重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S的构建与序列分析及其在真核细胞中的初步表达
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【摘要】 目的 针对我国乙肝病毒流行的血清型，采用美国FDA认可的应用于核酸疫苗的表达载体pVAX1，构建了重组真核表达质粒pVAX1-C3d-S 2 S，该质粒含有HBV基因组织的pre S 2 S片段及补体C3d的编码基因;并对其在真核细胞中的表达进行研究。以期预见补体C3d的佐剂作用，加快乙肝核酸疫苗的实用化进程。方法 采用PCR技术分别扩增了小鼠补体C3d基因(897bp)及HBV preS 2 S片段(约900bp)，并将其克隆至真核表达载体pVAX1上，经限制性核酸内切酶EcoRI的酶切分析及DNA测序分析证实。再将其短暂转染至SP2/0细胞，(1)抽提转染后SP2/0细胞的总RNA，再用RT-PCR法扩增其中的preS 2- S片段;(2)裂解SP2/0细胞，用ELISA方法检测HBsAg，以检测真核表达质粒pVAX1-C3d-S 2 S的蛋白表达基础。可进一步用于基因表达和基因治疗的研究。结果 DNA测序证实了所扩增片段分别为小鼠补体C3d基因和乙型肝炎病毒adw型preS 2- S基因。连接至真核表达载体pVAX1上后，DNA测序亦证实了pVAX1-C3d-S 2 S中C3d和S 2 S基因序列的准确性。将其短暂转染至SP2/0细胞后，用ELISA法可检测出S 2 S的表达产物HBˉsAg，PCR扩增法亦检测出转染细胞中存在preS 2 S基因。结论获得了新型分子佐剂小鼠补体C3d基因、乙肝病毒preS 2 S基因及其含有新型分子佐剂补体C3d的乙肝核酸疫苗重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S。试验提示其能够在真核细胞中表达目的基因蛋白S。
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关键词 补体C3d preS 2- S基因 pVAX1 乙肝核酸疫苗
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)05-0394-04
The construction and the sequence analysing of the eukaryotic
expression plasmid pVAX1-C3d-S2S and the researching of it’s expression in the eukaryotic cells
Sun Meiqin，Jin Xiaolan，Jiang Dachun，et al.
Department of Vascular and Heart Diseases of Chengdu Army General Hospital，Chengdu610083.
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【Abstract】 Objective The commplement C3d has a stronger postive role to control the immunologic system.We have utilized the vector of pVAX1admitted by FDA to construct the recombinant plasmid including the compleˉment C3d and hepatitis B preS2S antigen gene(adw2serum type)，in order to enhance the inmmunologic efficiencies of the HBV nucleotic acid vaccine.And detecting it’s transient expression in the eukaryotic cells.Methods Amplifyˉing the segment of complementC3d gene and the preS2-S gene of HBV by PCR;linking the two segment;and then inserting the linked segment of C3d-preS2-S into pVAX1;detecting the new plasmid pVAX1-C3d-S2S by diˉgesting with Eco RI and DNA sequencing.Finaly，exploring it’s transient expression by amplifying the segment S2S from the transfected eukaryotic cells SP2/0and detecting HBsAg by ELISA.Results The DNA sequencing confirmed the segment of the C3d，preS2-S and the whole pVAX1-C3d-S2S.Then we demonstrated HBsAg by ELISA and amplified preS2S gene from the transfected cells-SP2/0.Conclusion We have successfully cloned the gene of the complement C3d and the preS2S of adw2serum type of HBV;and constructed the recombinant plasmid of pVAX1-C3d-S2S.We also indicate that it can be expressed in the eukaryotic cells.
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Key words complement C3d preS 2 S gene pVAX1 HBV nucleotic vaccine
国内外迄今为止的研究结果表明，现有的各种核酸疫苗普遍存在着免疫诱生效力偏低的问题，尚不能达到实用化的目的，这已经成为限制核酸疫苗实用化的“瓶颈” [1，2] 。国内外学者已采用多种不同的方法来增强核酸疫苗的免疫诱生效力，如使用高效表达载体、增加分子佐剂、改变 接种方式等。而分子佐剂的研究近年来发展较快，文献报道，抗原与若干个C3d分子偶联成为融合蛋白，可增强该抗原的免疫原性[3，4] 。因此，补体分子C3d作为一种新型佐剂已引起人们的关注。为此，我们构建了含有补体C3d及preS 2- S抗原编码基因的乙肝核酸疫苗重组质粒，验证补体C3d的佐剂效应，以期建立一种新型且具有较高表达效率并能诱生更强免疫应答的乙肝核酸疫苗，从而加快乙肝核酸疫苗的实用化进程。
, http://www.100md.com 1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 仪器及试剂 BALB/C小鼠均来自四川大学华西医院实验动物中心;PCR仪为Hangzhou Tarotoc Thermal cycter;PCR配套试剂和DNA ligation Kits购自日本TaRaKa公司;Total RNA Kit和pGEM T easy Vector试剂盒购自美国Promega公司;限制性核酸内切酶EcoRI、KpnI、NotI和T4连接酶、AMV逆转录酶及DNA回收试剂盒购自美国Omega公司;Plasmid Mini Prep Kit购自德国Qiagen公司;pVAX1载体由唐红博士惠赠;JM109由地奥集团惠赠;小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由高小平研究员惠赠;HBsAg检测试剂盒购自华美生物工程公司。
1.1.2 PCR引物 根据Ross提供的C3d序列及Denbank上HBV基因序列，由笔者自行设计，上海基康生物技术有限公司合成，序列为
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P 1 :5′GCG GGT ACC ATG GCC AAG GAG GCA GAT GTG TCA CTC ACA G3′
P 2 :5′ACC AGA ACC ACC ACC ACC AGA ACC ACC ACC ACC ATC CAC TGC TGG GGA GGT GG3′
P 3 :5′GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGTTCT ATG CAG TGG AAC TCC ACA ACA TTC CAC3′
P 4 :5′AGC GGC CGC ATG TAT ACC CAA AGA CAA AAG AA3′黑体部分为添加的限制性核酸内切酶KpnI、NotI特异识别的核苷酸序列。
1.2 实验方法
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1.2.1 目的基因的获取与连接 (1)扩增上游带Linker的C3d基因(C3d-约900bp):引物使用P 1 、P 2 ，PCR反应体系:pGEM-C3d质粒5μl、10×Buffer5μl、dNTP(2.5mmol/L)4μl、P 1 (10μmol/L)1.25μl、P 2 (10μmol/L)1.25μl、Deep vent polyˉmerase(0.5U/μl)2.5μl、H 2 O31μl，共计50μl。反应结束后，取PCR产物5μl，1%琼脂糖凝胶电泳，80V，约20min;在900bp附近观察到一清晰条带(C3d)，继续制备1%琼脂糖分离胶，电泳后分离900bp的目标条带，切胶称重，按Qiagen胶回收试剂盒的说明书操作，分离纯化目的片段C3d，最后用50μl纯水洗脱备用。(2)扩增下游带linker的S 2 S基因(-S 2 S约900bp):引物使用P 3 、P 4 ，PCR反应体系:HBV+血清5μl、10×Buffer5μl、dNTP(2.5mmol/l)4μl、P 3 (10μmol/L)1.25μl、P 4 (10μmol/L)1.25μl、pyrobest polymerase(0.5U/μl)2.5μl、H 2 O31μl，共计50μl。短暂离心后置于PCR仪上扩增。反应结束后，取PCR产物5μl，1%琼脂糖凝胶电泳，80V，约20min;若在900bp附近观察到一清晰条带(S2 S)，后再制备1%琼脂糖分离胶，电泳后分离约900bp的目标条带，切胶称重，按Qiagen胶回收试剂盒的说明书操作，分离纯化目的片段S 2 S，最后用50μl纯水洗脱备用。(3)连接“C3d-”和“-S 2 S”，组成C3d-S 2 S片段(1.8kb):PCR扩增体系中取以上扩增的带Linker的“C3d-”和“-S 2 S”各5μl，余反应成分同前;引物采用P 1 、P 4 。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，并分离回收约1.8kb的目标DNA(C 3d -S 2 S)。
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1.2.2 乙肝核酸疫苗质粒的构建 (1)将连接片段C3d-S 2 S与载体pVAX1相连接，构建重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S:将C3d-S 2 S片段和pVAX1载体应用KpnⅠ/NotⅠ双 酶切;酶切反应完成后，取2μl酶切产物，以1%琼脂糖凝胶电泳确定酶切是否完全。胶回收酶切后的载体和DNA插入片段，最后用20μl纯水洗脱用于连接反应。连接反应:采用Takara DNA ligation Kits，连接反应体系:Vector(pVAX1)(1:5稀释)1μl、Inserted DNA(C3d-S 2 S)4μl、SolutionⅠ5μl;混匀，16℃连接1h后备用。重组质粒转化感受态JM109及重组子的筛选按照《分子克隆》 [5] 进行操作。重组质粒各取1μl以1%琼脂糖凝胶电泳，以空载质粒为对照，分子量大于空载质粒者，再进一步用KpnⅠ和NotⅠ双酶切;酶切后载体及插入片段分子量大小与预期完全相符，即送上海基康公司测序。
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1.2.3 重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S的序列分析 构建完毕的重组质粒pVAX1C3d-S 2 S由上海基康生物技术有限公司进行序列分析。序列确定后命名为:pVAX1-C 3d -S 2 S。
1.2.4 重组质粒在SP2/0细胞中表达的初步研究 采用经典磷酸钙转染方法将重组质粒转染入真核细胞SP2/0:质粒转染2天后，收集细胞:(1)提取转染细胞的总RNA(按照试剂盒说明书进行操作)，RT-PCR扩增S 2 S片段。(2)取经RT-PCR确定有目的的基因转录的转染细胞株，提取蛋白质，利用ELISA试剂盒检测HBsAg。
2 结果
2.1 目的基因C3d-的扩增 采用引物P 1 、P 2 ，以质粒pGEM-C3d为模板，扩增出的产物用1%琼脂糖凝胶电脉，显示出一条约900bp的DNA条带，符合预期大小。见图1。
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2.2 目的基因-S 2- S的扩增 采用引物P 3 、P 4 ，以乙肝病人的血清为模板，进行PCR扩增。扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳后显示出一条约900bp的DNA条带，符合S 2 S的大小。见图2。
2.3 目的基因C3d-与S 2- S的连接与扩增 采用引物P 1 、P 3 ，使用PCR技术将C3d-与-S 2- S两片段连接并扩增，扩增产物以1%琼脂糖凝胶电脉后显示出一条约1.8kb的DNA条带，符合C3d-S 2 S的预期大小。见图3。
2.4 重组质粒的构建与鉴定 在载体pVAX1中插入C3d-S 2 S片段，将获得和重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S抽提后电泳，显示出pVAX1-C3d-S 2 S的分子量大于载体pVAX1。重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S经EcoRI消化，分别切下约1.8kb和900bp的条带。见图4。
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图1 PCR扩增C3d基因M:100bp DNA marker1:PCR product C3d
图2 PCR扩增S 2- S基因1:-S2S片段(890bp);2:S2S-片段(890bp); N:阴性对照;M:DNA marker DL-2000
图3C3d与S 2 S的连结M:marker，1:C3d-S 2 S，2:S 2 S，3:C3d
图4 pVAX1-C3d-S 2 S与pVAX1-S 2 S酶切图1:pVAX1，2:pVAX1-C3d-S 2 S，3:pVAX1-S 2 S，M:DNA marker
2.5 DNA序列分析 对pVAX1-C3d-S 2 S中C3d-S 2 S全长cDNA约1.8kb进行序列分析，符合理论序列。
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2.6 C3d-S 2 S在真核细胞(SP2/0细胞)中表达的初步研究重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S转染SP2/0细胞2天后，收 集细胞:(1)PCR扩增细胞裂解液中S 2 S片段:抽提SP2/0细胞的总RNA，逆转录后进行PCR扩增，得到了S 2 S目的条带，而空载质粒转染的细胞则为阴性。提示S 2 S已整合至SP2/0细胞基因组中，这为今后的蛋白表达奠定了基础，见图5。(2)用ELISA试剂盒检测细胞裂解液中HBsAg:提取转染重组质粒细胞株的总蛋白，ELISA检测HBsAg的结果提示:重组质粒转染组为阳性;S 2 S组亦为阳性;而空载质粒转染细胞组则为阴性。图5 PCR扩增转染细胞SP2/0中的S 2 S基因M:DNA marker;1:S 2 S
3 讨论
HBV感染呈全球性分布，我国是高发区。目前对慢性乙型肝炎及其继发性病变如肝硬化、肝癌等尚无理想的治疗方法。核酸疫苗的出现与发展，无疑为慢性乙型肝炎的防治开创了新的思路。目前，包括本研究室在内的世界各地的研究者们已构建了多种乙肝核酸疫苗，在动物实验及Ⅰ期临床试验中获得了令人鼓舞的结果。Roy MJ等 [6～8] 将编码HBsAg的乙肝核酸疫苗用基因枪皮下接种健康志愿者后，观察到该疫苗可在人体内诱生一定程度的体液和细胞免疫应答。但是，一方面人体试验结果尚未尽人意，另一方面所用疫苗剂量大(最高达4mg/人)、免疫诱生力低下，因而其安全性令人堪忧。由此，深入研究并探索新型，使用剂量小，安全而高效的乙肝核酸疫苗来预防甚至治疗慢性HBV感染，就显得极为紧迫且意义深远。既往研究表明，适当的联合应用佐剂分子，有可能增强核酸疫苗的免疫效应、减少核酸疫苗的用量，从而提高其安全性，因此佐剂的应用已成为核酸疫苗的研制方向之一。如ChowYH等 [9] 构建的preS 2 S和IL-2的重组质粒，可融合表达IL-2与HBV中蛋白，能有效地增强免疫效果，且可克服与MHC相关的、对HBsAg免疫的无反性问题。陈光明等 [10] 先构建了单独的GM-CSF/IL-2/IFN-γ真核表达质粒，使其与S 2 S基因疫苗联合免疫，观察到它能增强基因疫苗的CTL特异性免疫反应，这一形式已取得了国家专利。2000年，Ross TM等 [3] 首次报道了C3d在DNA免疫中对免疫反应的促进作用。他们将3个拷贝串联的C3d基因连接到流感病毒的血凝素抗原(HA)的3′末端，再将融合基因克隆到真核表达载体pGA中;重组质粒作为DNA疫苗免疫动物后，不但能提高抗体滴度、亲和力，还能提高免疫的保护率。另外，这个小组其他的研究表明，C3d分子可增强艾滋病毒膜蛋白gp120的免疫原型。王明雁等 [11] 也构建了pcDNA3.1-hCG-C3d的真核表达质粒，以期增强核酸疫苗的免疫效率。C3d作为一种新型的分子佐剂，近年来已得到广泛的关注。但是，作为佐剂，补体C3d尚未用于乙肝核酸疫苗。因小鼠C3d的基因序列与人的C3d基因具有高度的同源性(约84%) [12] ，因此本实验结果对于将来的人体应用具有重要的参考价值。本研究根据Ross TM提供的小鼠C3d基因序列，自行设计引物，从小鼠BALB/c肝组织中获取了C 3d 基因;并进一步将C 3d 连接到乙肝病毒S 2 S基因的上游，以便于融合表达质粒中的C 3d 更好地发挥免疫调节的佐剂作用。核酸疫苗常用的质粒载体有pcDNA3系列、pCI、pVAX1、pRC/CMV、VR1012等。pVAX1载体分子量较小，仅保留了作为真核表达质粒所需的最基本组成，且采用Kana抗性基因，因此被美国FDA获准用于核酸疫苗。本研究根据HBV抗原基因的作用特点，成功构建了含有新型分子佐剂补体C3d的乙肝核酸疫苗重组质粒pVAX1C3d-S 2 S;对此核酸疫苗重组质粒的插入序列进行分析后表明，我们自本地区乙肝携带者血清中分离的HBV毒株属于基因型B/血清亚型adw2或基因型C/血清亚型adrq + ，是中国患者HBV感染的主要型别。
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BALB/c小鼠是核酸疫苗免疫学研究中常用的一种近交系小鼠;SP2/0是由绵羊红细胞免疫后的BALB/c小鼠脾细胞与P3×63Ag8骨髓瘤细胞(BALB/c来源)融合而成，具有与BALB/c小鼠相同的MHCⅠ类抗原(H-2 d )。通过转染乙肝核酸疫苗质粒，SP2/0细胞能够稳定地表达乙肝病毒抗原。本研究将重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S在真核细胞SP2/0进行了瞬时表达，为乙肝治疗性核酸疫苗的进一步研究提供了物质基础。
参考文献
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4 Ross TM，Xu Y.C3d enchancement of antibodies to hemagglutinin acceˉlartesprotection against influenza virus challenge.Nature Immunology，2001，1:127-131.
5 J.萨姆克鲁克，E.F.弗里奇，T.漫尼阿蒂斯著，金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第二版.北京:科学出版社，1996，42-60.
6 Roy MJ，Wu MS，barr LJ，et al.Induction of antigen specific CD8+T cell，T helper cell，and protective levels of antibody in human by particle-mediated administration of a hepatitis B virus DNA vaccine.Vaccine，200，19(7-8):764-778.
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10 陈光明，谢宗法，杨富强，等.抗乙型肝炎病毒双质粒基因疫苗的制备方法及应用.发明专利申请公开说明书，申请号00107853.4公开号CN1316518A，中华人民共和国国家知识产权局.
11 王明雁，李磊，李大金，等.hCGβ与鼠补体片段C3d的联接及其在真核细胞中的表达.中国免疫学杂志，2002，18:445-450.
12 Nagar B，Jones RG，Diefenbch RJ.X-ray crystal structure of C3d:a C 3 fragment and ligand for complement receptor2.Science，1998，280:1277-1281.
作者单位:610083成都成都军区总医院心内科(内分泌科)
四川大学华西医院感染病分子生物学重点实验室
(收稿日期:2003-11-04)
(编辑小 川), 百拇医药
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关键词 补体C3d preS 2- S基因 pVAX1 乙肝核酸疫苗
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)05-0394-04
The construction and the sequence analysing of the eukaryotic
expression plasmid pVAX1-C3d-S2S and the researching of it’s expression in the eukaryotic cells
Sun Meiqin，Jin Xiaolan，Jiang Dachun，et al.
Department of Vascular and Heart Diseases of Chengdu Army General Hospital，Chengdu610083.
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【Abstract】 Objective The commplement C3d has a stronger postive role to control the immunologic system.We have utilized the vector of pVAX1admitted by FDA to construct the recombinant plasmid including the compleˉment C3d and hepatitis B preS2S antigen gene(adw2serum type)，in order to enhance the inmmunologic efficiencies of the HBV nucleotic acid vaccine.And detecting it’s transient expression in the eukaryotic cells.Methods Amplifyˉing the segment of complementC3d gene and the preS2-S gene of HBV by PCR;linking the two segment;and then inserting the linked segment of C3d-preS2-S into pVAX1;detecting the new plasmid pVAX1-C3d-S2S by diˉgesting with Eco RI and DNA sequencing.Finaly，exploring it’s transient expression by amplifying the segment S2S from the transfected eukaryotic cells SP2/0and detecting HBsAg by ELISA.Results The DNA sequencing confirmed the segment of the C3d，preS2-S and the whole pVAX1-C3d-S2S.Then we demonstrated HBsAg by ELISA and amplified preS2S gene from the transfected cells-SP2/0.Conclusion We have successfully cloned the gene of the complement C3d and the preS2S of adw2serum type of HBV;and constructed the recombinant plasmid of pVAX1-C3d-S2S.We also indicate that it can be expressed in the eukaryotic cells.
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Key words complement C3d preS 2 S gene pVAX1 HBV nucleotic vaccine
国内外迄今为止的研究结果表明，现有的各种核酸疫苗普遍存在着免疫诱生效力偏低的问题，尚不能达到实用化的目的，这已经成为限制核酸疫苗实用化的“瓶颈” [1，2] 。国内外学者已采用多种不同的方法来增强核酸疫苗的免疫诱生效力，如使用高效表达载体、增加分子佐剂、改变 接种方式等。而分子佐剂的研究近年来发展较快，文献报道，抗原与若干个C3d分子偶联成为融合蛋白，可增强该抗原的免疫原性[3，4] 。因此，补体分子C3d作为一种新型佐剂已引起人们的关注。为此，我们构建了含有补体C3d及preS 2- S抗原编码基因的乙肝核酸疫苗重组质粒，验证补体C3d的佐剂效应，以期建立一种新型且具有较高表达效率并能诱生更强免疫应答的乙肝核酸疫苗，从而加快乙肝核酸疫苗的实用化进程。
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1.1 实验材料
1.1.1 仪器及试剂 BALB/C小鼠均来自四川大学华西医院实验动物中心;PCR仪为Hangzhou Tarotoc Thermal cycter;PCR配套试剂和DNA ligation Kits购自日本TaRaKa公司;Total RNA Kit和pGEM T easy Vector试剂盒购自美国Promega公司;限制性核酸内切酶EcoRI、KpnI、NotI和T4连接酶、AMV逆转录酶及DNA回收试剂盒购自美国Omega公司;Plasmid Mini Prep Kit购自德国Qiagen公司;pVAX1载体由唐红博士惠赠;JM109由地奥集团惠赠;小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由高小平研究员惠赠;HBsAg检测试剂盒购自华美生物工程公司。
1.1.2 PCR引物 根据Ross提供的C3d序列及Denbank上HBV基因序列，由笔者自行设计，上海基康生物技术有限公司合成，序列为
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P 1 :5′GCG GGT ACC ATG GCC AAG GAG GCA GAT GTG TCA CTC ACA G3′
P 2 :5′ACC AGA ACC ACC ACC ACC AGA ACC ACC ACC ACC ATC CAC TGC TGG GGA GGT GG3′
P 3 :5′GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGTTCT ATG CAG TGG AAC TCC ACA ACA TTC CAC3′
P 4 :5′AGC GGC CGC ATG TAT ACC CAA AGA CAA AAG AA3′黑体部分为添加的限制性核酸内切酶KpnI、NotI特异识别的核苷酸序列。
1.2 实验方法
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1.2.1 目的基因的获取与连接 (1)扩增上游带Linker的C3d基因(C3d-约900bp):引物使用P 1 、P 2 ，PCR反应体系:pGEM-C3d质粒5μl、10×Buffer5μl、dNTP(2.5mmol/L)4μl、P 1 (10μmol/L)1.25μl、P 2 (10μmol/L)1.25μl、Deep vent polyˉmerase(0.5U/μl)2.5μl、H 2 O31μl，共计50μl。反应结束后，取PCR产物5μl，1%琼脂糖凝胶电泳，80V，约20min;在900bp附近观察到一清晰条带(C3d)，继续制备1%琼脂糖分离胶，电泳后分离900bp的目标条带，切胶称重，按Qiagen胶回收试剂盒的说明书操作，分离纯化目的片段C3d，最后用50μl纯水洗脱备用。(2)扩增下游带linker的S 2 S基因(-S 2 S约900bp):引物使用P 3 、P 4 ，PCR反应体系:HBV+血清5μl、10×Buffer5μl、dNTP(2.5mmol/l)4μl、P 3 (10μmol/L)1.25μl、P 4 (10μmol/L)1.25μl、pyrobest polymerase(0.5U/μl)2.5μl、H 2 O31μl，共计50μl。短暂离心后置于PCR仪上扩增。反应结束后，取PCR产物5μl，1%琼脂糖凝胶电泳，80V，约20min;若在900bp附近观察到一清晰条带(S2 S)，后再制备1%琼脂糖分离胶，电泳后分离约900bp的目标条带，切胶称重，按Qiagen胶回收试剂盒的说明书操作，分离纯化目的片段S 2 S，最后用50μl纯水洗脱备用。(3)连接“C3d-”和“-S 2 S”，组成C3d-S 2 S片段(1.8kb):PCR扩增体系中取以上扩增的带Linker的“C3d-”和“-S 2 S”各5μl，余反应成分同前;引物采用P 1 、P 4 。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，并分离回收约1.8kb的目标DNA(C 3d -S 2 S)。
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1.2.2 乙肝核酸疫苗质粒的构建 (1)将连接片段C3d-S 2 S与载体pVAX1相连接，构建重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S:将C3d-S 2 S片段和pVAX1载体应用KpnⅠ/NotⅠ双 酶切;酶切反应完成后，取2μl酶切产物，以1%琼脂糖凝胶电泳确定酶切是否完全。胶回收酶切后的载体和DNA插入片段，最后用20μl纯水洗脱用于连接反应。连接反应:采用Takara DNA ligation Kits，连接反应体系:Vector(pVAX1)(1:5稀释)1μl、Inserted DNA(C3d-S 2 S)4μl、SolutionⅠ5μl;混匀，16℃连接1h后备用。重组质粒转化感受态JM109及重组子的筛选按照《分子克隆》 [5] 进行操作。重组质粒各取1μl以1%琼脂糖凝胶电泳，以空载质粒为对照，分子量大于空载质粒者，再进一步用KpnⅠ和NotⅠ双酶切;酶切后载体及插入片段分子量大小与预期完全相符，即送上海基康公司测序。
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1.2.3 重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S的序列分析 构建完毕的重组质粒pVAX1C3d-S 2 S由上海基康生物技术有限公司进行序列分析。序列确定后命名为:pVAX1-C 3d -S 2 S。
1.2.4 重组质粒在SP2/0细胞中表达的初步研究 采用经典磷酸钙转染方法将重组质粒转染入真核细胞SP2/0:质粒转染2天后，收集细胞:(1)提取转染细胞的总RNA(按照试剂盒说明书进行操作)，RT-PCR扩增S 2 S片段。(2)取经RT-PCR确定有目的的基因转录的转染细胞株，提取蛋白质，利用ELISA试剂盒检测HBsAg。
2 结果
2.1 目的基因C3d-的扩增 采用引物P 1 、P 2 ，以质粒pGEM-C3d为模板，扩增出的产物用1%琼脂糖凝胶电脉，显示出一条约900bp的DNA条带，符合预期大小。见图1。
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2.2 目的基因-S 2- S的扩增 采用引物P 3 、P 4 ，以乙肝病人的血清为模板，进行PCR扩增。扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳后显示出一条约900bp的DNA条带，符合S 2 S的大小。见图2。
2.3 目的基因C3d-与S 2- S的连接与扩增 采用引物P 1 、P 3 ，使用PCR技术将C3d-与-S 2- S两片段连接并扩增，扩增产物以1%琼脂糖凝胶电脉后显示出一条约1.8kb的DNA条带，符合C3d-S 2 S的预期大小。见图3。
2.4 重组质粒的构建与鉴定 在载体pVAX1中插入C3d-S 2 S片段，将获得和重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S抽提后电泳，显示出pVAX1-C3d-S 2 S的分子量大于载体pVAX1。重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S经EcoRI消化，分别切下约1.8kb和900bp的条带。见图4。
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图1 PCR扩增C3d基因M:100bp DNA marker1:PCR product C3d
图2 PCR扩增S 2- S基因1:-S2S片段(890bp);2:S2S-片段(890bp); N:阴性对照;M:DNA marker DL-2000
图3C3d与S 2 S的连结M:marker，1:C3d-S 2 S，2:S 2 S，3:C3d
图4 pVAX1-C3d-S 2 S与pVAX1-S 2 S酶切图1:pVAX1，2:pVAX1-C3d-S 2 S，3:pVAX1-S 2 S，M:DNA marker
2.5 DNA序列分析 对pVAX1-C3d-S 2 S中C3d-S 2 S全长cDNA约1.8kb进行序列分析，符合理论序列。
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2.6 C3d-S 2 S在真核细胞(SP2/0细胞)中表达的初步研究重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S转染SP2/0细胞2天后，收 集细胞:(1)PCR扩增细胞裂解液中S 2 S片段:抽提SP2/0细胞的总RNA，逆转录后进行PCR扩增，得到了S 2 S目的条带，而空载质粒转染的细胞则为阴性。提示S 2 S已整合至SP2/0细胞基因组中，这为今后的蛋白表达奠定了基础，见图5。(2)用ELISA试剂盒检测细胞裂解液中HBsAg:提取转染重组质粒细胞株的总蛋白，ELISA检测HBsAg的结果提示:重组质粒转染组为阳性;S 2 S组亦为阳性;而空载质粒转染细胞组则为阴性。图5 PCR扩增转染细胞SP2/0中的S 2 S基因M:DNA marker;1:S 2 S
3 讨论
HBV感染呈全球性分布，我国是高发区。目前对慢性乙型肝炎及其继发性病变如肝硬化、肝癌等尚无理想的治疗方法。核酸疫苗的出现与发展，无疑为慢性乙型肝炎的防治开创了新的思路。目前，包括本研究室在内的世界各地的研究者们已构建了多种乙肝核酸疫苗，在动物实验及Ⅰ期临床试验中获得了令人鼓舞的结果。Roy MJ等 [6～8] 将编码HBsAg的乙肝核酸疫苗用基因枪皮下接种健康志愿者后，观察到该疫苗可在人体内诱生一定程度的体液和细胞免疫应答。但是，一方面人体试验结果尚未尽人意，另一方面所用疫苗剂量大(最高达4mg/人)、免疫诱生力低下，因而其安全性令人堪忧。由此，深入研究并探索新型，使用剂量小，安全而高效的乙肝核酸疫苗来预防甚至治疗慢性HBV感染，就显得极为紧迫且意义深远。既往研究表明，适当的联合应用佐剂分子，有可能增强核酸疫苗的免疫效应、减少核酸疫苗的用量，从而提高其安全性，因此佐剂的应用已成为核酸疫苗的研制方向之一。如ChowYH等 [9] 构建的preS 2 S和IL-2的重组质粒，可融合表达IL-2与HBV中蛋白，能有效地增强免疫效果，且可克服与MHC相关的、对HBsAg免疫的无反性问题。陈光明等 [10] 先构建了单独的GM-CSF/IL-2/IFN-γ真核表达质粒，使其与S 2 S基因疫苗联合免疫，观察到它能增强基因疫苗的CTL特异性免疫反应，这一形式已取得了国家专利。2000年，Ross TM等 [3] 首次报道了C3d在DNA免疫中对免疫反应的促进作用。他们将3个拷贝串联的C3d基因连接到流感病毒的血凝素抗原(HA)的3′末端，再将融合基因克隆到真核表达载体pGA中;重组质粒作为DNA疫苗免疫动物后，不但能提高抗体滴度、亲和力，还能提高免疫的保护率。另外，这个小组其他的研究表明，C3d分子可增强艾滋病毒膜蛋白gp120的免疫原型。王明雁等 [11] 也构建了pcDNA3.1-hCG-C3d的真核表达质粒，以期增强核酸疫苗的免疫效率。C3d作为一种新型的分子佐剂，近年来已得到广泛的关注。但是，作为佐剂，补体C3d尚未用于乙肝核酸疫苗。因小鼠C3d的基因序列与人的C3d基因具有高度的同源性(约84%) [12] ，因此本实验结果对于将来的人体应用具有重要的参考价值。本研究根据Ross TM提供的小鼠C3d基因序列，自行设计引物，从小鼠BALB/c肝组织中获取了C 3d 基因;并进一步将C 3d 连接到乙肝病毒S 2 S基因的上游，以便于融合表达质粒中的C 3d 更好地发挥免疫调节的佐剂作用。核酸疫苗常用的质粒载体有pcDNA3系列、pCI、pVAX1、pRC/CMV、VR1012等。pVAX1载体分子量较小，仅保留了作为真核表达质粒所需的最基本组成，且采用Kana抗性基因，因此被美国FDA获准用于核酸疫苗。本研究根据HBV抗原基因的作用特点，成功构建了含有新型分子佐剂补体C3d的乙肝核酸疫苗重组质粒pVAX1C3d-S 2 S;对此核酸疫苗重组质粒的插入序列进行分析后表明，我们自本地区乙肝携带者血清中分离的HBV毒株属于基因型B/血清亚型adw2或基因型C/血清亚型adrq + ，是中国患者HBV感染的主要型别。
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BALB/c小鼠是核酸疫苗免疫学研究中常用的一种近交系小鼠;SP2/0是由绵羊红细胞免疫后的BALB/c小鼠脾细胞与P3×63Ag8骨髓瘤细胞(BALB/c来源)融合而成，具有与BALB/c小鼠相同的MHCⅠ类抗原(H-2 d )。通过转染乙肝核酸疫苗质粒，SP2/0细胞能够稳定地表达乙肝病毒抗原。本研究将重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S在真核细胞SP2/0进行了瞬时表达，为乙肝治疗性核酸疫苗的进一步研究提供了物质基础。
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作者单位:610083成都成都军区总医院心内科(内分泌科)
四川大学华西医院感染病分子生物学重点实验室
(收稿日期:2003-11-04)
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