人表皮细胞在牛胶原膜粘附、生长及分化的研究
【摘要】 目的 在牛胶原膜中植入胎儿表皮细胞和成纤维细胞，构建人工复合皮替代物，以研究细胞的粘附、生长、分化及真表皮间的相互作用。方法 (1)酶消化法培养胎儿表皮细胞和成纤维细胞;(2)制备人工复合皮，接种表皮细胞后于不同时间通过HE染色和扫描电镜观察细胞的形态和数量变化;(3)透射电镜观察该复合皮中细胞的结构;(4)裸鼠移植试验验证该复合皮的作用。结果 (1)该人工复合皮具有一定的弹性，可出现较明显的细胞增殖，未见人工复合皮收缩现象。(2)HE染色和扫描电镜下可见随培养时间的延长，成纤维细胞和表皮细胞逐渐增多，表皮细胞可发生分化，并逐渐分层。(3)透射电镜下见成纤维细胞和表皮细胞功能活跃。(4)裸鼠移植试验证实该人工皮可起到覆盖创面防止感染的作用。结论 该人工复合皮基本具备了正常皮肤的结构和功能，可作为移植物覆盖全层皮肤损伤。
关键词 表皮细胞 胶原膜 人工复合皮
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2004)06-0481-04
, 百拇医药
Biologic attachment，growth，and differentiation of cultured fetal epidermal
keratinocytes on a bovine collagen membrane
Liu Jie，Zhang Jiangang，Zhang Yan，et al.
Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850.
【Abstract】 Objective To transplant the cultured fetal epidermal keratinocytes and fibroblasts as the seeding cells into the bovine collagen membrane in order to investigate the attachment，growth，defferentiation，and the funcˉtion between the epidermis and the dermis.Methods 1.Dispase and trypsin were used as the isolation medium to get the keratinocytes and fibroblasts;2.Prepare for composite skin，the change of cells’configuration and quantity were observed by H.E staining and scanning electron microscope(SEM);3.The construction features of the cells in the skin were observed by transmission electron microscope(TEM);4.Function of the skin was detected by nude mice transplantation test.Results 1.The artificial composite skin was elastic，proliferation of the cells could be clearly observed，and contraction of the artificial skin was not observed.2.The number of keratinocytes and fibroblasts is inˉcreasing gradually，the keratinocytes grow and stratify to form a continuous epithelial layer over the surface of the derˉmal membranes.3.The fibroblasts and keratinocytes in the membrane had active biologic function by transmission electron microscope.4.The formation of biologic attachments in vivo between the artificial skin and the wound bed alˉlowsthe skin to be applied to overjet wound bed and prevent infection.Conclusion The composite skin made by bovine collagen membrane possessed simliar structure and function to the normal skin，and it could be applied to split-thickness skin as an analogy.
, 百拇医药
Key words keratinocytes collagen membrane artificial composite skin
理想的皮肤代用品应该是能够将所缺失的真皮和表皮层同时修复，因为这两种成分不仅影响皮肤的功能和外形，而且这两种成分具有相互影响的机制，促进彼此的分化和功能恢复。因此，在皮肤组织工程产品中，人工复合皮无疑具有最广阔的应用前景。该皮肤组织工程产品主要包括两种细胞成分，即位于表皮层的角朊细胞和位于真皮层的成纤维细胞。
迄今利用牛胶原膜和胎儿种子细胞构建的人工复合皮尚无文献报道。本研究在体外将胎儿成纤维细胞和表皮细胞种植于牛胶原膜上，重点对表皮细胞的粘附、生长和 分化特点进行研究，并通过裸鼠移植试验验证了该人工皮肤对机体的促进愈合作用。
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养基、MCDB153培养基、分散酶、胰蛋白酶、胶原酶、小牛血清、hnEGF、BPE等均购自Gibico公司，胶原膜按本实验室建立方法制备 [1] 。
, 百拇医药
1.2 胎儿成纤维细胞培养 按本实验室建立的酶消化法培养 [2] ，并进行传代，取其3～4代细胞制备细胞悬液。
1.3 胎儿表皮细胞(Keratinocyte，KC)培养 按本实验室建立的无血清培养法进行 [3] ，取第3～4代细胞制备细胞悬液。
1.4 人工复合皮的制备 经Co 60 γ射线消毒胶原膜，用双抗(青霉素1×10 5 U/L、链霉素100mg/L)D-Hanks液彻底冲洗后，加入DMEM培养液浸泡24h，将传代培养的成纤维细胞以3×10 5 /cm 2 密度接种于胶原膜一侧(3×10 8 /L每皿接种3ml，胶原膜切成直径为2cm大小的圆形)，37℃，5%CO 2 条件下培养，液面下培养1周后，换为无血清培养液培养1天，反转网架180°，接种表皮细胞，密度为3×10 5 /cm 2 ，在无血清培养液中培养，培养1周后，改为气液面培养。
, 百拇医药
1.5 HE染色 KC种植后1～3周，每周用中性福尔马林液固定，常规组织切片，HE染色，镜下观察。
1.6 扫描显微镜(Scanning electron microscope，SEM)观察 KC种植后1～3周，按照常规方法每周利用SEM观察成纤维细胞和KC在胶原膜表面两侧的生长状况，采用仪器为HITACHI S-450型。
1.7 透射显微镜(transmission electron microscope，TEM)观察 KC种植后3周，按照常规方法利用透射电镜观察，采用仪器为Philips EM400T。
1.8 动物移植实验 取4～6周龄裸鼠12只，无菌条件下背部皮肤制作圆形伤口，直径1.5cm，对照组6只，以油纱布加压包扎，试验组6只，以人工复合皮覆盖，外加油纱布，加压包扎。观察动物大体情况及伤口愈合情况。
, 百拇医药 2 结果
2.1 倒置显微镜下观察 种植KC之前，可见到种植成纤维细胞一侧，细胞呈梭形贴附于胶原膜上，种植CK并改为无血清培养法后，需翻转支架才可见到成纤维细胞，为减少污染机会，故未观察。表皮面也可观察到细胞的生长和增殖状况。
2.2 扫描显微镜结果 成纤维细胞面:种植成纤维细胞后，细胞呈梭形贴附于胶原膜上，且在1周时，基本长满该侧，种植KC并改为无血清培养后，成纤维细胞的增殖速度较在DMEM培养基中的速度变慢，共培养后1周，成纤维细胞可长满一侧(图1)。
表皮细胞面:接种KC后1天，即可见到呈圆形的KC粘附于基质网架上(图2)，共培养后1周，KC可长满该侧，实现气液面培养后2周，可见到KC分层现象，底部KC呈多角形互相融合在一起，而上部细胞为圆形(图3)。
2.3 HE染色和TEM结果 共培养后第1周，角朊细胞连成片，扁平样贴附在基质网架上。表面有1～2层KC，细胞间存在桥粒连接，细胞内可见张力细丝和膜被颗粒。真皮网孔较大，未见成纤维细胞(图4)。
, 百拇医药
共培养后第2周，表皮呈3～4层细胞，表面有少量角质样物质。电镜可见真皮层成纤维细胞贴附于网架上，周围可见细胞外基质(图5)。
第3周，光镜下可见KC层数明显增多，出现典型的分化趋势。由基底层向角质层发育过程中，细胞由矮柱状逐渐变成扁平状。越接近人工皮表面，细胞变得越扁平，KC最终分化形成角质层。角朊细胞内可见聚集成束的张力微丝束。真皮部分中，有较多的成纤维细胞进入。细胞外基质逐渐增多(图6)。
2.4 裸鼠移植试验 移植后2周内，各组动物存活，且可见到植皮组的人工复合皮略呈红色，并紧密贴附于伤口，揭开后可见到鲜红色的肉芽组织，对照组伤口均较植皮组大，镜下见复合皮与伤口结合紧密，并有部分细胞长入胶原支架中。移植后4周，复合皮创面已基本愈合，平均愈合时间为18.1天，而对照组平均愈合时间为24.3天，差异具有显著性。
图1 略
, 百拇医药
图2 略
图3 略
图4 略
图5 略
图6 略
3 讨论
目前最成熟的人工复合皮肤是美国Organo genesis公司生产的Apligraf(以下叫Graftskin TM )，是体外培养的同种异体重组皮肤。它是一种包含异体上皮细胞和成纤维细胞的双层组织工程皮肤，以胶原凝胶作为支架，其细胞成分均来源于新生儿包皮，经体外培养所得，移植后受体接受率达100%。该代用品1997年在加拿大已获准进入市场，正在向FDA申请进入美国市场。该产品对293例患有静脉性溃疡的病人应用，在愈合时间上，实验组平均为92天，对照组则为190天，差异有显著性 [4] 。
, http://www.100md.com
但这种人工复合皮具有如下缺点:①胶原凝胶抵抗胶原酶降解能力差;②脆性大，操作较困难;③胶原凝胶工业生产过程较复杂。
皮肤创伤愈合过程中创面的修复涉及一系列细胞与分子反应过程，主要分为三个阶段 [5] ，即:①止血和炎性反应 阶段;②增殖阶段:细胞增殖阶段主要表现为角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞的迁移增殖分化，达到再上皮化，形成肉芽组织，此阶段又可包括三个互相作用过程即:角质细胞与再上皮化;内皮细胞与新生血管化;成纤维细胞与肉芽组织形成;③成熟和重塑阶段。由以上创伤愈合过程可见，在创面修复早期重要的参与细胞既包括成纤维细胞又包括KC，其中成纤维细胞不断生长、增殖，不断的合成、分泌胶原，并通过胶原酶对胶原结构进行重塑，而KC连接紧密，防止体液过度丢失，并促进重新血管化，因此，KC和成纤维细胞是否共同存在，在一定程度上决定了创面愈合的速度与质量。
在创面修复过程中，由于胶原分子结构中含有大量的双羧基及双氨基氨基酸和半碳水化合物，适于细胞粘附，因此胶原的沉积对修复细胞尤其是KC、成纤维细胞的粘附、迁移有重要作用 [6，7] 。
, 百拇医药
因此，利用胶原作为支架，构建一种含有KC和成纤维细胞两种细胞成分的人工复合皮具有重要的实际意义。
迄今为止，国内外仅有利用胶原凝胶构建的人工复合皮实现了商品化，但由于其固有的缺点，使用受到了限制。我们利用自行研制的胶原膜构建了人工复合皮，并对其性质进行了初步研究。
SEM、HE染色和TEM结果显示:所研制的人工复合皮随着培养时间延长，KC增殖迅速，逐渐形成单层细胞粘附于基质网架上，进行气液面培养后，KC逐渐向正常表皮结构分化，并出现角质层，最后经过3周培养，可出现具有基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层的典型结构，而成纤维细胞也不断增殖，长满胶原膜的一侧，并逐渐向胶原膜内部迁移。
裸鼠移植试验虽不甚理想，但已明示该皮肤与伤口粘附紧密，且有血管化趋势。由于裸鼠免疫力基本丧失，抵抗感染能力极差，在以后实验中需严格注意手术中的无菌操作。
, http://www.100md.com
通过以上结果可以看出，该体外重组皮肤基本具备了正常皮肤的结构，受Apligraf启发 [8] ，我们采用胎儿细胞作为种子细胞，免疫原性较低，并且具有可立即移植，不需随后的皮肤移植，易于操作等优点。相信经过进一步对其结构和功能的改进，有望为临床提供一种新型的永久性的皮肤覆盖物。
参考文献
1 刘杰，王德文，彭瑞云，等.人工胶原膜对大鼠皮肤创伤促愈作用的研究.军事医学科学院院刊，2001，25(4):280-282.
2 刘杰，崔雪梅，张燕，等.利用不同支架材料构建人工真皮的研究.中国修复重建外科杂志，2003，17(2):104-106.
3 刘杰，王德文，徐龙河，等.人表皮细胞分离培养最佳条件的选择.细胞与分子免疫学杂志，2002，18(3):298-300.
, 百拇医药
4 Mak VH，Wh Cumpstone，Kennedy A H，et al.Barrier functin of huˉman kerati onocyte cultures grown at the air-liquid interface.J Invest Dermatol，1991，96:323-327.
5 Diegelmann RF.Cell cultrue and biochemical aspects of normal and abˉnormal wound healing:Anover view.J Urol，1997，157(2):298-302.
6 Reginer M，Prunieras M，Woodley D M.Growth and differentiation of adult human epidermal cells on dermal substrates.Ront Matrix Biol，1981，9:4-35.
, http://www.100md.com
7 Boyce ST，Hansborngh J F.Biologic attachment，growth，and differenˉtiation of cultrued human epidermal keratinocytes on a graftable collagen and chonclroitin-6-sulfate substrate.Surgery，1988，103(4):421-431.
8 Raymund E，HORCH，Markus debus，et al.Cultrued human kerˉ atinocytes on Type I collagen Membranes to Reconstitute the epidermis.Tissue engineering，2000，6(1):53-67.
作者单位:1 100850军事医学科学院放射医学研究所
2 100016中国皮革和制鞋工业研究院
(收稿日期:2004-01-02)
(编辑 晓勇), 百拇医药
关键词 表皮细胞 胶原膜 人工复合皮
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2004)06-0481-04
, 百拇医药
Biologic attachment，growth，and differentiation of cultured fetal epidermal
keratinocytes on a bovine collagen membrane
Liu Jie，Zhang Jiangang，Zhang Yan，et al.
Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850.
【Abstract】 Objective To transplant the cultured fetal epidermal keratinocytes and fibroblasts as the seeding cells into the bovine collagen membrane in order to investigate the attachment，growth，defferentiation，and the funcˉtion between the epidermis and the dermis.Methods 1.Dispase and trypsin were used as the isolation medium to get the keratinocytes and fibroblasts;2.Prepare for composite skin，the change of cells’configuration and quantity were observed by H.E staining and scanning electron microscope(SEM);3.The construction features of the cells in the skin were observed by transmission electron microscope(TEM);4.Function of the skin was detected by nude mice transplantation test.Results 1.The artificial composite skin was elastic，proliferation of the cells could be clearly observed，and contraction of the artificial skin was not observed.2.The number of keratinocytes and fibroblasts is inˉcreasing gradually，the keratinocytes grow and stratify to form a continuous epithelial layer over the surface of the derˉmal membranes.3.The fibroblasts and keratinocytes in the membrane had active biologic function by transmission electron microscope.4.The formation of biologic attachments in vivo between the artificial skin and the wound bed alˉlowsthe skin to be applied to overjet wound bed and prevent infection.Conclusion The composite skin made by bovine collagen membrane possessed simliar structure and function to the normal skin，and it could be applied to split-thickness skin as an analogy.
, 百拇医药
Key words keratinocytes collagen membrane artificial composite skin
理想的皮肤代用品应该是能够将所缺失的真皮和表皮层同时修复，因为这两种成分不仅影响皮肤的功能和外形，而且这两种成分具有相互影响的机制，促进彼此的分化和功能恢复。因此，在皮肤组织工程产品中，人工复合皮无疑具有最广阔的应用前景。该皮肤组织工程产品主要包括两种细胞成分，即位于表皮层的角朊细胞和位于真皮层的成纤维细胞。
迄今利用牛胶原膜和胎儿种子细胞构建的人工复合皮尚无文献报道。本研究在体外将胎儿成纤维细胞和表皮细胞种植于牛胶原膜上，重点对表皮细胞的粘附、生长和 分化特点进行研究，并通过裸鼠移植试验验证了该人工皮肤对机体的促进愈合作用。
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养基、MCDB153培养基、分散酶、胰蛋白酶、胶原酶、小牛血清、hnEGF、BPE等均购自Gibico公司，胶原膜按本实验室建立方法制备 [1] 。
, 百拇医药
1.2 胎儿成纤维细胞培养 按本实验室建立的酶消化法培养 [2] ，并进行传代，取其3～4代细胞制备细胞悬液。
1.3 胎儿表皮细胞(Keratinocyte，KC)培养 按本实验室建立的无血清培养法进行 [3] ，取第3～4代细胞制备细胞悬液。
1.4 人工复合皮的制备 经Co 60 γ射线消毒胶原膜，用双抗(青霉素1×10 5 U/L、链霉素100mg/L)D-Hanks液彻底冲洗后，加入DMEM培养液浸泡24h，将传代培养的成纤维细胞以3×10 5 /cm 2 密度接种于胶原膜一侧(3×10 8 /L每皿接种3ml，胶原膜切成直径为2cm大小的圆形)，37℃，5%CO 2 条件下培养，液面下培养1周后，换为无血清培养液培养1天，反转网架180°，接种表皮细胞，密度为3×10 5 /cm 2 ，在无血清培养液中培养，培养1周后，改为气液面培养。
, 百拇医药
1.5 HE染色 KC种植后1～3周，每周用中性福尔马林液固定，常规组织切片，HE染色，镜下观察。
1.6 扫描显微镜(Scanning electron microscope，SEM)观察 KC种植后1～3周，按照常规方法每周利用SEM观察成纤维细胞和KC在胶原膜表面两侧的生长状况，采用仪器为HITACHI S-450型。
1.7 透射显微镜(transmission electron microscope，TEM)观察 KC种植后3周，按照常规方法利用透射电镜观察，采用仪器为Philips EM400T。
1.8 动物移植实验 取4～6周龄裸鼠12只，无菌条件下背部皮肤制作圆形伤口，直径1.5cm，对照组6只，以油纱布加压包扎，试验组6只，以人工复合皮覆盖，外加油纱布，加压包扎。观察动物大体情况及伤口愈合情况。
, 百拇医药 2 结果
2.1 倒置显微镜下观察 种植KC之前，可见到种植成纤维细胞一侧，细胞呈梭形贴附于胶原膜上，种植CK并改为无血清培养法后，需翻转支架才可见到成纤维细胞，为减少污染机会，故未观察。表皮面也可观察到细胞的生长和增殖状况。
2.2 扫描显微镜结果 成纤维细胞面:种植成纤维细胞后，细胞呈梭形贴附于胶原膜上，且在1周时，基本长满该侧，种植KC并改为无血清培养后，成纤维细胞的增殖速度较在DMEM培养基中的速度变慢，共培养后1周，成纤维细胞可长满一侧(图1)。
表皮细胞面:接种KC后1天，即可见到呈圆形的KC粘附于基质网架上(图2)，共培养后1周，KC可长满该侧，实现气液面培养后2周，可见到KC分层现象，底部KC呈多角形互相融合在一起，而上部细胞为圆形(图3)。
2.3 HE染色和TEM结果 共培养后第1周，角朊细胞连成片，扁平样贴附在基质网架上。表面有1～2层KC，细胞间存在桥粒连接，细胞内可见张力细丝和膜被颗粒。真皮网孔较大，未见成纤维细胞(图4)。
, 百拇医药
共培养后第2周，表皮呈3～4层细胞，表面有少量角质样物质。电镜可见真皮层成纤维细胞贴附于网架上，周围可见细胞外基质(图5)。
第3周，光镜下可见KC层数明显增多，出现典型的分化趋势。由基底层向角质层发育过程中，细胞由矮柱状逐渐变成扁平状。越接近人工皮表面，细胞变得越扁平，KC最终分化形成角质层。角朊细胞内可见聚集成束的张力微丝束。真皮部分中，有较多的成纤维细胞进入。细胞外基质逐渐增多(图6)。
2.4 裸鼠移植试验 移植后2周内，各组动物存活，且可见到植皮组的人工复合皮略呈红色，并紧密贴附于伤口，揭开后可见到鲜红色的肉芽组织，对照组伤口均较植皮组大，镜下见复合皮与伤口结合紧密，并有部分细胞长入胶原支架中。移植后4周，复合皮创面已基本愈合，平均愈合时间为18.1天，而对照组平均愈合时间为24.3天，差异具有显著性。
图1 略
, 百拇医药
图2 略
图3 略
图4 略
图5 略
图6 略
3 讨论
目前最成熟的人工复合皮肤是美国Organo genesis公司生产的Apligraf(以下叫Graftskin TM )，是体外培养的同种异体重组皮肤。它是一种包含异体上皮细胞和成纤维细胞的双层组织工程皮肤，以胶原凝胶作为支架，其细胞成分均来源于新生儿包皮，经体外培养所得，移植后受体接受率达100%。该代用品1997年在加拿大已获准进入市场，正在向FDA申请进入美国市场。该产品对293例患有静脉性溃疡的病人应用，在愈合时间上，实验组平均为92天，对照组则为190天，差异有显著性 [4] 。
, http://www.100md.com
但这种人工复合皮具有如下缺点:①胶原凝胶抵抗胶原酶降解能力差;②脆性大，操作较困难;③胶原凝胶工业生产过程较复杂。
皮肤创伤愈合过程中创面的修复涉及一系列细胞与分子反应过程，主要分为三个阶段 [5] ，即:①止血和炎性反应 阶段;②增殖阶段:细胞增殖阶段主要表现为角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞的迁移增殖分化，达到再上皮化，形成肉芽组织，此阶段又可包括三个互相作用过程即:角质细胞与再上皮化;内皮细胞与新生血管化;成纤维细胞与肉芽组织形成;③成熟和重塑阶段。由以上创伤愈合过程可见，在创面修复早期重要的参与细胞既包括成纤维细胞又包括KC，其中成纤维细胞不断生长、增殖，不断的合成、分泌胶原，并通过胶原酶对胶原结构进行重塑，而KC连接紧密，防止体液过度丢失，并促进重新血管化，因此，KC和成纤维细胞是否共同存在，在一定程度上决定了创面愈合的速度与质量。
在创面修复过程中，由于胶原分子结构中含有大量的双羧基及双氨基氨基酸和半碳水化合物，适于细胞粘附，因此胶原的沉积对修复细胞尤其是KC、成纤维细胞的粘附、迁移有重要作用 [6，7] 。
, 百拇医药
因此，利用胶原作为支架，构建一种含有KC和成纤维细胞两种细胞成分的人工复合皮具有重要的实际意义。
迄今为止，国内外仅有利用胶原凝胶构建的人工复合皮实现了商品化，但由于其固有的缺点，使用受到了限制。我们利用自行研制的胶原膜构建了人工复合皮，并对其性质进行了初步研究。
SEM、HE染色和TEM结果显示:所研制的人工复合皮随着培养时间延长，KC增殖迅速，逐渐形成单层细胞粘附于基质网架上，进行气液面培养后，KC逐渐向正常表皮结构分化，并出现角质层，最后经过3周培养，可出现具有基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层的典型结构，而成纤维细胞也不断增殖，长满胶原膜的一侧，并逐渐向胶原膜内部迁移。
裸鼠移植试验虽不甚理想，但已明示该皮肤与伤口粘附紧密，且有血管化趋势。由于裸鼠免疫力基本丧失，抵抗感染能力极差，在以后实验中需严格注意手术中的无菌操作。
, http://www.100md.com
通过以上结果可以看出，该体外重组皮肤基本具备了正常皮肤的结构，受Apligraf启发 [8] ，我们采用胎儿细胞作为种子细胞，免疫原性较低，并且具有可立即移植，不需随后的皮肤移植，易于操作等优点。相信经过进一步对其结构和功能的改进，有望为临床提供一种新型的永久性的皮肤覆盖物。
参考文献
1 刘杰，王德文，彭瑞云，等.人工胶原膜对大鼠皮肤创伤促愈作用的研究.军事医学科学院院刊，2001，25(4):280-282.
2 刘杰，崔雪梅，张燕，等.利用不同支架材料构建人工真皮的研究.中国修复重建外科杂志，2003，17(2):104-106.
3 刘杰，王德文，徐龙河，等.人表皮细胞分离培养最佳条件的选择.细胞与分子免疫学杂志，2002，18(3):298-300.
, 百拇医药
4 Mak VH，Wh Cumpstone，Kennedy A H，et al.Barrier functin of huˉman kerati onocyte cultures grown at the air-liquid interface.J Invest Dermatol，1991，96:323-327.
5 Diegelmann RF.Cell cultrue and biochemical aspects of normal and abˉnormal wound healing:Anover view.J Urol，1997，157(2):298-302.
6 Reginer M，Prunieras M，Woodley D M.Growth and differentiation of adult human epidermal cells on dermal substrates.Ront Matrix Biol，1981，9:4-35.
, http://www.100md.com
7 Boyce ST，Hansborngh J F.Biologic attachment，growth，and differenˉtiation of cultrued human epidermal keratinocytes on a graftable collagen and chonclroitin-6-sulfate substrate.Surgery，1988，103(4):421-431.
8 Raymund E，HORCH，Markus debus，et al.Cultrued human kerˉ atinocytes on Type I collagen Membranes to Reconstitute the epidermis.Tissue engineering，2000，6(1):53-67.
作者单位:1 100850军事医学科学院放射医学研究所
2 100016中国皮革和制鞋工业研究院
(收稿日期:2004-01-02)
(编辑 晓勇), 百拇医药