不完全抗体效价快速检测法
【文献标识码】 B 【文章编号】 1609-6614(2004)02-0178-02
孕妇血浆内的高效价IgG抗体可通过胎盘屏障进入胎儿体内，与胎儿红细胞上对应的血型抗原结合，抗原抗体反应导致胎儿红细胞溶血，出生后临床表现为新生儿病理性黄疸。现在证明母体高效价IgG抗体是新生儿溶血病的主要病因，孕妇不完全抗体效价检测已成为围产检查的常规项目。传统的抗人球法时间长，步骤繁琐，不少实验室开展有困难，有报道凝聚胺试剂盒可用于效价测定 [1] ，我们对这两种方法进行了比较。
1 材料
1.1 凝聚胺(polybrene)试剂盒 台湾BASO公司产品，包括低离子介质，凝聚胺，重悬液。
1.2 抗人球蛋白血清 上海血液中心血型参比实验室提供。
, 百拇医药 1.3 0.1%2-巯基乙醇(2-Me) 自配。
1.4 3%标准A、B型红细胞自配。
1.5 质控抗D血清 美国Biotest公司产品。
1.6 检测对象 50例医院送检的O型孕妇血清标本。
2 方法
2.1 IgG抗体的制备 标本血清和2-Me按1:2加入玻璃试管中，封口置37℃水浴10min。另外标记四排试管，分别 检测IgG抗A、IgG抗B抗体，每管加入生理盐水2滴，采用倍比稀释法将水浴后已破坏IgM抗体的待检血清分别加入两排试管中，此时稀释度分别是1:4，1:8，余此类推。
2.2 抗人球法 两排试管中分别加入标准A、B细胞各1滴，37℃水浴1小时，生理盐水洗涤3次，加入2滴抗人球试剂，离心看结果。
, 百拇医药
2.3 凝聚胺法 两排试管中分别加入标准A、B细胞各1滴，加入0.6ml低离子介质，2滴聚凝胺，37℃混合均匀1min，离心15s，倒去上清，加入2滴重悬液，观察结果。
2.4 结果判断 以产生1+反应的血清最高稀释度来确立效价，凝聚胺法减去前两支管4+凝集的评分(2×12分)进行修正，通过凝集强度评分标准对试验结果进行统计学分析，评价两种方法的差异 [2] 。
2.5 质控 两种方法需同时做质控，阳性对照管加入2滴IgG抗D血清，阴性对照管加入2滴AB型血清或生理盐水，阴、阳性管各加入1滴3%O型Rh(D)阳性细胞，两种反应介质的加入同2.2、2.3。
3 结果
3.1 IgG抗A抗体效价测定 见表1。
表1 50例“O”型孕妇IgG抗A抗体效价测定 略
, 百拇医药
根据表1结果进行配对资料的t检验，以积分值为比较数据，t=1.32，P>0.10，修正后两组积分值差异无显著 性。
3.2 IgG抗B抗体效价测定 见表2。
表2 50例“O”型孕妇IgG抗B抗体效价测定 略
根据表2结果进行配对资料的t检验，t=1.47，0.20>P>0.10，修正后两组积分值差异无显著性。
4 讨论
抗人球蛋白试验是检测血清中不完全血型抗体的经典方法，用已知抗原红细胞测定受检血清中相应的不完全抗体，或用已知抗体的抗血清测定受检红细胞上相应抗原。广泛应用于血型鉴定，抗体的检出和鉴定，交叉配血试验以及孕妇IgG抗体效价测定。抗人球法干扰少，结果准确，但因为反应需水浴1h，比较费时，因此寻找抗人球法的替代实验一直在研究中。抗入球法的关键是洗涤步骤，红细胞必须被生理盐水全程足量充分洗涤，盐水要用力冲入管底，使积压于管底的红细胞松离。切勿用手指堵住管口，颠倒混匀，以防来自皮肤的蛋白污染。
, 百拇医药
国内外加速不完全抗体反应的方法研究已有较长时间，其中由美国学者Lalerazi首先提出的Polybrene法可在3min内完成实验。该方法分致敏、促凝和再中和三步进行，BASO公司的Polybrene法操作与它极其类似。Polybrene法的实验原理是:凝聚胺(Polybrene)是带有正电荷的大分子物质，能够中和红细胞膜唾液酸组成的负电荷，减少细胞间静电斥力，使细胞间距缩短，而又不致引起红细胞间的非特异凝集。在生理盐水介质中长度较短的IgG抗体不能造成抗原抗体的凝集反应，但在Polybrene与低离子介质共同作用下细胞距离被缩短，IgG抗体可在细胞间搭成复桥，离心后可见凝集反应，非特异性的凝集可被带负电荷的重悬液(枸橼酸钠)消除，对IgM抗体的作用则是增强凝集反应强度 [3] 。其他的还有LIM(低离子强度)法，PEG(聚乙二醇)法和IRAT法等，但研究均停留在凝集反应的定性实验，缺少对抗体效价测定研究的半定量实验的资料。本实验50例孕妇血清不完全抗体效价半定量检测结果可见，凝聚胺法相对抗人球法敏感，平均高出2个滴度。通过减少凝聚胺法前两管凝集评分(2×12分)，修正后凝聚胺法与抗人球法的效价积分值统计显示P>0.10或0.05，说明两种方法测定抗体效价结果差异无显著性，建议报告IgG抗A或 抗B抗体效价结果时，凝聚胺法降低2个滴度就是经典抗人球法的结果。凝聚胺试剂对冷抗体敏感，实验需在37℃水浴1min，强冷自身凝集素干扰时可置56℃水浴1min下松动细胞扣。室温低时若持续出现高滴度效价结果时应考虑这方面原因。纤维蛋白原会在凝聚胺试剂中凝集成纤维蛋白原块，干扰结果，建议用血清标本 [4] 。另外，鉴于凝聚胺中和红细胞表面负电荷是量的反应，正电荷与负电荷的相对量将影响实验结果，因此每批试剂要作质控，排除假阴性、假阳性结果。凝聚胺方法操作简便，无需1h水浴，准确性和稳定性达到实验要求，所以在IgG抗体效价测定实验中凝聚胺法可替代抗人球法。
, 百拇医药
参考文献
1 Braga GW，Bordin JO，Moreira Junior G，et al.Laboratory diagnosis of auto-immune hemolytic anemia:characteristics of the manual direct test of Polybrene.Rev Assoc Med Bras，1998Jan-Mar，44(1):16-20.
2 吕鹏.最新输血技术学，北京:人民卫生出版社，1994，413-416.
3 Lalerazi P.The manual hexadimethrine bromide(polybrene)test:effects of serum proteins and practical applications.Transfusion1987，27(4):295.
4 赵进生，旷婕萍.不完全抗体快速促凝剂的研制和初步应用报告.中国输血杂志，1992，(1):
作者单位: 510095 广东省广州市血液中心
(编辑 清泉), 百拇医药
孕妇血浆内的高效价IgG抗体可通过胎盘屏障进入胎儿体内，与胎儿红细胞上对应的血型抗原结合，抗原抗体反应导致胎儿红细胞溶血，出生后临床表现为新生儿病理性黄疸。现在证明母体高效价IgG抗体是新生儿溶血病的主要病因，孕妇不完全抗体效价检测已成为围产检查的常规项目。传统的抗人球法时间长，步骤繁琐，不少实验室开展有困难，有报道凝聚胺试剂盒可用于效价测定 [1] ，我们对这两种方法进行了比较。
1 材料
1.1 凝聚胺(polybrene)试剂盒 台湾BASO公司产品，包括低离子介质，凝聚胺，重悬液。
1.2 抗人球蛋白血清 上海血液中心血型参比实验室提供。
, 百拇医药 1.3 0.1%2-巯基乙醇(2-Me) 自配。
1.4 3%标准A、B型红细胞自配。
1.5 质控抗D血清 美国Biotest公司产品。
1.6 检测对象 50例医院送检的O型孕妇血清标本。
2 方法
2.1 IgG抗体的制备 标本血清和2-Me按1:2加入玻璃试管中，封口置37℃水浴10min。另外标记四排试管，分别 检测IgG抗A、IgG抗B抗体，每管加入生理盐水2滴，采用倍比稀释法将水浴后已破坏IgM抗体的待检血清分别加入两排试管中，此时稀释度分别是1:4，1:8，余此类推。
2.2 抗人球法 两排试管中分别加入标准A、B细胞各1滴，37℃水浴1小时，生理盐水洗涤3次，加入2滴抗人球试剂，离心看结果。
, 百拇医药
2.3 凝聚胺法 两排试管中分别加入标准A、B细胞各1滴，加入0.6ml低离子介质，2滴聚凝胺，37℃混合均匀1min，离心15s，倒去上清，加入2滴重悬液，观察结果。
2.4 结果判断 以产生1+反应的血清最高稀释度来确立效价，凝聚胺法减去前两支管4+凝集的评分(2×12分)进行修正，通过凝集强度评分标准对试验结果进行统计学分析，评价两种方法的差异 [2] 。
2.5 质控 两种方法需同时做质控，阳性对照管加入2滴IgG抗D血清，阴性对照管加入2滴AB型血清或生理盐水，阴、阳性管各加入1滴3%O型Rh(D)阳性细胞，两种反应介质的加入同2.2、2.3。
3 结果
3.1 IgG抗A抗体效价测定 见表1。
表1 50例“O”型孕妇IgG抗A抗体效价测定 略
, 百拇医药
根据表1结果进行配对资料的t检验，以积分值为比较数据，t=1.32，P>0.10，修正后两组积分值差异无显著 性。
3.2 IgG抗B抗体效价测定 见表2。
表2 50例“O”型孕妇IgG抗B抗体效价测定 略
根据表2结果进行配对资料的t检验，t=1.47，0.20>P>0.10，修正后两组积分值差异无显著性。
4 讨论
抗人球蛋白试验是检测血清中不完全血型抗体的经典方法，用已知抗原红细胞测定受检血清中相应的不完全抗体，或用已知抗体的抗血清测定受检红细胞上相应抗原。广泛应用于血型鉴定，抗体的检出和鉴定，交叉配血试验以及孕妇IgG抗体效价测定。抗人球法干扰少，结果准确，但因为反应需水浴1h，比较费时，因此寻找抗人球法的替代实验一直在研究中。抗入球法的关键是洗涤步骤，红细胞必须被生理盐水全程足量充分洗涤，盐水要用力冲入管底，使积压于管底的红细胞松离。切勿用手指堵住管口，颠倒混匀，以防来自皮肤的蛋白污染。
, 百拇医药
国内外加速不完全抗体反应的方法研究已有较长时间，其中由美国学者Lalerazi首先提出的Polybrene法可在3min内完成实验。该方法分致敏、促凝和再中和三步进行，BASO公司的Polybrene法操作与它极其类似。Polybrene法的实验原理是:凝聚胺(Polybrene)是带有正电荷的大分子物质，能够中和红细胞膜唾液酸组成的负电荷，减少细胞间静电斥力，使细胞间距缩短，而又不致引起红细胞间的非特异凝集。在生理盐水介质中长度较短的IgG抗体不能造成抗原抗体的凝集反应，但在Polybrene与低离子介质共同作用下细胞距离被缩短，IgG抗体可在细胞间搭成复桥，离心后可见凝集反应，非特异性的凝集可被带负电荷的重悬液(枸橼酸钠)消除，对IgM抗体的作用则是增强凝集反应强度 [3] 。其他的还有LIM(低离子强度)法，PEG(聚乙二醇)法和IRAT法等，但研究均停留在凝集反应的定性实验，缺少对抗体效价测定研究的半定量实验的资料。本实验50例孕妇血清不完全抗体效价半定量检测结果可见，凝聚胺法相对抗人球法敏感，平均高出2个滴度。通过减少凝聚胺法前两管凝集评分(2×12分)，修正后凝聚胺法与抗人球法的效价积分值统计显示P>0.10或0.05，说明两种方法测定抗体效价结果差异无显著性，建议报告IgG抗A或 抗B抗体效价结果时，凝聚胺法降低2个滴度就是经典抗人球法的结果。凝聚胺试剂对冷抗体敏感，实验需在37℃水浴1min，强冷自身凝集素干扰时可置56℃水浴1min下松动细胞扣。室温低时若持续出现高滴度效价结果时应考虑这方面原因。纤维蛋白原会在凝聚胺试剂中凝集成纤维蛋白原块，干扰结果，建议用血清标本 [4] 。另外，鉴于凝聚胺中和红细胞表面负电荷是量的反应，正电荷与负电荷的相对量将影响实验结果，因此每批试剂要作质控，排除假阴性、假阳性结果。凝聚胺方法操作简便，无需1h水浴，准确性和稳定性达到实验要求，所以在IgG抗体效价测定实验中凝聚胺法可替代抗人球法。
, 百拇医药
参考文献
1 Braga GW，Bordin JO，Moreira Junior G，et al.Laboratory diagnosis of auto-immune hemolytic anemia:characteristics of the manual direct test of Polybrene.Rev Assoc Med Bras，1998Jan-Mar，44(1):16-20.
2 吕鹏.最新输血技术学，北京:人民卫生出版社，1994，413-416.
3 Lalerazi P.The manual hexadimethrine bromide(polybrene)test:effects of serum proteins and practical applications.Transfusion1987，27(4):295.
4 赵进生，旷婕萍.不完全抗体快速促凝剂的研制和初步应用报告.中国输血杂志，1992，(1):
作者单位: 510095 广东省广州市血液中心
(编辑 清泉), 百拇医药