谷氨酸钾注射液细菌内毒素检查法的可行性研究
【摘要】 目的 建立谷氨酸钾注射液细菌内毒素检查法。方法 按《中国药典》(二部)2000年版附录细菌内毒素检查法。结果 谷氨酸钾注射液在稀释至26.2mg/ml时检测无干扰因素影响，选用标示灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂检查细菌内毒素的方法可行、有效。结论可以用细菌内毒素法替代家兔法作为日常检测谷氨酸钾注射液的热原检查。
关键词 谷氨酸钾注射液 细菌内毒素 鲎试剂 干扰试验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)09-0810-03
The research on the feasibility for the bacterial endotoxin
inspection method of potassium glutamate injection
, http://www.100md.com
Shen Wei，Zhao Yuzhen
Shaanxi Provincial Institute of Drug Control，Xi′an710061.
【Abstract】 Objective To establish the endltoxin test method of PotassiumGlutamate Injection.Methods To inspect bacterial endotoxin according to the method in addenda of China Pharmacopoeia(second part，2000ediˉtion).Results Neither inhibition nor enhancement was found after the sample was diluted to26.2mg/ml so，the method of choosing tachypleus amebocyte lysate which sensitivity was labelled as0.25EU/ml to exdotoxin is capable and efficient.Conclusion Forroutine pyrogen test of Potassium Glutamate Injection，the domestic rabbit method can be replaced by the bacterial endotoxin inspection method.
, 百拇医药
Key words potassium glutamate injection bacterial endotoxin tachypleus a mebocyte lysate interference exˉperiment
谷氨酸钾注射液在临床上主要用于以血氨增高为主的肝性脑病，目前该品种的热原检查仍使用家兔法 [1] ，但家兔法不易标准化，且重复性、灵敏度差，费用高、费时。因此，为了更好的控制产品质量，更安全地用于临床，我们用凝胶法和动态浊度法对谷氨酸钾注射液中细菌内毒素检查法进行可行性研究。
1 材料
鲎试剂(批号:20030308)灵敏度:0.5EU/ml，规格:0.1ml/支，湛江海洋生物制品厂。鲎试剂(批号:20030409)灵敏度:0.25EU/ml，规格:0.1ml/支，湛江海洋生物制品厂。鲎试剂(批号:0305062)灵敏度:0.25EU/ml，规格:0.1ml/支，湛江安度斯生物有限公司。鲎试剂(批号:021014)灵敏度:0.5EU/ml，规格:0.1ml/支，福州新北生化工业有限公司。鲎试剂(批号:030609)灵敏度:0.25EU/ml，规格:0.1ml/支，福州新北生化工业有限公司。鲎试剂(批号:031027)灵敏度:0.06EU/ml，规格:1.2ml/支，湛江海洋生物制品厂。细菌内毒素工作标准品(批号:2002—11)，规格:100EU/支，中国药品生物制品检定所细菌。内毒素检查用水(批号:20030517)，规格:5ml/支，湛江海洋生物制品厂。谷氨酸钾注射液(批号:001004、021201、030401)规格:20ml:6.3g，上海旭东海普药业有限公司。BET-32B细菌内毒素测定仪(编号:0-14-088)，天津大学无线电厂。
, http://www.100md.com
2 方法和结果
2.1 细菌内毒素限值(L)的确定 由于USP、BP等国外药典均未收载本品，根据L=K/M，本品为静脉给药K=5EU/(kg·h)，本品临床人最大用量为25.2g，计算本品内毒素限值为L=0.012EU/mg。
2.2 凝胶法检查
2.2.1 鲎试剂灵敏度复核 按《中国药典》(二部)2000年版附录操作。依据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，用BET水分别将CSE稀释成2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ4个浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管，同时用BET水做2支阴性对照管。按下式计算鲎试剂灵敏度的测试值(λ c ):λ c =log -1 (Σx/4);X为反应终点内毒素浓度的对数值，试验结果见表1。
2.2.2 供试品干扰预试验 取原液、157.5mg/ml，78.8mg/ml、52.5mg/ml供试品将细菌内毒素工作标准品稀释成1.0、0.125EU/ml2种浓度的内毒素溶液，与鲎试剂(0.5EU/ml)进行反应，用26.2mg/ml供试品将细菌内毒素工作标准品稀释成0.5、0.06EU/ml2种浓度的内毒素溶液，与鲎试剂(0.25EU/ml)进行反应，每个浓度平行做2支。另取原液、157.5mg/ml、78.8mg/ml、52.5mg/ml、26.2mg/ml供试品各做2支样品管，同时做阳性、阴性对照，置(37±1)℃水浴中，保温(60±2)min。试验结果见表2
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表1 5批鲎试剂灵敏度复核结果鲎试剂批号
表2 供试品干扰预试验结果
表3 供试品干扰试验结果
表4 供试品干扰试验结果
2.2.4供试品内毒素检测 采用本法对3批样品进行细菌内毒素检查。试验结果见表5。
表5 供试品细菌内毒素检查结果
2.3 动态浊度法检查 将谷氨酸钾注射液用内毒素检查用水稀释为12倍溶液，记为Ai液，同时另取2管，进行同样倍数稀释，但在稀释液中添加中点浓度为M(0.25EU/ml)的细菌内毒素标准溶液，作为样品添加内毒素阳性对照管，记为Bi液，分别取上述各液0.1ml加入预先加有0.1mlTAL试剂的反应管内，混匀立即插入BET-32B细菌内毒素测定仪内进行检测，其中每一浓度重复2管，计算平均回收率(%)=(Bi液内毒素值-Ai液内毒素值)/M×100%。结果见表6。其中内毒素回归方程:log T=2.37692-0.30779 logC r=-0.9928
, 百拇医药
表6 谷氨酸钾注射液动态浊度法检测结果
由表6试验结果发现:12倍稀释下的谷氨酸钾注射液添加内毒素平均回收率均在75%～125%范围内，表明样品稀释溶液在本试验条件下对TAL试剂反应无干扰影响，根据《中国药典》2000年版附录ⅪX F细菌内毒素定量测定法检测，按0.012EU/ml细菌内毒素限值对3批供试品进行内毒素定量检测，结果均为阴性。
3 结果
3.1 取本品适量，用细菌内毒素检查用水稀释后，按《中国药典》(2000年版二部)附录细菌内毒素检查法，本品每1mg含内毒素量不得过0.012EU。
3.2 从供试品的干扰试验结果可以判断，当供试品溶液浓度为26.2mg/ml时，稀释12倍时，干扰可以消除，因此进行细菌内毒素检查是可行的。
3.3 将3批样品进行细菌内毒素检查，结果符合规定。
, 百拇医药
4 讨论
4.1 谷氨酸钾注射液应用家兔法、凝胶法、动态浊度法3种方法检查，结果完全吻合，用凝胶法、动态浊度法试验简便、快捷，克服家兔动物实验个体差异大、耗时、浪费资源的缺点，可用于中间品及日常检测。
4.2 谷氨酸钾注射液稀释至52.5mg/ml时用福州新北生产的鲎试剂试验，其中1批有增强作用，为试验结果更加可靠，本品稀释至26.2mg/ml用3个厂家鲎试剂进行试验，均无干扰。所以根据上述试验，结果表明谷氨酸钾注射液的最小不干扰浓度为26.2mg/ml。因此，谷氨酸钾注射液用0.25EU/ml的TAL，在MVD条件下进行检验是可行的。
参考文献
1 中华人民共和国药典委员会.中国药典，2000年版.北京:化工工业出版社，2002，附录Ⅺ2002，86-87.
2 卫生部药典委员会.国内外药典(制剂)手册，北京:化学工业出版社，2002，552-571.
3 中国生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范，2000年版.北京:中国医药科技出版社，2000，389-398.
4 中国药品生物制品检定所.2002年药典“试验技术指导原则”.
(收稿日期:2004-03-26)
(编辑黄 杰), 百拇医药
关键词 谷氨酸钾注射液 细菌内毒素 鲎试剂 干扰试验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)09-0810-03
The research on the feasibility for the bacterial endotoxin
inspection method of potassium glutamate injection
, http://www.100md.com
Shen Wei，Zhao Yuzhen
Shaanxi Provincial Institute of Drug Control，Xi′an710061.
【Abstract】 Objective To establish the endltoxin test method of PotassiumGlutamate Injection.Methods To inspect bacterial endotoxin according to the method in addenda of China Pharmacopoeia(second part，2000ediˉtion).Results Neither inhibition nor enhancement was found after the sample was diluted to26.2mg/ml so，the method of choosing tachypleus amebocyte lysate which sensitivity was labelled as0.25EU/ml to exdotoxin is capable and efficient.Conclusion Forroutine pyrogen test of Potassium Glutamate Injection，the domestic rabbit method can be replaced by the bacterial endotoxin inspection method.
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Key words potassium glutamate injection bacterial endotoxin tachypleus a mebocyte lysate interference exˉperiment
谷氨酸钾注射液在临床上主要用于以血氨增高为主的肝性脑病，目前该品种的热原检查仍使用家兔法 [1] ，但家兔法不易标准化，且重复性、灵敏度差，费用高、费时。因此，为了更好的控制产品质量，更安全地用于临床，我们用凝胶法和动态浊度法对谷氨酸钾注射液中细菌内毒素检查法进行可行性研究。
1 材料
鲎试剂(批号:20030308)灵敏度:0.5EU/ml，规格:0.1ml/支，湛江海洋生物制品厂。鲎试剂(批号:20030409)灵敏度:0.25EU/ml，规格:0.1ml/支，湛江海洋生物制品厂。鲎试剂(批号:0305062)灵敏度:0.25EU/ml，规格:0.1ml/支，湛江安度斯生物有限公司。鲎试剂(批号:021014)灵敏度:0.5EU/ml，规格:0.1ml/支，福州新北生化工业有限公司。鲎试剂(批号:030609)灵敏度:0.25EU/ml，规格:0.1ml/支，福州新北生化工业有限公司。鲎试剂(批号:031027)灵敏度:0.06EU/ml，规格:1.2ml/支，湛江海洋生物制品厂。细菌内毒素工作标准品(批号:2002—11)，规格:100EU/支，中国药品生物制品检定所细菌。内毒素检查用水(批号:20030517)，规格:5ml/支，湛江海洋生物制品厂。谷氨酸钾注射液(批号:001004、021201、030401)规格:20ml:6.3g，上海旭东海普药业有限公司。BET-32B细菌内毒素测定仪(编号:0-14-088)，天津大学无线电厂。
, http://www.100md.com
2 方法和结果
2.1 细菌内毒素限值(L)的确定 由于USP、BP等国外药典均未收载本品，根据L=K/M，本品为静脉给药K=5EU/(kg·h)，本品临床人最大用量为25.2g，计算本品内毒素限值为L=0.012EU/mg。
2.2 凝胶法检查
2.2.1 鲎试剂灵敏度复核 按《中国药典》(二部)2000年版附录操作。依据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，用BET水分别将CSE稀释成2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ4个浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管，同时用BET水做2支阴性对照管。按下式计算鲎试剂灵敏度的测试值(λ c ):λ c =log -1 (Σx/4);X为反应终点内毒素浓度的对数值，试验结果见表1。
2.2.2 供试品干扰预试验 取原液、157.5mg/ml，78.8mg/ml、52.5mg/ml供试品将细菌内毒素工作标准品稀释成1.0、0.125EU/ml2种浓度的内毒素溶液，与鲎试剂(0.5EU/ml)进行反应，用26.2mg/ml供试品将细菌内毒素工作标准品稀释成0.5、0.06EU/ml2种浓度的内毒素溶液，与鲎试剂(0.25EU/ml)进行反应，每个浓度平行做2支。另取原液、157.5mg/ml、78.8mg/ml、52.5mg/ml、26.2mg/ml供试品各做2支样品管，同时做阳性、阴性对照，置(37±1)℃水浴中，保温(60±2)min。试验结果见表2
, 百拇医药
表1 5批鲎试剂灵敏度复核结果鲎试剂批号
表2 供试品干扰预试验结果
表3 供试品干扰试验结果
表4 供试品干扰试验结果
2.2.4供试品内毒素检测 采用本法对3批样品进行细菌内毒素检查。试验结果见表5。
表5 供试品细菌内毒素检查结果
2.3 动态浊度法检查 将谷氨酸钾注射液用内毒素检查用水稀释为12倍溶液，记为Ai液，同时另取2管，进行同样倍数稀释，但在稀释液中添加中点浓度为M(0.25EU/ml)的细菌内毒素标准溶液，作为样品添加内毒素阳性对照管，记为Bi液，分别取上述各液0.1ml加入预先加有0.1mlTAL试剂的反应管内，混匀立即插入BET-32B细菌内毒素测定仪内进行检测，其中每一浓度重复2管，计算平均回收率(%)=(Bi液内毒素值-Ai液内毒素值)/M×100%。结果见表6。其中内毒素回归方程:log T=2.37692-0.30779 logC r=-0.9928
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表6 谷氨酸钾注射液动态浊度法检测结果
由表6试验结果发现:12倍稀释下的谷氨酸钾注射液添加内毒素平均回收率均在75%～125%范围内，表明样品稀释溶液在本试验条件下对TAL试剂反应无干扰影响，根据《中国药典》2000年版附录ⅪX F细菌内毒素定量测定法检测，按0.012EU/ml细菌内毒素限值对3批供试品进行内毒素定量检测，结果均为阴性。
3 结果
3.1 取本品适量，用细菌内毒素检查用水稀释后，按《中国药典》(2000年版二部)附录细菌内毒素检查法，本品每1mg含内毒素量不得过0.012EU。
3.2 从供试品的干扰试验结果可以判断，当供试品溶液浓度为26.2mg/ml时，稀释12倍时，干扰可以消除，因此进行细菌内毒素检查是可行的。
3.3 将3批样品进行细菌内毒素检查，结果符合规定。
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4 讨论
4.1 谷氨酸钾注射液应用家兔法、凝胶法、动态浊度法3种方法检查，结果完全吻合，用凝胶法、动态浊度法试验简便、快捷，克服家兔动物实验个体差异大、耗时、浪费资源的缺点，可用于中间品及日常检测。
4.2 谷氨酸钾注射液稀释至52.5mg/ml时用福州新北生产的鲎试剂试验，其中1批有增强作用，为试验结果更加可靠，本品稀释至26.2mg/ml用3个厂家鲎试剂进行试验，均无干扰。所以根据上述试验，结果表明谷氨酸钾注射液的最小不干扰浓度为26.2mg/ml。因此，谷氨酸钾注射液用0.25EU/ml的TAL，在MVD条件下进行检验是可行的。
参考文献
1 中华人民共和国药典委员会.中国药典，2000年版.北京:化工工业出版社，2002，附录Ⅺ2002，86-87.
2 卫生部药典委员会.国内外药典(制剂)手册，北京:化学工业出版社，2002，552-571.
3 中国生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范，2000年版.北京:中国医药科技出版社，2000，389-398.
4 中国药品生物制品检定所.2002年药典“试验技术指导原则”.
(收稿日期:2004-03-26)
(编辑黄 杰), 百拇医药