高凝状态患者外周血单核细胞促凝血活性及体外干预试验
【摘要】 目的 研究高凝状态患者及正常人外周血单核细胞(HPMC)的促凝血活性(PCA)和纤溶活性(PA)以及体外丹参注射液及黄芪注射液对体外培养单核细胞表达PCA和PA的影响。方法 分离高凝状态患者及正常人外周血单核细胞(HPMC)，短期培养后用发色底物法检测其促凝血活性(PCA)和纤溶活性(PA)，检测加丹参注射液及黄芪注射液对体外培养HPMC表达PCA和PA的作用。结果 本研究发现高凝状态如糖尿病、冠心病和实体肿瘤患者的分离外周血HPMC表达PCA明显高于正常人;在细菌脂多糖(LPS)的刺激下，其HPMC表达PCA明显增加，而PA无变化;体外加入丹参注射液及黄芪注射液一起培养后，其LPS刺激PCA的表达均受抑制，而以丹参和黄芪注射液一起加入组的抑制最为明显。结论 高凝状态如糖尿病、冠心病和实体肿瘤患者的分离外周血HPMC表达PCA明显增高;体外加入丹参注射液及黄芪注射液可以抑制其PCA的表达。
关键词 高凝状态 外周血单核细胞 促凝血活性 体外干预
, 百拇医药 【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)05-0399-03
Procoagulative activity of human peripheral blood monocytes in patients with
high coagulative state and in vitro intervening examination on them Sun Aihong，
Shi Saizhu，Ni Zanming.
Department of Hernatology of Subei People’s Hospital of Jiangsu Province，Yangzhou225001.
【Abstract】 Objective Procoagalative activity(PCA)and plasminogen activity(PA)of human peripheral blood monocytes(HPMC)in patients with high coagulative state such as diabetes mellitus(DM)，coronary artery disˉease(CAD)andsolid tumor(ST)and normal persons were studied.At the same time，the effect of injections such as Traditional Chinese Medicine injection of danshen and huangqi on the HPMC in vitro from patients with high coagulaˉtive state was investigated.Methods HPMCs from these patients and normal persons were sored by density gradient Fieoll-Hypaque and cultured48hours in vitro.PCA and PA from these patients and mormal persoms were examined by assay of chromophorous substrate.The effects of Traditional Chinese Medicine injection of danshen and huangqi on PCA and PA expressing in vitro cultured moncytes were assessed.Results Our results revealed that PCA of HPMC in patients with high coagulative state were higher significantly than those of normal controls.PCA expressing in in vitro cultured monocytes in normal persoms had increasad signifieantly(P<0.05)after stimulated by lipopolysaccharide(LPS)，while PA had no effect.PCA were inhibited when injections danshen and huangqi were added to the culture medium at the same time，however，there had been a significantly inhibitory effect on the group of adding injection dan and huangqi to in vitro culture medium.Conclusion There were pronounced higher PCA of patients from DM，CAD and ST was sorted HPMC than that of normal patients.After cultured for48hours in vitro，PCA of sorted HPMC from theses patients was inhibited after having been supplemented with Traditional Chinese Medicine injection of danshen and huangqi.
, 百拇医药
Key words high coagulative state human peripheral blood monocytes procoagulative activity in vitro inˉtervening
近年来研究认为，人外周血单核细胞(HPMC)可产生和(或)结合组织因子(TF)等凝血因子。通过内/外源性凝血途径启动凝血系统表达其促凝血活性(PCA);而且它也可合成和(或)结合纤溶酶原激活物及抑制物等纤溶组分，参与调节机体的凝血与纤溶平衡 [1]。Eggesbq [2] 等研究发现HPMC表达PCA和PA随高密度脂蛋白(HDL)的浓度而变化，HDL浓度低的患者表达PA升高;在细菌脂多糖(LPS)刺激下，PCA和PAI-1明显上升，而t-PA和u-PA均下降。本研究用改良二期发色底物法检测高凝状态患者如糖尿病、冠心病及实体肿瘤患者的HPMC的PCA和PA表达，并用LPS作为刺激剂，丹参、丹参注射液或黄芪注射液作为体外干预药物，以初步了解单核细胞的促凝血活性作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂 (1)淋巴细胞分离液:上海试剂二厂生产。(2)RPMI1640培养液:RPMI164010.4g，谷氨酸2mmol/L，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，Na 2 CO 3 2.0g，HEPES476.6mg，配成1000ml。(3)S2222:上海申海生化科技公司生产，2mg/ml以0.85%NaCl溶解。(4)组织凝血活酶:上海通用医疗器械公司生产(上海医科大学华山医院监制)，国际敏感指数(ISI)为1.78。冻融，以0.1mol/L Tris缓冲溶液倍比稀释。FVII/FX溶液:参考魏氏 [3] 方法制备，-70℃储存。临用时37℃。(5)细菌脂多糖(LPS):美国Sigma公司生产。(6)丹参、黄芪注射液:华山医院制剂室提供，3mg/ml。(7)t-PA活性检测试剂盒:上海医科大学分子遗传实验室提供。(8)PAI-1活性检测试剂盒:上海医科大学分子遗传实验室提供。
, 百拇医药
1.2 主要器材 (1)超净台;(2)CO 2 培养箱;(3)Bio-Rad酶标仪。
1.3 研究对象 (1)随机抽取30名正常体检查，排除感染、出血、血栓及肝肾疾病病史，2周内未服影响血栓与止血的药物，年龄40～50岁，男15例，女15例。(2)观察糖尿病、冠心病及实体肿瘤患者各30例，年龄40～50岁，男15例，女15例，抽取标本2周内未服影响血栓与止血的药物，排除感染、出血、血栓及肝肾损害等病理状态。
1.4 标本的采集及处理 (1)内毒素检测:对HPMC分离时所有试剂均进行内毒素检测，其含量均要求低于16pg;超过此范围重新配制。(2)HPMC的分离:参考文献 [4] 。晨起 空腹抗凝静脉血→提取白细胞悬液→用淋巴细胞分离液获取单个核细胞→粘附法提取单核细胞→应用0.85%NaCl重新悬浮成2×10 6 HPMC/ml。
, http://www.100md.com
1.5 检测方法 (1)PCA活性单位设置:以国产已标化的组织凝血酶稀释10 6 倍为1mu。(2)t-PA和PAI-1测定:均用发色底物法，参考说明书进行。(3)PCA测定:反应体系由50μl不等活性的组织凝血酶、50μl FVII/FX液、50μl25mmol/L CaCl 2 液、50μl S2222组成;分离的HPMC替代50μl不等活性的组织凝血酶，并分别用LPS、LPS+黄芪(H)、LPS+丹参(D)、LPS+黄芪/丹参(H/D)处理。上述体系于37℃湿度饱和，5%CO 2 培养箱中孵育48h，测定PCA及PA。
1.6 统计方法 方差分析。
2 结果
2.1 高凝状态患者HPMC的促凝血活性结果 见表1，结果提示3组患者的HPMC的PCA明显高于正常值9.70±1.75mu/10 5 cells，以糖尿病患者组最为明显，与冠心病及实体肿瘤患者组相比，差异均有显著性(P<0.05)，而后两组患者相比差异无显著性。
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表1 高凝状态患者HPMC的促凝血活性
注:与正常对照组比较， ˇ P<0.05;冠心病与实体肿瘤组比较， # P>0.05
2.2 正常人体外培养HPMC经LPS表达PCA和PA以及药物干预结果 见表2。体外培养HPMC表达PCA为9.70±1.75mu/10 5 cells;与LPS一起培养后，其表达PCA明显上升，约升高10倍;但用丹参或黄芪与LPS一起加至HPMC 培养后，其表达PCA明显受抑制，而以黄芪合并丹参组最为明显，且黄芪的抑制作用比丹参明显;加黄芪组与同时加丹参/黄芪组的PCA抑制作用无明显差异;各组的PA作用未见明显差异。
表2 HPMC表达PCA、PA及药物干预结果
注:(1)D:丹参;H:黄芪;(2)与LPS比较， ˇ P<0.01;与加D组比较， # P<0.01;与加H组比较， △ P>0.05
, 百拇医药
3 讨论
HPMC的PCA及PA活性表达是单核细胞及组织巨噬细胞的生物学特性之一，在革兰阴性杆菌内毒素(主要为细菌脂多糖，LPS)刺激下其PCA表达明显增高 [5] ，因此，本实验进行了内毒素的检测，以排除其对实验的影响。在正常人健康良好状态下，HPMC表达PCA很低。本实验组测得 健康者PCA为9.70±1.75mu/cells。有研究提示 [6] 人颈动脉粥样硬化的以泡沫细胞存在的单核细胞及临近胆固醇裂隙的单核细胞均有TF抗原存在，应用原位杂交方法同时发现这些部位TFmRNA呈阳性。临床上有一系列疾病如糖尿病、冠心病以及实体肿瘤患者尽管无明显的血栓表现或实验室关于凝血指标方面的异常，但这些患者容易发生血栓性疾病，尤其糖尿病患者，容易发生大血管及微血管疾病，即使血糖控制正常。国内有报道丹参对内皮细胞 [7] 、平滑肌细胞 [8] 的促凝血活性作用。丹参及黄芪为临床上用于如冠心病、糖尿病伴发血管病变等的常用药，血栓前状态为它们共同的病理生理机制之一 [9] 。本研究观察丹参及黄芪对LPS刺激HPMC表达PCA影响的结果，中药补气和(或)活血对HPMC表达PCA有抑制作用，但其作用机制尚不清楚，有待进一步研究。临床上对于血栓性疾病以及有血栓形成倾向的如心脑血管、糖尿病等常须使用抗凝药物，但它们有出血倾向及胃肠道等副作用，而使用中成药及中药制剂已成为这些疾病的不可缺少的疗法。本试验观察的病例对于临床有一定的指导作用，但由于样本量较小，有待于进一步研究这些疾病的促凝血活性对其发病及发展的作用。
, 百拇医药
参考文献
1 Meisel SR，Xu XP，Edgington TS，et al.Differentiation of adherent huˉmanmonocytes into macrophages markedly enhances tissue factor protein expression and procoagulant activity.Atherosclerosis，2002，161(1):35-43.
2 Eggesbq JB，Kjermano I，Qvstebq K，et al.LPS induced procoagulant acˉ tivity and plasminogen activator activity in mononuclear cells from perˉsons with high or low levels of HDL lipoprotein.Thromb Res，1995，77(5):441-452.
, http://www.100md.com
3 魏文宁，宋善俊，刘仲萍，等.二步法血浆凝血酶X的测定.中华血液学杂志，1991，14(6):351-353.
4 Qyum A.Isolation of human blood monocytes with nycodenz:a nem non-inoic iodinated gradient medium.Scand J Immunol，1993，17:429-436.
5 McGilvray ID，Tsai V，Marshall JC.Monocyte adhesion and transmigraˉtion induce tissue factor expression:role of the mitogen-activated proˉtein kinases.Shock，2002，18(1):51-57.
6 Wilcox JN，Smith KM，Schwartz SM.Localization of tissue factor in the normal vessel wall and in the atherosclerotic plaque.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86(8):2839-2843.
, http://www.100md.com
7 沈全陆，张彩英，黄桂秋，等.丹参对内毒素影响内皮细胞凝血和纤溶功能的作用.中华血液学杂志，1993，14(10):540-543.
8 毛申生，张彩英，黄桂秋，等.丹参对血管平滑肌抑制内皮细胞分泌的纤溶酶原激活物活性的影响.中国病理生理杂志，1991，7(2):134-136.
9 Bjerre A，Brusletto B，Rosenqvist E，et al.Cellular activating properties and morphology of membrane-bound and purified meningococcal lipopolysaccharide.J Endotoxin Res，2000，6(6):437-445.
作者单位:225001江苏扬州江苏省苏北人民医院血液科
复旦大学附属华山医院
(收稿日期:2003-12-03)
(编辑子 萱), 百拇医药
关键词 高凝状态 外周血单核细胞 促凝血活性 体外干预
, 百拇医药 【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)05-0399-03
Procoagulative activity of human peripheral blood monocytes in patients with
high coagulative state and in vitro intervening examination on them Sun Aihong，
Shi Saizhu，Ni Zanming.
Department of Hernatology of Subei People’s Hospital of Jiangsu Province，Yangzhou225001.
【Abstract】 Objective Procoagalative activity(PCA)and plasminogen activity(PA)of human peripheral blood monocytes(HPMC)in patients with high coagulative state such as diabetes mellitus(DM)，coronary artery disˉease(CAD)andsolid tumor(ST)and normal persons were studied.At the same time，the effect of injections such as Traditional Chinese Medicine injection of danshen and huangqi on the HPMC in vitro from patients with high coagulaˉtive state was investigated.Methods HPMCs from these patients and normal persons were sored by density gradient Fieoll-Hypaque and cultured48hours in vitro.PCA and PA from these patients and mormal persoms were examined by assay of chromophorous substrate.The effects of Traditional Chinese Medicine injection of danshen and huangqi on PCA and PA expressing in vitro cultured moncytes were assessed.Results Our results revealed that PCA of HPMC in patients with high coagulative state were higher significantly than those of normal controls.PCA expressing in in vitro cultured monocytes in normal persoms had increasad signifieantly(P<0.05)after stimulated by lipopolysaccharide(LPS)，while PA had no effect.PCA were inhibited when injections danshen and huangqi were added to the culture medium at the same time，however，there had been a significantly inhibitory effect on the group of adding injection dan and huangqi to in vitro culture medium.Conclusion There were pronounced higher PCA of patients from DM，CAD and ST was sorted HPMC than that of normal patients.After cultured for48hours in vitro，PCA of sorted HPMC from theses patients was inhibited after having been supplemented with Traditional Chinese Medicine injection of danshen and huangqi.
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Key words high coagulative state human peripheral blood monocytes procoagulative activity in vitro inˉtervening
近年来研究认为，人外周血单核细胞(HPMC)可产生和(或)结合组织因子(TF)等凝血因子。通过内/外源性凝血途径启动凝血系统表达其促凝血活性(PCA);而且它也可合成和(或)结合纤溶酶原激活物及抑制物等纤溶组分，参与调节机体的凝血与纤溶平衡 [1]。Eggesbq [2] 等研究发现HPMC表达PCA和PA随高密度脂蛋白(HDL)的浓度而变化，HDL浓度低的患者表达PA升高;在细菌脂多糖(LPS)刺激下，PCA和PAI-1明显上升，而t-PA和u-PA均下降。本研究用改良二期发色底物法检测高凝状态患者如糖尿病、冠心病及实体肿瘤患者的HPMC的PCA和PA表达，并用LPS作为刺激剂，丹参、丹参注射液或黄芪注射液作为体外干预药物，以初步了解单核细胞的促凝血活性作用。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 (1)淋巴细胞分离液:上海试剂二厂生产。(2)RPMI1640培养液:RPMI164010.4g，谷氨酸2mmol/L，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，Na 2 CO 3 2.0g，HEPES476.6mg，配成1000ml。(3)S2222:上海申海生化科技公司生产，2mg/ml以0.85%NaCl溶解。(4)组织凝血活酶:上海通用医疗器械公司生产(上海医科大学华山医院监制)，国际敏感指数(ISI)为1.78。冻融，以0.1mol/L Tris缓冲溶液倍比稀释。FVII/FX溶液:参考魏氏 [3] 方法制备，-70℃储存。临用时37℃。(5)细菌脂多糖(LPS):美国Sigma公司生产。(6)丹参、黄芪注射液:华山医院制剂室提供，3mg/ml。(7)t-PA活性检测试剂盒:上海医科大学分子遗传实验室提供。(8)PAI-1活性检测试剂盒:上海医科大学分子遗传实验室提供。
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1.2 主要器材 (1)超净台;(2)CO 2 培养箱;(3)Bio-Rad酶标仪。
1.3 研究对象 (1)随机抽取30名正常体检查，排除感染、出血、血栓及肝肾疾病病史，2周内未服影响血栓与止血的药物，年龄40～50岁，男15例，女15例。(2)观察糖尿病、冠心病及实体肿瘤患者各30例，年龄40～50岁，男15例，女15例，抽取标本2周内未服影响血栓与止血的药物，排除感染、出血、血栓及肝肾损害等病理状态。
1.4 标本的采集及处理 (1)内毒素检测:对HPMC分离时所有试剂均进行内毒素检测，其含量均要求低于16pg;超过此范围重新配制。(2)HPMC的分离:参考文献 [4] 。晨起 空腹抗凝静脉血→提取白细胞悬液→用淋巴细胞分离液获取单个核细胞→粘附法提取单核细胞→应用0.85%NaCl重新悬浮成2×10 6 HPMC/ml。
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1.5 检测方法 (1)PCA活性单位设置:以国产已标化的组织凝血酶稀释10 6 倍为1mu。(2)t-PA和PAI-1测定:均用发色底物法，参考说明书进行。(3)PCA测定:反应体系由50μl不等活性的组织凝血酶、50μl FVII/FX液、50μl25mmol/L CaCl 2 液、50μl S2222组成;分离的HPMC替代50μl不等活性的组织凝血酶，并分别用LPS、LPS+黄芪(H)、LPS+丹参(D)、LPS+黄芪/丹参(H/D)处理。上述体系于37℃湿度饱和，5%CO 2 培养箱中孵育48h，测定PCA及PA。
1.6 统计方法 方差分析。
2 结果
2.1 高凝状态患者HPMC的促凝血活性结果 见表1，结果提示3组患者的HPMC的PCA明显高于正常值9.70±1.75mu/10 5 cells，以糖尿病患者组最为明显，与冠心病及实体肿瘤患者组相比，差异均有显著性(P<0.05)，而后两组患者相比差异无显著性。
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表1 高凝状态患者HPMC的促凝血活性
注:与正常对照组比较， ˇ P<0.05;冠心病与实体肿瘤组比较， # P>0.05
2.2 正常人体外培养HPMC经LPS表达PCA和PA以及药物干预结果 见表2。体外培养HPMC表达PCA为9.70±1.75mu/10 5 cells;与LPS一起培养后，其表达PCA明显上升，约升高10倍;但用丹参或黄芪与LPS一起加至HPMC 培养后，其表达PCA明显受抑制，而以黄芪合并丹参组最为明显，且黄芪的抑制作用比丹参明显;加黄芪组与同时加丹参/黄芪组的PCA抑制作用无明显差异;各组的PA作用未见明显差异。
表2 HPMC表达PCA、PA及药物干预结果
注:(1)D:丹参;H:黄芪;(2)与LPS比较， ˇ P<0.01;与加D组比较， # P<0.01;与加H组比较， △ P>0.05
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3 讨论
HPMC的PCA及PA活性表达是单核细胞及组织巨噬细胞的生物学特性之一，在革兰阴性杆菌内毒素(主要为细菌脂多糖，LPS)刺激下其PCA表达明显增高 [5] ，因此，本实验进行了内毒素的检测，以排除其对实验的影响。在正常人健康良好状态下，HPMC表达PCA很低。本实验组测得 健康者PCA为9.70±1.75mu/cells。有研究提示 [6] 人颈动脉粥样硬化的以泡沫细胞存在的单核细胞及临近胆固醇裂隙的单核细胞均有TF抗原存在，应用原位杂交方法同时发现这些部位TFmRNA呈阳性。临床上有一系列疾病如糖尿病、冠心病以及实体肿瘤患者尽管无明显的血栓表现或实验室关于凝血指标方面的异常，但这些患者容易发生血栓性疾病，尤其糖尿病患者，容易发生大血管及微血管疾病，即使血糖控制正常。国内有报道丹参对内皮细胞 [7] 、平滑肌细胞 [8] 的促凝血活性作用。丹参及黄芪为临床上用于如冠心病、糖尿病伴发血管病变等的常用药，血栓前状态为它们共同的病理生理机制之一 [9] 。本研究观察丹参及黄芪对LPS刺激HPMC表达PCA影响的结果，中药补气和(或)活血对HPMC表达PCA有抑制作用，但其作用机制尚不清楚，有待进一步研究。临床上对于血栓性疾病以及有血栓形成倾向的如心脑血管、糖尿病等常须使用抗凝药物，但它们有出血倾向及胃肠道等副作用，而使用中成药及中药制剂已成为这些疾病的不可缺少的疗法。本试验观察的病例对于临床有一定的指导作用，但由于样本量较小，有待于进一步研究这些疾病的促凝血活性对其发病及发展的作用。
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参考文献
1 Meisel SR，Xu XP，Edgington TS，et al.Differentiation of adherent huˉmanmonocytes into macrophages markedly enhances tissue factor protein expression and procoagulant activity.Atherosclerosis，2002，161(1):35-43.
2 Eggesbq JB，Kjermano I，Qvstebq K，et al.LPS induced procoagulant acˉ tivity and plasminogen activator activity in mononuclear cells from perˉsons with high or low levels of HDL lipoprotein.Thromb Res，1995，77(5):441-452.
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3 魏文宁，宋善俊，刘仲萍，等.二步法血浆凝血酶X的测定.中华血液学杂志，1991，14(6):351-353.
4 Qyum A.Isolation of human blood monocytes with nycodenz:a nem non-inoic iodinated gradient medium.Scand J Immunol，1993，17:429-436.
5 McGilvray ID，Tsai V，Marshall JC.Monocyte adhesion and transmigraˉtion induce tissue factor expression:role of the mitogen-activated proˉtein kinases.Shock，2002，18(1):51-57.
6 Wilcox JN，Smith KM，Schwartz SM.Localization of tissue factor in the normal vessel wall and in the atherosclerotic plaque.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86(8):2839-2843.
, http://www.100md.com
7 沈全陆，张彩英，黄桂秋，等.丹参对内毒素影响内皮细胞凝血和纤溶功能的作用.中华血液学杂志，1993，14(10):540-543.
8 毛申生，张彩英，黄桂秋，等.丹参对血管平滑肌抑制内皮细胞分泌的纤溶酶原激活物活性的影响.中国病理生理杂志，1991，7(2):134-136.
9 Bjerre A，Brusletto B，Rosenqvist E，et al.Cellular activating properties and morphology of membrane-bound and purified meningococcal lipopolysaccharide.J Endotoxin Res，2000，6(6):437-445.
作者单位:225001江苏扬州江苏省苏北人民医院血液科
复旦大学附属华山医院
(收稿日期:2003-12-03)
(编辑子 萱), 百拇医药