枸杞及其制品中功效成分多糖的测定研究
【摘要】 目的 提供一种测定枸杞及其制品中功效成分多糖的方法。方法 先用80%乙醇溶液沉淀样品中的多糖，再用碱性二阶铜试剂选择性地沉淀具有葡聚糖结构的多糖，然后用苯酚-硫酸比色法测定。结果 方法在0～0.2mg/ml范围呈良好的线性关系，其相关系数为0.9996，该方法回收率为90.1%～95.4%，相对标准偏差为1.81%。结论 该方法是一种快速，简便，灵敏度较高的检测枸杞及其制品中功效成分多糖的方法。
关键词 枸杞 功效成分 多糖 苯酚-硫酸法 分光光度法
【文献标识码】 B 【文章编号】 1684-2030(2004)06-0542-02
枸杞系落叶灌木，果实枸杞子味甘，性平，有滋肾补髓、养肝明目和祛风的作用，为一传统滋补中药。近十几年来人们对它进行了更深入的研究，发现它在调节免疫、抗衰老、抗肿瘤、降低血脂和血糖等方面表现出广阔的应用前景 [1～7] 。同时对枸杞子的化学成分及其药理也进行了大量的研究 [8～10] ，发现枸杞子含有丰富的氨基酸、无机盐、微量元素和维生素。枸杞多糖是其主要的保健功能因子，它是由4个不同结构不同分子量的葡聚糖组成的。但其功效成分多糖含量的测定目前尚无统一的标准方法，许多研究者正在积极探讨中 [11～13] ，本文报道在这方面做的一些工作。
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1 实验部分
1.1 原理 多糖在80%乙醇溶液中沉淀，与单糖和低聚糖及甙类物质分离。沉淀用水溶解后再用碱性二阶铜试剂选择性地从其它高分子物质中沉淀出具有葡聚糖结构的多糖，苯酚-硫酸可与其中的多糖起显色反应，生成橙黄色化合物，可于485nm处比色，定量。
1.2 仪器与试剂 80%乙醇溶液(v/v);10%氢氧化钠溶液(w/v);硫酸溶液(100ml/L)。铜储备液:称取0.6g CuSO 4 ·5H 2 O，6.0g柠檬酸钠，加水溶解后定容至200ml。铜试剂溶液:取水50ml，加入50ml铜储备液，混匀后加入12.5g固体无水硫酸钠并使之溶解。洗涤液:取水50ml，加入10ml铜储备液，10ml氢氧化钠溶液，混匀(临用现配)。苯酚溶液(60g/L):称取精制苯酚6.0g，加水溶解并定容至100ml，置于冰箱中保存。葡聚糖标准储备液:精确称取分子量50000，干燥至恒重的葡聚糖0.5000g，加水溶解，并定容至100ml，置于冰箱中保存，此溶液每毫升含5.00mg葡聚糖，用时取适量稀释至每毫升含葡聚糖0.100mg，为标准使用液。
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1.3 实验方法
1.3.1 工作曲线绘制 分别吸取葡聚糖标准使用液0;0.3;0.6;0.9;1.2;1.5;2.0ml(相当于葡聚糖0;0.03;0.06;0.09;0.12;0.15;0.20mg)置于25ml刻度比色管中，精确补水至2.0ml，加入1.0ml苯酚溶液，10.0ml浓硫酸，混匀，于沸水浴中煮沸5min，取出冷却后静置15min，用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。
1.3.2 样品提取 称取混合均匀的枸杞胶囊2.0g置于50ml比色管中，加水40ml，于沸水浴中加热2h，冷却至室温后用水定容至50.0ml，过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀多糖(枸杞口服液则直接吸取2.0ml样品，按1.3.3操作)。
1.3.3 沉淀多糖 精密吸取2.0ml1.3.2项下的滤液，置于10.0ml离心管中，加入无水乙醇8.0ml，搅拌均匀后以3000r/min离心5min，弃去上清夜，沉淀用10ml80%乙醇溶液洗涤后离心，如此操作2次。用2ml水溶解沉淀，混匀，供沉淀葡聚糖。
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1.3.4 沉淀葡聚糖 在1.3.3项溶液中加入100g/L氢氧化钠溶液2.0ml，加2.0ml铜试剂溶液，于沸水浴中煮沸2min，冷却后以3000r/min离心5min，弃去上层清液，沉淀用洗涤液洗涤，离心后弃去上清液，如此重复2次。
1.3.5 将上述沉淀用100ml/L硫酸溶液溶解，视沉淀物的量决定溶解定容量。
1.3.6 吸取1.3.5样品2.0ml(视样品含量而定)置于25.0ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10.0ml硫酸，混匀，于沸水浴中煮沸5min，冷却至室温后静置15min，再用分光光度计于485nm波长处，以试剂空白为零点，1cm比色皿测吸光度，从标准工作曲线计算多糖含量。
2 结果与讨论
2.1 工作曲线 按照上法操作，在0～0.2mg范围内曲线呈良好线性关系，曲线线性回归方程为:Y=-2.8×10 -3 +4.342XR=0.9996。
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2.2 精密度 准确称取6份质量相近混匀的枸杞口服液，按照上述方法进行测定，结果见表1。
表1 方法的精密度 (略)
2.3 回收率的测定 根据上述方法进行了加标实验，结果所得平均回收率在90.1%～95.4%之间，说明该方法是可靠稳定的。
2.4 显色条件的探讨 多糖与苯酚-硫酸显色时，硫酸用量与显色时间较为重要，实验结果表明:硫酸用量为10ml最佳;显色时间为:煮沸5min，冷却至室温后静置15min，此时显色最为稳定。
参考文献
1 罗琼，阎俊，李瑾玮，等.枸杞多糖纯品与粗品免疫活性的比较.中国公共卫生，1999，15(4):292-294.
2 王建华，王汉中，张民，等.枸杞多糖延缓衰老的作用.营养学 报，2002，24(2):189-192.
, 百拇医药
3 曹广文，杨文国，杜平，等.枸杞多糖联合LAK/IL-2疗法对75例晚期肿瘤的疗效观察.中华肿瘤杂志，1994，16(6):428-431.
4 丁民谋，王裕发，邵力.红宝联合干扰素治疗慢性乙型活动性肝炎的研究.中国中西医结合消化杂志，1995，3(2):84-86.
5 薛立文，李以暖.枸杞子的营养和保健功能.广东微量元素科学，2000，7(6):1-4.
6 宋炳生，杨玉龙.枸杞多糖的免疫调节作用.药学实践杂志，1997，15(2):69-72.
7 童进文，胡庆和，高天顺，等.枸杞多糖的药理学研究进展.中国中医基础医学杂志，1998，4(5):54-56.
8 王建华，汪建民，李林，等.枸杞多糖LBP2a的分离、纯化与结构特征.食品科学，2002，23(6):44-48.
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9 赵春久，李荣芷，何云庆，等.枸杞多糖的化学研究.北京医科大学学报，1997，29(3):231-233.
10 何进，张声华.枸杞多糖的分离纯化及组成研究.中国药学杂志，1996，31(12):716-720.
11 周蓉，齐莉，王雅芬，等.HPCE法分离和鉴定枸杞多糖中单糖.药物分析杂志，1998，18(增刊):323-324.
12 段昌令，乔善义，王乃利，等.枸杞子活性多糖的测定.药学学报，2001，36(3):196-199.
13 钱士辉.枸杞多糖注射中间体总多糖含量测定.中国野生植物资源，1995，(2):43-44.
作者单位:350001福建省疾病预防控制中心
(收稿日期:2004-01-15)
(编辑 罗彬), http://www.100md.com
关键词 枸杞 功效成分 多糖 苯酚-硫酸法 分光光度法
【文献标识码】 B 【文章编号】 1684-2030(2004)06-0542-02
枸杞系落叶灌木，果实枸杞子味甘，性平，有滋肾补髓、养肝明目和祛风的作用，为一传统滋补中药。近十几年来人们对它进行了更深入的研究，发现它在调节免疫、抗衰老、抗肿瘤、降低血脂和血糖等方面表现出广阔的应用前景 [1～7] 。同时对枸杞子的化学成分及其药理也进行了大量的研究 [8～10] ，发现枸杞子含有丰富的氨基酸、无机盐、微量元素和维生素。枸杞多糖是其主要的保健功能因子，它是由4个不同结构不同分子量的葡聚糖组成的。但其功效成分多糖含量的测定目前尚无统一的标准方法，许多研究者正在积极探讨中 [11～13] ，本文报道在这方面做的一些工作。
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1 实验部分
1.1 原理 多糖在80%乙醇溶液中沉淀，与单糖和低聚糖及甙类物质分离。沉淀用水溶解后再用碱性二阶铜试剂选择性地从其它高分子物质中沉淀出具有葡聚糖结构的多糖，苯酚-硫酸可与其中的多糖起显色反应，生成橙黄色化合物，可于485nm处比色，定量。
1.2 仪器与试剂 80%乙醇溶液(v/v);10%氢氧化钠溶液(w/v);硫酸溶液(100ml/L)。铜储备液:称取0.6g CuSO 4 ·5H 2 O，6.0g柠檬酸钠，加水溶解后定容至200ml。铜试剂溶液:取水50ml，加入50ml铜储备液，混匀后加入12.5g固体无水硫酸钠并使之溶解。洗涤液:取水50ml，加入10ml铜储备液，10ml氢氧化钠溶液，混匀(临用现配)。苯酚溶液(60g/L):称取精制苯酚6.0g，加水溶解并定容至100ml，置于冰箱中保存。葡聚糖标准储备液:精确称取分子量50000，干燥至恒重的葡聚糖0.5000g，加水溶解，并定容至100ml，置于冰箱中保存，此溶液每毫升含5.00mg葡聚糖，用时取适量稀释至每毫升含葡聚糖0.100mg，为标准使用液。
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1.3 实验方法
1.3.1 工作曲线绘制 分别吸取葡聚糖标准使用液0;0.3;0.6;0.9;1.2;1.5;2.0ml(相当于葡聚糖0;0.03;0.06;0.09;0.12;0.15;0.20mg)置于25ml刻度比色管中，精确补水至2.0ml，加入1.0ml苯酚溶液，10.0ml浓硫酸，混匀，于沸水浴中煮沸5min，取出冷却后静置15min，用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。
1.3.2 样品提取 称取混合均匀的枸杞胶囊2.0g置于50ml比色管中，加水40ml，于沸水浴中加热2h，冷却至室温后用水定容至50.0ml，过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀多糖(枸杞口服液则直接吸取2.0ml样品，按1.3.3操作)。
1.3.3 沉淀多糖 精密吸取2.0ml1.3.2项下的滤液，置于10.0ml离心管中，加入无水乙醇8.0ml，搅拌均匀后以3000r/min离心5min，弃去上清夜，沉淀用10ml80%乙醇溶液洗涤后离心，如此操作2次。用2ml水溶解沉淀，混匀，供沉淀葡聚糖。
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1.3.4 沉淀葡聚糖 在1.3.3项溶液中加入100g/L氢氧化钠溶液2.0ml，加2.0ml铜试剂溶液，于沸水浴中煮沸2min，冷却后以3000r/min离心5min，弃去上层清液，沉淀用洗涤液洗涤，离心后弃去上清液，如此重复2次。
1.3.5 将上述沉淀用100ml/L硫酸溶液溶解，视沉淀物的量决定溶解定容量。
1.3.6 吸取1.3.5样品2.0ml(视样品含量而定)置于25.0ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10.0ml硫酸，混匀，于沸水浴中煮沸5min，冷却至室温后静置15min，再用分光光度计于485nm波长处，以试剂空白为零点，1cm比色皿测吸光度，从标准工作曲线计算多糖含量。
2 结果与讨论
2.1 工作曲线 按照上法操作，在0～0.2mg范围内曲线呈良好线性关系，曲线线性回归方程为:Y=-2.8×10 -3 +4.342XR=0.9996。
, 百拇医药
2.2 精密度 准确称取6份质量相近混匀的枸杞口服液，按照上述方法进行测定，结果见表1。
表1 方法的精密度 (略)
2.3 回收率的测定 根据上述方法进行了加标实验，结果所得平均回收率在90.1%～95.4%之间，说明该方法是可靠稳定的。
2.4 显色条件的探讨 多糖与苯酚-硫酸显色时，硫酸用量与显色时间较为重要，实验结果表明:硫酸用量为10ml最佳;显色时间为:煮沸5min，冷却至室温后静置15min，此时显色最为稳定。
参考文献
1 罗琼，阎俊，李瑾玮，等.枸杞多糖纯品与粗品免疫活性的比较.中国公共卫生，1999，15(4):292-294.
2 王建华，王汉中，张民，等.枸杞多糖延缓衰老的作用.营养学 报，2002，24(2):189-192.
, 百拇医药
3 曹广文，杨文国，杜平，等.枸杞多糖联合LAK/IL-2疗法对75例晚期肿瘤的疗效观察.中华肿瘤杂志，1994，16(6):428-431.
4 丁民谋，王裕发，邵力.红宝联合干扰素治疗慢性乙型活动性肝炎的研究.中国中西医结合消化杂志，1995，3(2):84-86.
5 薛立文，李以暖.枸杞子的营养和保健功能.广东微量元素科学，2000，7(6):1-4.
6 宋炳生，杨玉龙.枸杞多糖的免疫调节作用.药学实践杂志，1997，15(2):69-72.
7 童进文，胡庆和，高天顺，等.枸杞多糖的药理学研究进展.中国中医基础医学杂志，1998，4(5):54-56.
8 王建华，汪建民，李林，等.枸杞多糖LBP2a的分离、纯化与结构特征.食品科学，2002，23(6):44-48.
, http://www.100md.com
9 赵春久，李荣芷，何云庆，等.枸杞多糖的化学研究.北京医科大学学报，1997，29(3):231-233.
10 何进，张声华.枸杞多糖的分离纯化及组成研究.中国药学杂志，1996，31(12):716-720.
11 周蓉，齐莉，王雅芬，等.HPCE法分离和鉴定枸杞多糖中单糖.药物分析杂志，1998，18(增刊):323-324.
12 段昌令，乔善义，王乃利，等.枸杞子活性多糖的测定.药学学报，2001，36(3):196-199.
13 钱士辉.枸杞多糖注射中间体总多糖含量测定.中国野生植物资源，1995，(2):43-44.
作者单位:350001福建省疾病预防控制中心
(收稿日期:2004-01-15)
(编辑 罗彬), http://www.100md.com