五加双参片对 60 Co辐射小鼠骨髓细胞微核及胸腺DNA含量的影响
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【摘要】 目的 探讨五加双参片对小鼠骨髓细胞微核及胸腺DNA含量的影响。方法 将小鼠用 60 Co辐射后连续给药7d，灌胃，处死小鼠，取骨髓和胸腺，计数微核细胞数和测定胸腺DNA含量。结果 五加双参片(2.5g/kg，4.5g/kg)2个剂量组和骨髓细胞微核率均明显低于模型对照组(P<0.01);胸腺DNA的含量显著高于模型对照组(P<0.01)。结论 五加双参片对骨髓细胞有保护作用，对胸腺DNA的合成有明显的刺激作用。
关键词 五加双参片 微核细胞 胸腺DNA
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)09-0819-02
五加双参片为临床应用多年的纯中药制剂，由刺五加、当归、党参、玄参等组成。具有扶正固本、益气补血、健脾补肾、补脑安神、增强体力之功效。主要用于治疗各种原因引起的白细胞和血小板减少症;肿瘤放化疗的辅助治疗等。研究表明，本品可促进造血干细胞的增殖和向红系与粒系细胞分化。其中，五加双参片能使辐射损伤的脾脏组织结构明显恢复。对环磷酰胺(CY)与60 Co辐射引起的外周血液中的白细胞减少有明显升高作用 [1，2] 。本文用 60 Co辐射小鼠给予五加双参片，探讨对骨髓细胞微核率及胸腺DNA含量的影响。
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1 实验材料
1.1 药物 五加双参片，由西安中药厂生产，批号:030901。每片相当于生药材0.69g。实验 60 Co辐射源，辐射剂量4.0Gy，距离1.7m。Giemsa染色液。
1.2 动物 Balb/c小鼠，由西安医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号:医动字第08-004号。
2 实验方法和结果
2.1 五加双参片对小鼠骨髓细胞微核的影响 [3] 取雄性小鼠40只，体重18～20g，随机分成正常对照组、模型对照组(均给生理盐水10ml/kg)灌胃，五加双参片组(4.5g/kg、2.5g/kg，研碎制成混悬液)灌胃给药。除正常对照组外，其余组放入辐射盒内以4.0Gy 60 Co全身辐射一次。辐射后连续给药7d，最后一次给药品12h后处死小鼠，取双侧股骨，滴加1滴小牛血清，将骨髓挤出，清除骨渣，用推片在载玻片上研匀后推成一薄膜，晾干后在甲醇中固定10min，晾干后用Giemsa溶液染色5min，用常水冲洗干净，在油镜下选择细胞分散好、形态完整、染色良好的部位，按一定顺序进行计数。计数嗜多染红细胞(PCE为蓝灰色)及带微核的细胞(MNPCE)共1000个，计数微核细胞的‰率。结果见表1。
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表1 五加双参片对小鼠骨髓细胞微核率的影响 (X±s，n=10)
注:与模型组比较，P<0.01
2.2 五加双参片对小鼠胸腺DNA含量的影响以上小鼠处死后立即取出胸腺，准确称重，标号，分别置于盛有5ml无水乙醇的小瓶中，以备用。DNA提取液的制备 [3] ，将无水乙醇中保存胸腺置于玻璃匀浆器中，加入生理盐水2ml，以1000r/min的速度研磨1min，将匀浆转入试管中，分别用5ml乙醚提取2次，弃去乙醚液。待残渣自然干燥后，加入2%冷过氯酸5ml，置4℃冰箱中20min后取出，3000r/min离心，取上清液，为DNA提取液。DNA测定方法:DNA标准曲线的绘制:取试管8支，加入DNA标准液(50μg/ml)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml，加蒸馏水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4ml，每管加入二苯胺液4ml混匀，置60℃水浴中加热水20min，冷却后于600nm波长处比色后计算出工作曲线。工作曲线为:A=0.011+0.0087.C，r=0.9999。取以上DNA提取液5ml(控制DNA含量50μg/ml左右)，加蒸馏水1.5ml，二苯胺液4ml，混匀，置60℃水浴保温1h，冷却后于600nm波长处测定光密度，从标准曲线计算出DNAμg浓度，然后按公式计算出DNA量(g/100g胸腺)，结果见表2。DNA(%)=测定液中DNA量(μg)×提取液总量(ml)胸腺重(g)×10 6 ×测定所用提取液量(ml) ×100%
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表2 五加双参片对 60 Co辐射小鼠DNA含量的影响
注:与模型对照组比较，P<0.01。与正常对照组比较，P>0.05
3 讨论
细胞微核化是染色体损伤的一种表现形式，是由染色体断裂遗落下来的断片演化而来的。当染色体遭到 60 Co辐射损伤后，染色体断片到末期时被子细胞排除而形成次核，游离于细胞质中，成为一个或几个圆形结构，比正常细胞核小得多，故称为微核细胞。实验证明，五加双参片能降低细胞的微核率，与模型对照组比较，P<0.01。小鼠被 60 Co辐射后，体内分子发生电离、激发，产生能量转移，首先使体内一些重要的大分子物质，如DNA、蛋白质等受到破坏，从而产生组织细胞一系列生理功能的障碍。核辐射对生物大分子的破坏有两条途径，一是直接作用于生物大分子，把能量转移给大分子，使其发生变化，可使DNA分子上的长链发生断裂，可以使单链断裂，也可以使双链断裂。二是作用于细胞内水分子，产生一些活性基团(包括H.、OH.自由基等)，这些自由基再作用于生物大分子，使其发生变化，破坏DNA。五加双参片的多糖成分可促进DNA的合成，而且有增强体内SOD的活性，清除体内自由基，保护DNA不受损 害。与模型对照组比较胸腺DNA含量明显升高(P<0.01)。
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参考文献
1 林昱，李新田.五加双参片对环磷酰胺损害动物机体造血机能的保护作用.中华医药学杂志，2003，2(8):81.
2 李新田，林昱.五加双参片对辐射损伤动物机体造血功能的影响.中华医药杂志，2003，3(11):988.
3 陈奇.中药药理研究方法学，北京:人民卫生出版社，1993，135-821.
作者单位:721004陕西宝鸡解放军第三医院
(收稿日期:2004-02-28)
(编辑晓 勇), http://www.100md.com
关键词 五加双参片 微核细胞 胸腺DNA
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)09-0819-02
五加双参片为临床应用多年的纯中药制剂，由刺五加、当归、党参、玄参等组成。具有扶正固本、益气补血、健脾补肾、补脑安神、增强体力之功效。主要用于治疗各种原因引起的白细胞和血小板减少症;肿瘤放化疗的辅助治疗等。研究表明，本品可促进造血干细胞的增殖和向红系与粒系细胞分化。其中，五加双参片能使辐射损伤的脾脏组织结构明显恢复。对环磷酰胺(CY)与60 Co辐射引起的外周血液中的白细胞减少有明显升高作用 [1，2] 。本文用 60 Co辐射小鼠给予五加双参片，探讨对骨髓细胞微核率及胸腺DNA含量的影响。
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1 实验材料
1.1 药物 五加双参片，由西安中药厂生产，批号:030901。每片相当于生药材0.69g。实验 60 Co辐射源，辐射剂量4.0Gy，距离1.7m。Giemsa染色液。
1.2 动物 Balb/c小鼠，由西安医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号:医动字第08-004号。
2 实验方法和结果
2.1 五加双参片对小鼠骨髓细胞微核的影响 [3] 取雄性小鼠40只，体重18～20g，随机分成正常对照组、模型对照组(均给生理盐水10ml/kg)灌胃，五加双参片组(4.5g/kg、2.5g/kg，研碎制成混悬液)灌胃给药。除正常对照组外，其余组放入辐射盒内以4.0Gy 60 Co全身辐射一次。辐射后连续给药7d，最后一次给药品12h后处死小鼠，取双侧股骨，滴加1滴小牛血清，将骨髓挤出，清除骨渣，用推片在载玻片上研匀后推成一薄膜，晾干后在甲醇中固定10min，晾干后用Giemsa溶液染色5min，用常水冲洗干净，在油镜下选择细胞分散好、形态完整、染色良好的部位，按一定顺序进行计数。计数嗜多染红细胞(PCE为蓝灰色)及带微核的细胞(MNPCE)共1000个，计数微核细胞的‰率。结果见表1。
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表1 五加双参片对小鼠骨髓细胞微核率的影响 (X±s，n=10)
注:与模型组比较，P<0.01
2.2 五加双参片对小鼠胸腺DNA含量的影响以上小鼠处死后立即取出胸腺，准确称重，标号，分别置于盛有5ml无水乙醇的小瓶中，以备用。DNA提取液的制备 [3] ，将无水乙醇中保存胸腺置于玻璃匀浆器中，加入生理盐水2ml，以1000r/min的速度研磨1min，将匀浆转入试管中，分别用5ml乙醚提取2次，弃去乙醚液。待残渣自然干燥后，加入2%冷过氯酸5ml，置4℃冰箱中20min后取出，3000r/min离心，取上清液，为DNA提取液。DNA测定方法:DNA标准曲线的绘制:取试管8支，加入DNA标准液(50μg/ml)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml，加蒸馏水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4ml，每管加入二苯胺液4ml混匀，置60℃水浴中加热水20min，冷却后于600nm波长处比色后计算出工作曲线。工作曲线为:A=0.011+0.0087.C，r=0.9999。取以上DNA提取液5ml(控制DNA含量50μg/ml左右)，加蒸馏水1.5ml，二苯胺液4ml，混匀，置60℃水浴保温1h，冷却后于600nm波长处测定光密度，从标准曲线计算出DNAμg浓度，然后按公式计算出DNA量(g/100g胸腺)，结果见表2。DNA(%)=测定液中DNA量(μg)×提取液总量(ml)胸腺重(g)×10 6 ×测定所用提取液量(ml) ×100%
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表2 五加双参片对 60 Co辐射小鼠DNA含量的影响
注:与模型对照组比较，P<0.01。与正常对照组比较，P>0.05
3 讨论
细胞微核化是染色体损伤的一种表现形式，是由染色体断裂遗落下来的断片演化而来的。当染色体遭到 60 Co辐射损伤后，染色体断片到末期时被子细胞排除而形成次核，游离于细胞质中，成为一个或几个圆形结构，比正常细胞核小得多，故称为微核细胞。实验证明，五加双参片能降低细胞的微核率，与模型对照组比较，P<0.01。小鼠被 60 Co辐射后，体内分子发生电离、激发，产生能量转移，首先使体内一些重要的大分子物质，如DNA、蛋白质等受到破坏，从而产生组织细胞一系列生理功能的障碍。核辐射对生物大分子的破坏有两条途径，一是直接作用于生物大分子，把能量转移给大分子，使其发生变化，可使DNA分子上的长链发生断裂，可以使单链断裂，也可以使双链断裂。二是作用于细胞内水分子，产生一些活性基团(包括H.、OH.自由基等)，这些自由基再作用于生物大分子，使其发生变化，破坏DNA。五加双参片的多糖成分可促进DNA的合成，而且有增强体内SOD的活性，清除体内自由基，保护DNA不受损 害。与模型对照组比较胸腺DNA含量明显升高(P<0.01)。
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参考文献
1 林昱，李新田.五加双参片对环磷酰胺损害动物机体造血机能的保护作用.中华医药学杂志，2003，2(8):81.
2 李新田，林昱.五加双参片对辐射损伤动物机体造血功能的影响.中华医药杂志，2003，3(11):988.
3 陈奇.中药药理研究方法学，北京:人民卫生出版社，1993，135-821.
作者单位:721004陕西宝鸡解放军第三医院
(收稿日期:2004-02-28)
(编辑晓 勇), http://www.100md.com