗传标记技术，无须了解DNA的任何信息，通过分析DNA片段长度的多态性可以得到相应的DNA遗传、分类、进化等信息。此技术为真菌遗传多样性分析及种性鉴定等研究提供了分子生物学证据。
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本文拟对来自4个不同地区的冬虫夏草样本进行RAPD分析，以期探讨不同地理来源的冬虫夏草样本间是否具有遗传多样性。
1 实验材料
1.1 药材 受试的冬虫夏草样本分别来自康定、西藏、云南、马尔康。并由重庆医科大学药学系朱照静副教授鉴定。经洗涤、烘干、液氮冷冻、研磨至粉状备用。
1.2 主要试剂 琼脂糖、细胞裂解液、沉淀液、dNTP、TaqDˉNA聚合酶、随机引物为上海生工生物工程公司产品，其它试剂为国产分析纯。
2 方法
2.1 基因组DNA的提取 取冬虫夏草样品50mg，加0.2ml TE悬浮，在0.4ml细胞裂解液中混匀，65℃10min。加0.6ml氯仿混匀，10000r/min离心2min。取上层液加0.5ml沉淀液，混匀，10000r/min离心2min。吸掉溶液，立即加入0.1ml1.2mol/L NaCl，加0.3ml冰乙醇，-20℃放置10min，10000r/min离心4min。70%乙醇清洗沉淀，干燥后用TE缓冲液溶解，保存于4℃备用。
, http://www.100md.com
2.2 PCR扩增 PCR扩增在PCR反应仪(美国PE公司)上进行。反应总体积为20μl，含2mmol/L MgCl 2 ，20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L KCl，0.2mmol/L dNTP，0.5%TriˉtonX-100，1μmol/L引物，2UTaqDNA聚合酶，加50μl石蜡油覆盖。扩增过程为95℃预变性5min;循环40次，每次循环包括94℃变性30s，37℃退火30s，72℃延伸1min;最后一次循环后在72℃延伸10min。每次PCR反应均设置空白对照。
2.3 扩增产物检测 RAPD产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后于紫外灯下观察拍照。
2.4 相似系数分析 两个样本相似系数S=[(2×Nab)/(Na+Nb)]×100%(其中，Nab为样本a和b共有DNA扩增片段数，Na为样本a具有的DNA扩增片段数，Nb为样本b具有的DNA扩增片段数)。
, 百拇医药
3 结果与分析
3.1 RAPD结果 我们用10bp随机引物进行扩增，筛选出条带清晰并呈现多态性的6个引物。每个引物RAPD扩增的DNA片段数为1～10条，该6个引物共扩增52条DNA片段(见表1)。
表1RAPD引物及其PCR扩增结果略
3.2 相似系数分析 对6个引物的RAPD结果进行分析，得到相似系数矩阵(见表2)。不同地区的冬虫夏草样本间相似系数在50%～80%之间。样本间相似系数不高，说明冬虫夏草具有遗传多样性，不同地区的样本间存在着较大的遗传差异。
表2 不同地区冬虫夏草样本间相似系数略
4 讨论
随着分子生物学技术的发展，DNA水平上的遗传标记 技术在中药材的鉴定方面得到了广泛应用。RAPD分析是一种有效可行的中药材鉴定方法，可反映出不同药材品种、品系之间的差异，是进行遗传多样性和品质药性等研究的实验技术之一 [1～5] 。
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不同地区冬虫夏草样本不仅外型上可能存在着差异，而且寄主的种类也可能有差异，因此不同地区的冬虫夏草存在着遗传差异是合理的。本实验通过RAPD分析证明不同地区的冬虫夏草样本间具有遗传多样性，有特异性的RAPD标记，为冬虫夏草的鉴定和分析提供了分子生物学依据，并为探讨冬虫夏草居群水平生态遗传变异与品质药性之间的关系打下了基础。
在同种菌物中，不同菌株的RAPD相似系数范围可在80%～100%之间。本实验得到的不同地区冬虫夏草样本间相似系数在50%～80%，说明不同地区冬虫夏草存在着较大的遗传差异。对于存在着遗传差异的样本是否属于不同的亚种，还有待于从分类学上作进一步的研究。
参考文献
1 曹晖，刘玉萍.DNA分析技术在中药质量研究中的应用.中药新药与临床药理，1997，8(2):112-115.
2 黄勃，李振刚，樊美珍，等.粉拟青霉种内RAPD多态性分析.菌物系统，2001，20(1):62-67.
, 百拇医药
3 陈永久，王文，杨跃雄，等.冬虫夏草的随机扩增多态及其遗传分化.遗传学报，1997，24(5):410-416.
4 李增智，黄勃，李春如，等.确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据Ⅰ.中国被毛孢与冬虫夏草之间的关系.菌物系统，2000，19(1):60-64.
5 Raina SN，Rani V，Kojima T，et al.RAPD and ISSR fingerprints as useˉful genetic markers for analysis of genetic diversity，variety identificaˉtion，and polygenetic relationships in peanut(Arachis hypogaea)cultivars and wild species.Genome，2001，44(5):763-772.
作者单位:400016重庆医科大学生物化学教研室
(编辑 小川), 百拇医药