丙型肝炎病毒DNA疫苗的研究进展
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)05-0412-05
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是丙型肝炎的病原体，是导致输血后肝炎和急慢性非甲非乙型肝炎的主要致病因子。大约有55%～85%的HCV急性感染发展成慢性感染，而慢性感染是导致慢性肝炎，肝硬化，肝细胞癌和末期肝炎死亡的主要原因 [1] 。HCV在20世纪70年代被临床发现，直到20世纪80年代才通过分子克隆技术被确认 [2] 。目前尚无治疗丙肝的特效药物，α干扰素和病毒唑对治疗丙肝有一定效果，但副作用很大。现在也无有效的丙肝疫苗问世。本文将对HCV的感染与免疫及HCV-DNA疫苗的研究进展作简要的综述。
1 流行与传播
HCV感染是世界范围的，约有1.7亿人感染过HCV。在全世界不同人群中总的抗HCV血清阳性率估计约3% [1] 。在针对预防AIDS的血液筛查和其它措施建立前每年美国大约有150，000个新的HCV感染病例出现，现在HCV感染的新病例已经降到每年33，000例，约占所有病毒性肝炎的12% [3] 。而在发展中国家，HCV的感染率一般高于全球3%的平均率，在有些地区甚至高达20%。HCV的传播途径有被污染的血液制品、共用注射器材静脉注射毒品、不洁性行为、重复使用未严格消毒的医疗器材等 [1] 。
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2 基因的多样性
HCV基因组为线状单股正链RNA，全长约9400nt，由5′-非编码区(5′NCR329-342nt)、编码区(ORF)和3′-非编码区(3′NCR25-55nt)组成，ORF几乎跨越整个HCV基因组，编码约3010个氨基酸，组成病毒多蛋白前体。根据病毒基因组所编码的蛋白结构和功能不同，将ORF分成结构基因(Structural gene)和非结构基因(Nonstructural gene)，结构基因包括核心区(Core region)和包膜区(Envelope gene)，非结构基因包括NS1、NS2、NS3、NS4、NS5基因 [4] 。在复制过程中，由于依赖RNA的RNA聚合酶链反应的校对功能不完善，易出现基因突变，以及宿主免疫压力的存在，在宿主体内HCV会聚集成1个称之为准种(quasispecies) [5] 的复杂病毒群体。因此HCV基因组表现出高度的遗传多样性。这也是在宿主免疫系统的压力和长期选择下的进化结果。HCV基因组中5′NCR、C、NS3、和NS5基因变异较小，其中核心区的变异率为19%，5′NCR区的变异率为0.7% [6] 。E区为HCV基因组中变异最大的部位，不同的分离株中核苷酸差异率可达30%。E1第215-255aa区段有1个中度变异区，在E2蛋白中有2个高度变异区(hypervariable region，HVR)，分别位于第390-410aa的HVR1及第474-480aa的HVR2 [7] 。深入的系统进化分析将HCV分成6个主要的基因型(1-6)，其中至少包含70个不同的亚型。HCV基因型1，2，3型是地球上分布最广的，1型主要在北美和欧洲(亚型1a)以及亚洲(亚型1b)。2，3型在北美、欧洲和亚洲的流行也很普遍，而4型主要分布在中非和北非。5型主要在南非得到确证。到目前为止6型主要在越南和香港出现 [8] 。
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3 现有的治疗方法和治愈率
目前对HCV的治疗主要使用经典的抗病毒药物如α干扰素和病毒唑。最近的数据显示α干扰素和病毒唑的联合使用的效果是高度依赖于感染的基因型的。对2，3基因型的长期有效性可以达到80%而对1a/b或者4型则只有40%～45% [9] 。因此这些低效的病毒基因型可能提供第一代治疗性疫苗的免疫预防对象。
4 与免疫相关的病毒感染的消退与持续感染
HCV感染后，少数病人只在急性期显示症状，最终病毒被清除。早期有力的多T细胞反应并且持续作用于宿主体内是清除这些病毒的原因。特异性的CD4 + 和CD8 + T细胞反应可识别几乎所有的HCV抗原表位 [10～12] 。在经过治疗感染消退后也发现了加强的T细胞介导的免疫反应。但是这些反应看上去和那些没有治疗也清除了病毒的病人中观察到的相比，针对的是不同的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)表位 [13] 。除了1个定位于非结构蛋白3(nonstructural protein3，NS3)的特异的辅助性T细胞表位和1个显性的CTL表位之外，目前还没有发现特定的抗原或表位与自然的或者治疗性的感染消退相关 [13～14] 。现在正在继续努力以确定这些表位，它们有可能成为疫苗的重要组成部分。
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现在已经知道了在慢性感染病人的肝脏或者血液中可以检测到病毒特异性的CTL，但是它们的频率比那些已经消退了的急性感染中发现的要低的多 [15] 。在感染后启动的强有力的CTL反应可以用四聚物分析检测到，尽管它们半衰期很短 [16] 。对于这些简短反应机制和低效性现在也不是很清楚。在大猩猩和人体内的病毒突变已有报道。最近的一项研究显示:早期的逃避了免疫检测的CTL表位的突变似乎对HCV的持续感染是一个相当重要的决定因素[17] 。另外有报道描述了树突状细胞(dendritic cells，DCs)中HCV序列的存在以及这些DC细胞异源刺激功能的变化 [18～19] 。DC细胞被HCV感染以及随后发生的细胞功能异常在特异性的免疫反应中起着关键的作用，可能成为发展治疗性疫苗中一个要主要考虑的因素。
尽管证明在控制HCV感染方面细胞免疫是一个主要因素的证据越来越多，但是对中和抗体的存在及效用目前仍知之甚少。已有事实表明中和抗体在体外是可以中和HCV的 [20] ，并且大猩猩的疫苗/刺激研究提示，血清抗体可能在保护机体免受感染或者减低感染中非常重要 [2] 。然而最近的2项主要研究(一个在大猩猩，一个在人体)似乎把抗体在感染消退中的关键作用排除在外(或者根本没有作用)。理由是对感染的控制可能只和HCV特异性的细胞免疫反应相关 [21～22] 。
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5 DNA疫苗的研究进展
5.1 DNA疫苗 因为构建简单，大量的针对几乎所有病毒抗原的DNA疫苗被制作出来了。4种主要类型的核心(core)-DNA疫苗已经试验过了。它们表达:(1)经典或者特异的启动子的下游核心;(2)与HBV分泌型蛋白不同区域融合的全长核心或者亚基因组结构域;(3)与可以进入特异的亚细胞组分的蛋白融合的核心;(4)存在于多种联合表达的细胞因子的核心。基本上这些方法都能够激发特异的CD4 + 和CD8 + 介导的免疫反应，尽管因为蛋白的十分基本的非分泌特性，有些抗体反应很难被观察到。Geissler [23] 等人将GM-CSF，白介素2、4表达质粒和核心DNA联合注射时，能够导至抗核心的抗体产生率提高2～3倍。最容易检测到的免疫反应是特异性的抗核心的CTL。Tokushige [24] 等人在Balb/c小鼠体内免疫了1个野生型来源的构建体，然后小鼠在受到肿瘤攻击时显示了免疫保护作用。通过使用融合泛素基因及融合信号序列和鼠源的溶酶体关联膜蛋白的穿膜结构域，表达核心基因的DNA疫苗以优化核心特异性T细胞反应的努力最近失败了 [25] 。而在乳头瘤病毒HPV-16及HIV模型中使用相似的策略却取得了成功 [26] 。失败的原因不清楚，而且在用NS3蛋白的试验也失败了 [27] 。第一代编码E2的DNA疫苗已经成功地演示了对抗E2抗体及T细胞反应的诱导作用。此类质粒表达融合于HBV表面抗原的野生型E2序列及非分泌型结构域。HBV表面抗原使得对E2上具有免疫原性的结构域作图成为可能 [28～29] 。在随后的试验中，通过将E2直接表达在细胞表面及与1个表达GM-CSF的质粒联合注射的方式尝试疫苗诱导的抗E2的反应。1个C末端截短的E2与血小板来源的生长因子受体融合，以使它能在细胞表面表达，然后用来免疫小鼠和猕猴。与那些只免疫了单一的E2表达质粒的动物相比，融合质粒免疫的动物产生了较早的强度更高的抗E2抗体反应，但是总的滴度还是很低 [30] 。Lee [31] 等人用1个双顺反子质粒联合表达C端截短的E2(或E1)与GM-CSF，也尝试了使用1个表达GM-CSF包膜融合蛋白的质粒。联合表达E2及GM-CSF的质粒相对于将GM-CSF及包膜蛋白分别构建到不同的质粒能诱导出更强的免疫反应。在被免疫动物体内观察到的最低的反应是使用表达GM-CSF包膜融合蛋白的质粒诱导的。
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虽然DNA疫苗的效果鼓舞人心，但是它们仅仅只能部分令人满意。因为不断有证据提示HCV糖蛋白E1与E2可以相互作用形成1个复合体，并且它们需要能够正确折叠。Fournilier [32] 等人最近做了这方面的研究。表达各种形式的E1或者E2的单顺反子或者双顺反子质粒已经构建并在小鼠中进行了试验。它们有组成非共价复合体的能力或没有这个能力。总体上数据显示仅仅当1个严重截短的E2被表达时，才能发现特异性的抗体。所有被设计成产生活性的E1和E2的质粒都不能诱导出可检测到的抗体(这与被表达的抗原的分泌水平无关)。最后在这个研究中发现没有能被检测到的(或十分有限的)抗E1抗体。这个事实与使用何种质粒无关。因此可以得出2个结论:(1)用 DNA疫苗很难产生有免疫原性的E1E2复合体，(2)E1是十分弱的免疫原。多糖可以通过不同方式影响蛋白的免疫原性:能在结构上保持合适的抗原构象，屏蔽潜在的中和表位或者改变蛋白对蛋白水解酶降解的敏感性。Fournilier [33] 等人研究了去除1个确定了的与N端连接的寡糖链是否能影响E1诱导体液免疫及细胞免疫的能力。在4个与N端连接的糖基化位点被分别突变或者联合突变的编码E1蛋白突变体的8个质粒被用来试验。在小鼠中的试验显示在第4个糖基化位点(N4)产生的突变能够在抗体产生率与抗体滴度方面加强抗E1的体液免疫。有趣的是由N4突变体诱导的抗体能够十分有效的识别HCV病毒样颗粒，这提示它们可能更合适中和天然病毒颗粒。这些结果提示与N端连接的糖基化作用可以限制针对HCV E1蛋白的抗体反应并揭示了1个有加强免疫原性的潜在候选疫苗。
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近来有更多的试验比较了单独表达的HCV核心或者全部结构域(C-E1-E2)的DNA疫苗在野生型小鼠以及HCV转基因小鼠中的免疫反应。结果显示当蛋白被表达成多蛋白形式时，就会出现一系列的CTL反应。观察到的最多的反应是针对E2的，其次是核心及E1 [34] 。接种的HCV转基因鼠产生了抗HCV抗体及针对核心的特异CTL。这些小鼠在没有DNA免疫的情况下就对针对E2的CTL水平耐受。表达NS3、NS4及NS5非结构蛋白的DNA疫苗被证明在小鼠及Buffalo大鼠体内有免疫原性。在小鼠中这些非结构蛋白产生强的细胞免疫反应，特异性的抗体反应及Th1表现型CD4 + T细胞反应。特异的CD8 + CTL反应显示出是针对NS3及NS5的 [35] 。在Buffalo大鼠中当使用表达非结构蛋白及GM-CSF的双顺反子质粒时，针对所有3个非结构蛋白的免疫反应都有提高 [36] 。许多研究表明针对HCV核心的DNA免疫只能产生微弱的体液免疫反应。因此，和1个经典的佐剂联合免疫可能会加强这些潜在的重要的免疫反应。因为CpG模体(CpG motif)已经被显示出可以刺激免疫系统产生诸如B细胞及T细胞免疫反应，Encke [37] 等人检查了寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides，ODN)形式或者大肠杆菌DNA形式的未甲基化的CpG模体是否能够作为1种DNA疫苗的佐剂。研究表明在针对HCV核心的DNA免疫之后CpG模体加强了体内的抗体水平。虽然在体外CpG模体有加强T细胞反应的能力，但是在用HCV质粒DNA及CpG模体免疫小鼠后，并没有观察到体内的T细胞反应有增强。这个试验的结果提示和CpG-ODN联合免疫可以加强体液免疫，但是并没有显示出作为佐剂诱导出针对HCV核心的细胞免疫反应的潜在作用。
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5.2 活载体疫苗 重组活载体疫苗的目的是使有诱导CD8 + 介导的免疫反应潜力的疫苗抗原在细胞内合成。对各种微生物原的生物学及基因组学构成的知识的积累以及在生物技术领域的知识的增长，使得我们可以设计出用来呈递疫苗抗原以允许它们在被免疫的宿主体内细胞中内源表达的重组载体。在被广泛使用的病毒载体中有痘病毒载体(来源于高度减毒的牛痘病毒)，缺陷型腺病毒载体，甲病毒来源的载体和疱疹病毒载体;减毒的细菌载体例如牛型肺结核杆菌，卡介苗，鼠伤寒沙门菌等都取得了令人鼓舞的效果。Bruna-Romero [38] 等人使用1个包含核心基因和在原腺病毒E1基因区域取而代之的HCV E1基因的重组腺病毒免疫Balb/c小鼠。可以诱导产生至少针对6个不同的表位的强烈的长时间(大约100天)的特异性CTL反应。CTL反应是H-2d限制性的，由经典的CD4 - CD8 + 表现型T细胞介导。在1个转化了NS3的鼠伤寒沙门菌载体的试验取得了初步的有希望的结果。用鼠伤寒沙门菌携带的DNA质粒进行口服免疫被证实对诱导产生细胞介导的免疫反应有效。这可能是因为质粒DNA被送入了在肠道淋巴组织中大量的已存在抗原的细胞。在Wedemeyer [39] 等人的研究中，他们将滴度递增(10 2 ～10 8 集落形成单位)的重组鼠伤寒沙门菌通过口腔注入免疫HLA-A2转基因小鼠。在1次单独的注射后可以检测到特异性的CTL。这些反应是长期的(至少10个月)并且好像以不同的效率针对3个在HCV感染病人中发现的HLA-A2表位。另外被免疫小鼠能够对由表达NS3-NS4b的重组痘病毒引起的攻击产生保护。这种疫苗值得在更高等的动物模型中做进一步的研究。Uno-Furuta [40] 等人评价了卡介苗这个经典的疫苗作为重组疫苗载体以诱导出HCV特异性CTL的能力。卡介苗被设计成表达HCV非结构蛋白(NS5)的CTL表位，这个表位与分枝杆菌的α抗原形成1个嵌合蛋白。用这个重组的卡介苗免疫小鼠后可以诱导出MHCⅠ限制的CD8 + 的HCV-NS5特异性的CTL。与对照小鼠相比被免疫的小鼠在表达HCV-NS5a基因的重组牛痘病毒攻击后体内的牛痘病毒滴度有明显的下降。这些发现为卡介苗作为1个疫苗载体的可能性以及它作为1个能够诱导HCV特异性免疫的载体的继续研究提供了支持。
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5.3 联合疫苗方法 所谓基础加强(prime-boost)疫苗策略目标是通过连续注射表达相同免疫原的不同疫苗来使机体产生可能的免疫反应。这些策略的基本点是性质不同的疫苗(例如基于DNA的疫苗与1个基于重组蛋白的疫苗)的差异可以对它们起始或加强抗原特异性的反应的能力产生差异。在HCV-DNA疫苗的发展中，最近只有一些这样的策略被报道。
5.3.1 小鼠研究 在最初的研究中，Pancholi [41] 等人用1个多顺反子DNA疫苗(表达1个核心-NS3多蛋白)免疫H-2d与H-2b小鼠2次后用1个重组的金丝雀痘苗加强1次。与只使用DNA疫苗的情况相比，抗体的产生增加了3倍。在针对E1、E2、NS2及NS3的观察中都发现了有实质性的细胞免疫的产生，特别是γ干扰素的产生。这些反应的保护性作用现在正在大猩猩体内进行评价。Himoudi [42] 等人发现，使用DNA疫苗初次免疫HLA-A2.1转基因鼠随后用重组腺病毒加强免疫可以对HCV特异性的CTL及产生γ干扰素的T细胞起到明显的增强效果。
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5.3.2 灵长类研究 最近有报道描述了针对结构蛋白及非结构蛋白的多成分组成的基础加强免疫策略。2只大猩猩最初用表达核心、E1、E2及NS3抗原的质粒免疫，随后注射相关的重组蛋白(来源于1b型)加强。分泌E1-、E2-及NS3特异性γ干扰素和白介素2、4的细胞群及特异性抗体的加强免疫反应在使用这些疫苗后都被发现，虽然水平不同。1只被免疫的大猩猩产生了上述所有反应，但是强 度低一些，令人吃惊的是1个γ干扰素的产生高峰是在病毒攻击前2周发现的。这只大猩猩通过用灵敏PCR检测发现清除了病毒血症。在病毒攻击8周后，另外1只和未免疫的对照相比已经控制了感染。虽然这个试验只使用了2只大猩猩，但是初步的结果还是鼓舞人的，并且指出了在控制病毒血症方面NS3特异性反应可能起关键作用 [43] 。现在还需要进一步试验来确定除了NS3外其它几个抗原在控制病症中起的作用。
6 展望
尽管目前取得了一些进展，但是HCV疫苗的发展还是处于早期阶段。虽然对于基于不同载体的疫苗或者DNA疫苗能够带来保护性作用的相关文章很丰富，但是这些关于HCV的报道清楚表明只有一个系统性的对各个已知载体的仔细检查才能分辨清楚是否抗原-载体形式真的能够发挥最有潜力免疫原性作用。正如本文提到过的HCV治疗性或预防性疫苗可能部分组分不同，这是因为它们针对的人群不同，而且部分因为一个有效的预防性疫苗可能不仅需要能够诱导出广泛的长时间的特异性免疫反应，它还需要能够帮助免疫系统的细胞记忆一些基本功能，这些基本功能可能在慢性感染中发生变化。这些难题有待解决，认真选择合适的佐剂或者使用细胞因子、化学因子及协同刺激分子可能也很重要。
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最后我们应该考虑对于一个HCV疫苗究竟什么水平的有效性能够被接受。事实上现在使用的所有疫苗都是设计成可以防止感染或者至少防止急性疾病的。急性HCV感染通常是轻微的不显著的。HCV带来的问题主要是持续性感染，并常导致临床上显著的慢性肝脏疾病。另外慢性感染患者通常又是HCV的主要传播者。如果一个预防性疫苗不能完全防止HCV感染，那么一个能够限制慢性感染发展的疫苗对于医疗及大众健康都是重要的和有效的。同理，一个治疗性疫苗应该能够在清除慢性感染后本身的相关疫苗滴度也要降的很低。这样一个治疗性疫苗应该在抗病毒治疗方法还不是很实用的情况下在全球范围对控制HCV产生积极作用。一个能够提高免疫反应并减少病毒拷贝的治疗性疫苗应该可以对控制慢性肝病的发生起作用。这样的反应结合药物及干扰素的使用也可以成为一个成功的抗病毒方法的一部分。
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基金项目:云南省自然科学基金应用基础类课题资助(项目号:2003C0076M)
作者单位:650118昆明中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所
(收稿日期:2004-04-08)
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丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是丙型肝炎的病原体，是导致输血后肝炎和急慢性非甲非乙型肝炎的主要致病因子。大约有55%～85%的HCV急性感染发展成慢性感染，而慢性感染是导致慢性肝炎，肝硬化，肝细胞癌和末期肝炎死亡的主要原因 [1] 。HCV在20世纪70年代被临床发现，直到20世纪80年代才通过分子克隆技术被确认 [2] 。目前尚无治疗丙肝的特效药物，α干扰素和病毒唑对治疗丙肝有一定效果，但副作用很大。现在也无有效的丙肝疫苗问世。本文将对HCV的感染与免疫及HCV-DNA疫苗的研究进展作简要的综述。
1 流行与传播
HCV感染是世界范围的，约有1.7亿人感染过HCV。在全世界不同人群中总的抗HCV血清阳性率估计约3% [1] 。在针对预防AIDS的血液筛查和其它措施建立前每年美国大约有150，000个新的HCV感染病例出现，现在HCV感染的新病例已经降到每年33，000例，约占所有病毒性肝炎的12% [3] 。而在发展中国家，HCV的感染率一般高于全球3%的平均率，在有些地区甚至高达20%。HCV的传播途径有被污染的血液制品、共用注射器材静脉注射毒品、不洁性行为、重复使用未严格消毒的医疗器材等 [1] 。
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2 基因的多样性
HCV基因组为线状单股正链RNA，全长约9400nt，由5′-非编码区(5′NCR329-342nt)、编码区(ORF)和3′-非编码区(3′NCR25-55nt)组成，ORF几乎跨越整个HCV基因组，编码约3010个氨基酸，组成病毒多蛋白前体。根据病毒基因组所编码的蛋白结构和功能不同，将ORF分成结构基因(Structural gene)和非结构基因(Nonstructural gene)，结构基因包括核心区(Core region)和包膜区(Envelope gene)，非结构基因包括NS1、NS2、NS3、NS4、NS5基因 [4] 。在复制过程中，由于依赖RNA的RNA聚合酶链反应的校对功能不完善，易出现基因突变，以及宿主免疫压力的存在，在宿主体内HCV会聚集成1个称之为准种(quasispecies) [5] 的复杂病毒群体。因此HCV基因组表现出高度的遗传多样性。这也是在宿主免疫系统的压力和长期选择下的进化结果。HCV基因组中5′NCR、C、NS3、和NS5基因变异较小，其中核心区的变异率为19%，5′NCR区的变异率为0.7% [6] 。E区为HCV基因组中变异最大的部位，不同的分离株中核苷酸差异率可达30%。E1第215-255aa区段有1个中度变异区，在E2蛋白中有2个高度变异区(hypervariable region，HVR)，分别位于第390-410aa的HVR1及第474-480aa的HVR2 [7] 。深入的系统进化分析将HCV分成6个主要的基因型(1-6)，其中至少包含70个不同的亚型。HCV基因型1，2，3型是地球上分布最广的，1型主要在北美和欧洲(亚型1a)以及亚洲(亚型1b)。2，3型在北美、欧洲和亚洲的流行也很普遍，而4型主要分布在中非和北非。5型主要在南非得到确证。到目前为止6型主要在越南和香港出现 [8] 。
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3 现有的治疗方法和治愈率
目前对HCV的治疗主要使用经典的抗病毒药物如α干扰素和病毒唑。最近的数据显示α干扰素和病毒唑的联合使用的效果是高度依赖于感染的基因型的。对2，3基因型的长期有效性可以达到80%而对1a/b或者4型则只有40%～45% [9] 。因此这些低效的病毒基因型可能提供第一代治疗性疫苗的免疫预防对象。
4 与免疫相关的病毒感染的消退与持续感染
HCV感染后，少数病人只在急性期显示症状，最终病毒被清除。早期有力的多T细胞反应并且持续作用于宿主体内是清除这些病毒的原因。特异性的CD4 + 和CD8 + T细胞反应可识别几乎所有的HCV抗原表位 [10～12] 。在经过治疗感染消退后也发现了加强的T细胞介导的免疫反应。但是这些反应看上去和那些没有治疗也清除了病毒的病人中观察到的相比，针对的是不同的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)表位 [13] 。除了1个定位于非结构蛋白3(nonstructural protein3，NS3)的特异的辅助性T细胞表位和1个显性的CTL表位之外，目前还没有发现特定的抗原或表位与自然的或者治疗性的感染消退相关 [13～14] 。现在正在继续努力以确定这些表位，它们有可能成为疫苗的重要组成部分。
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现在已经知道了在慢性感染病人的肝脏或者血液中可以检测到病毒特异性的CTL，但是它们的频率比那些已经消退了的急性感染中发现的要低的多 [15] 。在感染后启动的强有力的CTL反应可以用四聚物分析检测到，尽管它们半衰期很短 [16] 。对于这些简短反应机制和低效性现在也不是很清楚。在大猩猩和人体内的病毒突变已有报道。最近的一项研究显示:早期的逃避了免疫检测的CTL表位的突变似乎对HCV的持续感染是一个相当重要的决定因素[17] 。另外有报道描述了树突状细胞(dendritic cells，DCs)中HCV序列的存在以及这些DC细胞异源刺激功能的变化 [18～19] 。DC细胞被HCV感染以及随后发生的细胞功能异常在特异性的免疫反应中起着关键的作用，可能成为发展治疗性疫苗中一个要主要考虑的因素。
尽管证明在控制HCV感染方面细胞免疫是一个主要因素的证据越来越多，但是对中和抗体的存在及效用目前仍知之甚少。已有事实表明中和抗体在体外是可以中和HCV的 [20] ，并且大猩猩的疫苗/刺激研究提示，血清抗体可能在保护机体免受感染或者减低感染中非常重要 [2] 。然而最近的2项主要研究(一个在大猩猩，一个在人体)似乎把抗体在感染消退中的关键作用排除在外(或者根本没有作用)。理由是对感染的控制可能只和HCV特异性的细胞免疫反应相关 [21～22] 。
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5 DNA疫苗的研究进展
5.1 DNA疫苗 因为构建简单，大量的针对几乎所有病毒抗原的DNA疫苗被制作出来了。4种主要类型的核心(core)-DNA疫苗已经试验过了。它们表达:(1)经典或者特异的启动子的下游核心;(2)与HBV分泌型蛋白不同区域融合的全长核心或者亚基因组结构域;(3)与可以进入特异的亚细胞组分的蛋白融合的核心;(4)存在于多种联合表达的细胞因子的核心。基本上这些方法都能够激发特异的CD4 + 和CD8 + 介导的免疫反应，尽管因为蛋白的十分基本的非分泌特性，有些抗体反应很难被观察到。Geissler [23] 等人将GM-CSF，白介素2、4表达质粒和核心DNA联合注射时，能够导至抗核心的抗体产生率提高2～3倍。最容易检测到的免疫反应是特异性的抗核心的CTL。Tokushige [24] 等人在Balb/c小鼠体内免疫了1个野生型来源的构建体，然后小鼠在受到肿瘤攻击时显示了免疫保护作用。通过使用融合泛素基因及融合信号序列和鼠源的溶酶体关联膜蛋白的穿膜结构域，表达核心基因的DNA疫苗以优化核心特异性T细胞反应的努力最近失败了 [25] 。而在乳头瘤病毒HPV-16及HIV模型中使用相似的策略却取得了成功 [26] 。失败的原因不清楚，而且在用NS3蛋白的试验也失败了 [27] 。第一代编码E2的DNA疫苗已经成功地演示了对抗E2抗体及T细胞反应的诱导作用。此类质粒表达融合于HBV表面抗原的野生型E2序列及非分泌型结构域。HBV表面抗原使得对E2上具有免疫原性的结构域作图成为可能 [28～29] 。在随后的试验中，通过将E2直接表达在细胞表面及与1个表达GM-CSF的质粒联合注射的方式尝试疫苗诱导的抗E2的反应。1个C末端截短的E2与血小板来源的生长因子受体融合，以使它能在细胞表面表达，然后用来免疫小鼠和猕猴。与那些只免疫了单一的E2表达质粒的动物相比，融合质粒免疫的动物产生了较早的强度更高的抗E2抗体反应，但是总的滴度还是很低 [30] 。Lee [31] 等人用1个双顺反子质粒联合表达C端截短的E2(或E1)与GM-CSF，也尝试了使用1个表达GM-CSF包膜融合蛋白的质粒。联合表达E2及GM-CSF的质粒相对于将GM-CSF及包膜蛋白分别构建到不同的质粒能诱导出更强的免疫反应。在被免疫动物体内观察到的最低的反应是使用表达GM-CSF包膜融合蛋白的质粒诱导的。
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虽然DNA疫苗的效果鼓舞人心，但是它们仅仅只能部分令人满意。因为不断有证据提示HCV糖蛋白E1与E2可以相互作用形成1个复合体，并且它们需要能够正确折叠。Fournilier [32] 等人最近做了这方面的研究。表达各种形式的E1或者E2的单顺反子或者双顺反子质粒已经构建并在小鼠中进行了试验。它们有组成非共价复合体的能力或没有这个能力。总体上数据显示仅仅当1个严重截短的E2被表达时，才能发现特异性的抗体。所有被设计成产生活性的E1和E2的质粒都不能诱导出可检测到的抗体(这与被表达的抗原的分泌水平无关)。最后在这个研究中发现没有能被检测到的(或十分有限的)抗E1抗体。这个事实与使用何种质粒无关。因此可以得出2个结论:(1)用 DNA疫苗很难产生有免疫原性的E1E2复合体，(2)E1是十分弱的免疫原。多糖可以通过不同方式影响蛋白的免疫原性:能在结构上保持合适的抗原构象，屏蔽潜在的中和表位或者改变蛋白对蛋白水解酶降解的敏感性。Fournilier [33] 等人研究了去除1个确定了的与N端连接的寡糖链是否能影响E1诱导体液免疫及细胞免疫的能力。在4个与N端连接的糖基化位点被分别突变或者联合突变的编码E1蛋白突变体的8个质粒被用来试验。在小鼠中的试验显示在第4个糖基化位点(N4)产生的突变能够在抗体产生率与抗体滴度方面加强抗E1的体液免疫。有趣的是由N4突变体诱导的抗体能够十分有效的识别HCV病毒样颗粒，这提示它们可能更合适中和天然病毒颗粒。这些结果提示与N端连接的糖基化作用可以限制针对HCV E1蛋白的抗体反应并揭示了1个有加强免疫原性的潜在候选疫苗。
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近来有更多的试验比较了单独表达的HCV核心或者全部结构域(C-E1-E2)的DNA疫苗在野生型小鼠以及HCV转基因小鼠中的免疫反应。结果显示当蛋白被表达成多蛋白形式时，就会出现一系列的CTL反应。观察到的最多的反应是针对E2的，其次是核心及E1 [34] 。接种的HCV转基因鼠产生了抗HCV抗体及针对核心的特异CTL。这些小鼠在没有DNA免疫的情况下就对针对E2的CTL水平耐受。表达NS3、NS4及NS5非结构蛋白的DNA疫苗被证明在小鼠及Buffalo大鼠体内有免疫原性。在小鼠中这些非结构蛋白产生强的细胞免疫反应，特异性的抗体反应及Th1表现型CD4 + T细胞反应。特异的CD8 + CTL反应显示出是针对NS3及NS5的 [35] 。在Buffalo大鼠中当使用表达非结构蛋白及GM-CSF的双顺反子质粒时，针对所有3个非结构蛋白的免疫反应都有提高 [36] 。许多研究表明针对HCV核心的DNA免疫只能产生微弱的体液免疫反应。因此，和1个经典的佐剂联合免疫可能会加强这些潜在的重要的免疫反应。因为CpG模体(CpG motif)已经被显示出可以刺激免疫系统产生诸如B细胞及T细胞免疫反应，Encke [37] 等人检查了寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides，ODN)形式或者大肠杆菌DNA形式的未甲基化的CpG模体是否能够作为1种DNA疫苗的佐剂。研究表明在针对HCV核心的DNA免疫之后CpG模体加强了体内的抗体水平。虽然在体外CpG模体有加强T细胞反应的能力，但是在用HCV质粒DNA及CpG模体免疫小鼠后，并没有观察到体内的T细胞反应有增强。这个试验的结果提示和CpG-ODN联合免疫可以加强体液免疫，但是并没有显示出作为佐剂诱导出针对HCV核心的细胞免疫反应的潜在作用。
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5.2 活载体疫苗 重组活载体疫苗的目的是使有诱导CD8 + 介导的免疫反应潜力的疫苗抗原在细胞内合成。对各种微生物原的生物学及基因组学构成的知识的积累以及在生物技术领域的知识的增长，使得我们可以设计出用来呈递疫苗抗原以允许它们在被免疫的宿主体内细胞中内源表达的重组载体。在被广泛使用的病毒载体中有痘病毒载体(来源于高度减毒的牛痘病毒)，缺陷型腺病毒载体，甲病毒来源的载体和疱疹病毒载体;减毒的细菌载体例如牛型肺结核杆菌，卡介苗，鼠伤寒沙门菌等都取得了令人鼓舞的效果。Bruna-Romero [38] 等人使用1个包含核心基因和在原腺病毒E1基因区域取而代之的HCV E1基因的重组腺病毒免疫Balb/c小鼠。可以诱导产生至少针对6个不同的表位的强烈的长时间(大约100天)的特异性CTL反应。CTL反应是H-2d限制性的，由经典的CD4 - CD8 + 表现型T细胞介导。在1个转化了NS3的鼠伤寒沙门菌载体的试验取得了初步的有希望的结果。用鼠伤寒沙门菌携带的DNA质粒进行口服免疫被证实对诱导产生细胞介导的免疫反应有效。这可能是因为质粒DNA被送入了在肠道淋巴组织中大量的已存在抗原的细胞。在Wedemeyer [39] 等人的研究中，他们将滴度递增(10 2 ～10 8 集落形成单位)的重组鼠伤寒沙门菌通过口腔注入免疫HLA-A2转基因小鼠。在1次单独的注射后可以检测到特异性的CTL。这些反应是长期的(至少10个月)并且好像以不同的效率针对3个在HCV感染病人中发现的HLA-A2表位。另外被免疫小鼠能够对由表达NS3-NS4b的重组痘病毒引起的攻击产生保护。这种疫苗值得在更高等的动物模型中做进一步的研究。Uno-Furuta [40] 等人评价了卡介苗这个经典的疫苗作为重组疫苗载体以诱导出HCV特异性CTL的能力。卡介苗被设计成表达HCV非结构蛋白(NS5)的CTL表位，这个表位与分枝杆菌的α抗原形成1个嵌合蛋白。用这个重组的卡介苗免疫小鼠后可以诱导出MHCⅠ限制的CD8 + 的HCV-NS5特异性的CTL。与对照小鼠相比被免疫的小鼠在表达HCV-NS5a基因的重组牛痘病毒攻击后体内的牛痘病毒滴度有明显的下降。这些发现为卡介苗作为1个疫苗载体的可能性以及它作为1个能够诱导HCV特异性免疫的载体的继续研究提供了支持。
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5.3 联合疫苗方法 所谓基础加强(prime-boost)疫苗策略目标是通过连续注射表达相同免疫原的不同疫苗来使机体产生可能的免疫反应。这些策略的基本点是性质不同的疫苗(例如基于DNA的疫苗与1个基于重组蛋白的疫苗)的差异可以对它们起始或加强抗原特异性的反应的能力产生差异。在HCV-DNA疫苗的发展中，最近只有一些这样的策略被报道。
5.3.1 小鼠研究 在最初的研究中，Pancholi [41] 等人用1个多顺反子DNA疫苗(表达1个核心-NS3多蛋白)免疫H-2d与H-2b小鼠2次后用1个重组的金丝雀痘苗加强1次。与只使用DNA疫苗的情况相比，抗体的产生增加了3倍。在针对E1、E2、NS2及NS3的观察中都发现了有实质性的细胞免疫的产生，特别是γ干扰素的产生。这些反应的保护性作用现在正在大猩猩体内进行评价。Himoudi [42] 等人发现，使用DNA疫苗初次免疫HLA-A2.1转基因鼠随后用重组腺病毒加强免疫可以对HCV特异性的CTL及产生γ干扰素的T细胞起到明显的增强效果。
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5.3.2 灵长类研究 最近有报道描述了针对结构蛋白及非结构蛋白的多成分组成的基础加强免疫策略。2只大猩猩最初用表达核心、E1、E2及NS3抗原的质粒免疫，随后注射相关的重组蛋白(来源于1b型)加强。分泌E1-、E2-及NS3特异性γ干扰素和白介素2、4的细胞群及特异性抗体的加强免疫反应在使用这些疫苗后都被发现，虽然水平不同。1只被免疫的大猩猩产生了上述所有反应，但是强 度低一些，令人吃惊的是1个γ干扰素的产生高峰是在病毒攻击前2周发现的。这只大猩猩通过用灵敏PCR检测发现清除了病毒血症。在病毒攻击8周后，另外1只和未免疫的对照相比已经控制了感染。虽然这个试验只使用了2只大猩猩，但是初步的结果还是鼓舞人的，并且指出了在控制病毒血症方面NS3特异性反应可能起关键作用 [43] 。现在还需要进一步试验来确定除了NS3外其它几个抗原在控制病症中起的作用。
6 展望
尽管目前取得了一些进展，但是HCV疫苗的发展还是处于早期阶段。虽然对于基于不同载体的疫苗或者DNA疫苗能够带来保护性作用的相关文章很丰富，但是这些关于HCV的报道清楚表明只有一个系统性的对各个已知载体的仔细检查才能分辨清楚是否抗原-载体形式真的能够发挥最有潜力免疫原性作用。正如本文提到过的HCV治疗性或预防性疫苗可能部分组分不同，这是因为它们针对的人群不同，而且部分因为一个有效的预防性疫苗可能不仅需要能够诱导出广泛的长时间的特异性免疫反应，它还需要能够帮助免疫系统的细胞记忆一些基本功能，这些基本功能可能在慢性感染中发生变化。这些难题有待解决，认真选择合适的佐剂或者使用细胞因子、化学因子及协同刺激分子可能也很重要。
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最后我们应该考虑对于一个HCV疫苗究竟什么水平的有效性能够被接受。事实上现在使用的所有疫苗都是设计成可以防止感染或者至少防止急性疾病的。急性HCV感染通常是轻微的不显著的。HCV带来的问题主要是持续性感染，并常导致临床上显著的慢性肝脏疾病。另外慢性感染患者通常又是HCV的主要传播者。如果一个预防性疫苗不能完全防止HCV感染，那么一个能够限制慢性感染发展的疫苗对于医疗及大众健康都是重要的和有效的。同理，一个治疗性疫苗应该能够在清除慢性感染后本身的相关疫苗滴度也要降的很低。这样一个治疗性疫苗应该在抗病毒治疗方法还不是很实用的情况下在全球范围对控制HCV产生积极作用。一个能够提高免疫反应并减少病毒拷贝的治疗性疫苗应该可以对控制慢性肝病的发生起作用。这样的反应结合药物及干扰素的使用也可以成为一个成功的抗病毒方法的一部分。
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基金项目:云南省自然科学基金应用基础类课题资助(项目号:2003C0076M)
作者单位:650118昆明中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所
(收稿日期:2004-04-08)
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